1、16SrDNA 鑒定細(xì)菌的方法16S rDNA7DNA,設(shè)計(jì)/PCR瓊脂糖凝膠電泳分別膠回收目的片段目的片段測序。BLAST構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹試劑：1.1 培育基：通常選擇組分簡潔且細(xì)菌生長良好的培育基培育基組分過于簡單會影響 DNATE。三羥1.21MTris-HCl(pH7.4,7.6,8.0)1L：121.1gTris，加濃鹽酸約70ml, 60ml,42ml，高溫高鹽滅菌后，室溫保存。冷卻到室溫后調(diào)pH，每上升 pH0.03(Tris-HCl緩沖液0.05mol/L，25 50ml 0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷 Tris溶液與x ml 0.1mol/L 100ml 。Tris 緩沖液不

2、僅被廣泛用作核酸和蛋白質(zhì)的溶劑，Tris也是蛋白質(zhì)電泳緩沖液的主要成分之一)1.30.5MEDTApH8.01L：186.1gNa2EDTA2H2O，用NaOH調(diào)pH至8.0 約 20g , 高 溫 高 壓 滅 菌 ， 室 溫 保 存 。 ( 配 置 方 法3.NaOHpH8.020g NaOH。 留意：pH8.04.1L。 5. 適量分成小份后，高溫高壓滅菌。6. 室溫保存。 1.4 10TEBuffer(pH7.47.68.01L100mMTris-HCl，10 mM EDTA。1M Tris-HClpH7.4，7.6，8.0100ml，0.5M EDTApH8.020ml。高溫高壓滅菌，

3、室溫保存。1TE Buffer10TE Buffer101.510%SDSW/V：稱10gSDS，68加熱溶解，用濃鹽酸調(diào)pH至7.265溶解。配置時(shí)要戴口罩。6、5M NaCl292.2gNaCl，高溫高壓滅菌，4保存。7CTAB/NaCl10%CTAB，0.7MNaCl：溶解4.1gNaC，加10gCTA基三甲基溴化銨，加熱攪拌。用之前在65溶解。8、氯仿/異戊醇：按氯仿：異戊醇=24：1V/V的比例參加異戊醇。9/氯仿/25241/異戊醇=11的比例混合Tris-HCl平衡苯酚與氯仿/異戊醇。10、TAE1：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。濃50：

4、242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。11、6上樣緩沖液100ml：0.25%溴酚藍(lán)BPB，40%蔗糖，10mmol/LEDTA (pH8.0)0.2ml，4保存。12、0.60.3gTAE50 ml。13、EB：10 mg/ml。稱取 1g 溴化乙錠定容至 100ml。棕色瓶室溫避光保存。EB的工作濃度為 0.5ug/ml。當(dāng)配置 50ml 瓊脂糖凝膠時(shí)參加 EB 為 2.5ul因 EB是劇毒物質(zhì)，目前很多試驗(yàn)室用生物熒光染料替代，常用的有 Gelred14K：20mg/ml 溶于水，-2050ug/ml，反響緩沖液：0.01

5、mol/LTris(pH7.8),0.005mol/LEDTA,5%SDS37-56。無需預(yù)處理。15、RNase A：10mg/ml。25 mgRNase A 加 1MTrispH7.525ul，2.5M NaCl15ul，無菌水 2460 ul，于 100加熱 15 分鐘，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于-20RNARNARNA1.1DNA根本步驟：材料預(yù)備裂開細(xì)胞或胞膜內(nèi)容物釋放核算分別、純化沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)核酸溶解在適量緩沖液或水中基因組 DNA 提取所需儀器：高速冷凍離心機(jī)、恒溫冰箱、移液器、水平電泳槽、紫外/熒光觀測儀細(xì)菌基因組 DNA 提取方法綜述細(xì)菌基因組 DNA 的

6、提取方法主要有 5 種。不同的方法所選擇的試劑會有所不同。快速微量提取法1.5mlEp12022rpm1min, 丟去上清夜，收集菌體。參加 400ul 裂解液40mMTris-醋酸，20mM 醋酸鈉,1mMEDTA,1%SDS,pH7.837oC1hr。然后參加 200ul5mol/L 的氯化鈉溶液，混勻后于 13000rpm 離心 15min。取上清液，用苯酚抽提 21加兩倍體積無水乙醇，1/10 體積醋酸鉀(3M ,pH8.0)，-20 度保存 1 小時(shí)后，13000rpm 離心 15min70%乙醇洗 250ulTE4保存?zhèn)溆谩５鞍酌?SDS 法制備10mlGBMDelftia sp.

7、4000rpm 離心 10min 收集菌體， 用 Washing TE50mmol/LTris-HClpH8.0,10mmol/LEDTA pH8.02將菌體充分懸浮在 5ml 1TE0.5ml 5mg/L 的蛋白酶、0.5ml 10% SDS503h-5h。用等體積的 Tris 飽和苯酚抽提 2 次，苯酚/氯仿/異戊醇抽提一次，氯仿抽取上清液。乙醇沉淀 DNA。用自動移液器吸管頭將絮狀 DNAEp702后溶于適1TEddHO23細(xì)菌培育：細(xì)菌接種于 5ml 液體培育基中，37搖床300rpm培育過液。1ml1.5ml EP8000rpm5min，棄上清，沉淀重懸浮于 1ml TEpH8.0中

8、ddHO2菌體裂解：參加 6l 50mg/ml 的溶菌酶，37作用 2h。再加 2mol/LNaCl50l，10%SDS110l，20mg/mlK3l，503h37過夜。此時(shí)菌液應(yīng)為透亮粘稠液體。1.5ml EP(25241)，混勻，室溫放置 5-10min。12022rpm 離心 10min上清很粘稠，吸取時(shí)應(yīng)留神，最好槍頭尖應(yīng)剪去。0.6 倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置10min。1 2022rpm 離心 10。洗滌：沉淀用 75%的乙醇洗滌。抽涼50l ddHO2-5lPCR25 CTAB/NaCl接兩環(huán)菌0.75ml 甘油管菌液于 25ml LB 培育基中，37、200r/min 培育

9、24h。1.5ml1.5ml Eppendorf 離心管中，8000r/min5上清。1.5ml TE567 ul TE參加30l10%SDS和3ul20mg/ml的蛋白酶K100ug/ml 371h。參加 100l 5mol/L NaCl,充分混勻，再參加 80l CTAB/NaCl,混勻,6510參加等體積的氯仿/異戊醇(24:1)0.8ml,混勻,12022r/min 離心 5 分鐘,保存上清。上清中 參加等體積的酚 氯仿 異戊醇 (25241)(0.8ml),勻,12022r/min5加 入 0.6 倍的異丙醇0.48ml , 輕輕混合直到 DNA 沉淀下 來0.5h,12022r/m

10、in 離心 15 分鐘, 收集 DNA 沉淀, 用 75% 乙醇(1ml)12022r/min5DNA0.5h。50 ulDNA, 參加終濃度為 20g/mlRNaseA，4保存。0.6DNA , 每孔點(diǎn)樣 6l (4l 樣品+ 2lloading buffer) , 80 V1.516S rDNAPCR一般細(xì)菌鑒定選擇通用引物，最常用的通用引物為 27F/1492R。27F：5”-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3”1492R：5”-GGTTACCTTGTTACGACTT-3”試驗(yàn)原理PCR多聚酶鏈?zhǔn)椒错?polymerasechainreaction)簡稱技術(shù)，是年月中間內(nèi)在試管

11、中獲得數(shù)百萬個(gè)特異的目的序列的拷貝，技術(shù)雖然問學(xué)，考古學(xué)等方面得到了廣泛的應(yīng)用。技術(shù)實(shí)際上是模擬體內(nèi) DNA 合成過程，是在模板， 引物和種脫氧核苷酸存在的條件下依靠于聚合酶的酶促合反響，技術(shù)的特異性取決于引物和模板 結(jié)合的特異性。 反響分三步： 變性denaturation；退火annealing；延長extension圖。PCRPolymeraseChainReaction) 的原理16SrDNA16SrDAN 是編碼原核生物核糖體小亞基 rRNA16SrRNA的基因，是細(xì)菌分類學(xué)16SrRNA 的序列高度保守，可準(zhǔn)確指示細(xì)菌之間的親緣關(guān)系，16SrRNA 的大小為 1500bp 左右，所

12、含信息能反映生物界進(jìn)化關(guān)系，易操作，適用于各級分類單元。目前常用的是建立在 PCR的 16SrRNA 基因的直接測序法，便利快捷。較之 23SrDNA 等看家基因而異，它具有分子大小適中，突變率小等優(yōu)點(diǎn)，素有“細(xì)菌化石”之稱。其序列包含 10個(gè)可變區(qū)variableregion和與之一樣的11個(gè)恒定區(qū)constantn可變區(qū)因細(xì)菌而異，且變異程度與細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育親熱相關(guān)。PCRStep 1: DNAStep 2: 引物退火；Step 3: 引物延長PCRDNA引物反響緩沖液dNTPddH2O耐熱聚合酶PCR模板：反響中量在ngng反響特異性。dNTP100M200M。Mg2+：Mg2Taq2.

13、0mMTaq異性降低。2040 70之間；引物內(nèi)部不能有回該序列；引物端不能互補(bǔ)。Taq 酶：它是從嗜熱桿菌中提取的耐熱性聚合酶，在時(shí)分鐘還有活力。變性溫度：在之間使模板充分變性。復(fù)性溫度：左右，此溫度選擇是依據(jù)模板和引物配對結(jié)合強(qiáng)弱而定， 它是反響特異性的打算因素。延長溫度：左右，為Taq 酶最適反響溫度。材料設(shè)備及試劑設(shè)備：eppendorf 管、微量取液器、臺式高速離心機(jī)、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)PCR儀試劑：16SrDNA 引物、細(xì)菌基因組DNA、Taq Plus、dNTP、PCR、沖液、瓊脂糖、TAE沖液、Lamdar DNA/Hind操作步驟PCR依次混勻以下試劑5l 10PC

14、R1l 4dNTP2l 上游引物引物2l 下游引物引物1l 模板DNA0.5l Taq DNA38.5l H2O 5擴(kuò)增：94394161172130輪,進(jìn)展PCR。最終一輪循環(huán)完畢后, 于 725-10電泳檢測：1%瓊脂糖凝膠電泳，分析PCR用試劑盒做瓊脂糖凝膠電泳分別和膠回收目的片段TaKaRa DNAPCR純化后的目的片斷送到測序公司測序也可以直接將電泳檢測后的PCR 產(chǎn)物送到測序公司，讓公司對產(chǎn)物進(jìn)展純化和測序5 .BLAST16S rDNA 序列在NCBI 上進(jìn)展blast6.構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹將選擇的序列與測序序列用DNAStar 軟件的MegAlign 構(gòu)建菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹。16SrD

15、NAPCR 產(chǎn)物做T-A隆。T-APCR連接 轉(zhuǎn)化 鑒定T-APCRAPCRAA之前最好搞清楚使用的酶到底是否加A3”5”外切酶活性的高保真酶就不會產(chǎn)生A產(chǎn)物末端加A0.7-1unitTapbuffer期中的dATP728-10min。馬上進(jìn)展純化，沉淀、跑膠、或用純化試劑盒。這一點(diǎn)相當(dāng)重要，否則高保真聚合酶會ATTAPCRT常用的T 載體有Invitrogen 的TPromege 的pGEM-TTaKaRa 的pMD18-T。將載體與目的片斷的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)展液體搖床培育，涂平板進(jìn)展藍(lán)白斑選擇。對選擇的菌落提質(zhì)粒，電泳檢測大小，對正確的陽性克隆的質(zhì)粒進(jìn)展酶切目的片斷回收

16、。目前對于T-A 克隆技可以通過T-A16S rDNA 鑒定是應(yīng)留意的問題和常見問題細(xì)胞裂解留意事項(xiàng)材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致DNA 量少，純度低選擇適當(dāng)?shù)牧呀馓幚矸绞礁邷販卦∈叶〞r(shí)輕柔震蕩2 核酸分別純化承受吸附材料吸附的方式分別DNA 時(shí)，應(yīng)供給相應(yīng)的緩沖體系。承受有機(jī)酚/氯仿抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔。離心分別兩相時(shí)，應(yīng)保證肯定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間。針對不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法。 3 核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀的時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分。1/10 體積的NaAc(PH5.2,3M)，有利于充分沉淀。沉淀后應(yīng)用 70%的乙醇洗滌，以除去鹽離子

17、等。晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)。假設(shè)長期儲存建議用TETE 中的EDTA 能螯合Mg2Mn2+離子，抑制DNase，TEPH8.0DNADNAPCRDNADNA，去除雜質(zhì)。DNA 在溶解前有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反響：應(yīng)重沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)。DNA70%乙醇的洗滌次數(shù)2-3。DNA試驗(yàn)材料不佳或量少：應(yīng)盡量選擇穎的材料。破壁或裂解不充分：G延長沉淀不完全：低溫沉淀，延長沉淀時(shí)間；加關(guān)心物促進(jìn)沉淀。洗滌DNA 時(shí)喪失：洗滌時(shí)最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒。DNA未很好的抑制內(nèi)源核酸酶的活性：可增加裂解液中螯合劑的含量。提取過程操作過于猛烈，DNA 被機(jī)械打斷：細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔。外源核酸酶污染：全部試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌。反復(fù)凍融：將DNA 分裝，保存于緩沖液中，避開反復(fù)凍融。7PCRDNA純度：蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)會抑制PCR 反響完整性： 模板降解會導(dǎo)致PCR濃度： 加量過多導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加引物特異性：長度適當(dāng)、避開二級構(gòu)造和二聚體完整性：避開反復(fù)凍融濃度：應(yīng)適當(dāng),過高導(dǎo)致非特異性增加,過低則擴(kuò)增產(chǎn)物太少BufferpH穩(wěn)定劑,增加劑Mg 2濃度過高非特異性嚴(yán)峻過低無擴(kuò)增產(chǎn)物dNTP Mixture濃度適當(dāng)避開反復(fù)凍融ddH2OpH避開污染PCR無擴(kuò)增產(chǎn)物現(xiàn)象：正比照有條帶，而樣品