1、線粒體膜電位檢測試劑盒四-10法)簡介：JC-100是一種檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential的理想熒光 探針。在線粒體膜電位較高時，JC-10聚集在線粒體的基質(zhì)(matrix)中形成聚合物，產(chǎn)生紅 色熒光；JC-10單體的最大激發(fā)波長為515nm，最大發(fā)射波長為529nmo JC-10聚合物 (J-aggregates)的最大激發(fā)波長為585nm，最大發(fā)射波長為590nm，實際觀察時使用常 規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的裝置即可。Leagene 線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-10(Mitochondrial membrane potential a

2、ssay kit with JC-10)是 一種以JC-10為熒光探針，快速靈敏地檢測細(xì)胞、組織或純化的線 粒體膜電位變化的試劑盒，可以用于早期的細(xì)胞凋亡檢測，CCCP作為誘導(dǎo)線粒體膜電位下 降的陽性對照。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。組成：編號名稱一一CT0046100TStorage試劑(A): JC-10 Stain(200 x)5x100pl-20C避光試劑(B): JC-10 Buffer(5x)80ml4C試劑(C): CCCP(10mM)20pl-20C試劑(D): ddH2O90mlRT使用說明書1份操作步驟(僅供參考):1、配制JC-10染色工作液：取適

3、量JC-10 Stain (200 x)，劇烈Vortex充分溶解并混勻JC-10 Stain。然后再加入 2ml JC-10 Buffer(5x)，混勻后即為JC-10染色工作液。6孔板每孔所需JC-10染色工 作液的量為1ml，其它培養(yǎng)器皿的JC-10染色工作液的用量以此類推；對于細(xì)胞懸液 每0.5 -1.0 x106細(xì)胞需0.5ml JC-10染色工作液。2、設(shè)置陽性對照：推薦CCCP(10mM胺照1:1000的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，稀釋至10pM，處理細(xì) 胞20min。隨后按照下述方法裝載JC-10，進(jìn)行線粒體膜電位的檢測。對于大多數(shù)細(xì) 胞，通常10pM CCCP處理后線粒體的膜電位

4、會完全喪失，JC-10染色后觀察應(yīng)呈綠色 熒光；而正常的細(xì)胞經(jīng)JC-10染色后應(yīng)顯示紅色熒光。對于特定的細(xì)胞，CCCP的作用 濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資料確定。3、對于懸浮細(xì)胞：取1-6x105細(xì)胞，重懸于0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。加入JC-10染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37孵育20min。在孵育期間，按照每1ml JC-10 Buffer(5x)加入4ml蒸餾水的比例，配制適量的 JC-10 Buffer(1x)，并放置于冰浴。37C孵育結(jié)束后，600g離心，沉淀細(xì)胞。棄上清，注意盡量不要吸除細(xì)胞。用 JC-10 Buffer(1

5、x)洗滌 2 次：加入 1ml JC-10 Buffer(1x)重懸細(xì)胞，離心 3- 4min,沉淀細(xì)胞，棄上清。再加入1ml JC-10 Buffer(1x)重懸細(xì)胞，離心34min, 沉淀細(xì)胞，棄上清。再用少量JC-10 Buffer(1x)重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以 用熒光分光光度計檢測或流式細(xì)胞儀分析。4、對于貼壁細(xì)胞：注意：對于貼壁細(xì)胞，如果希望采用熒光分光光度計或流式細(xì)胞儀檢測，應(yīng)先收集細(xì)胞， 重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測方法。吸除6孔板培養(yǎng)液，根據(jù)具體實驗如有必要可以用PBS或其它適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞一 次，加入1ml細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。加

6、入1ml JC-10染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37C孵育20min。在孵育期間，按照每1ml JC-10 Buffer(5x)加入4ml蒸餾水的比例，配制適量的 JC-10 Buffer(1x)，并放置于冰浴。37C孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-10 Buffer(1x)洗滌2次。加入2ml細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。5、對于純化的線粒體：把配制好的JC-10染色工作液再用JC-10 Buffer(1x)稀釋5倍。0.9ml JC-10染色工作液中加入0.1m l總蛋白量為純化的線粒體。用熒光分光光度計或熒光酶標(biāo)儀檢測：混勻后直接用熒光分

7、光光度計進(jìn)行時間掃描， 激發(fā)波長為485nm,發(fā)射波長為590nm。如果使用熒光酶標(biāo)儀，激發(fā)波長不能設(shè)置為 485nm時，可以在475 - 520nm范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長。另外，也可以參考下面步驟6 中的波長設(shè)置進(jìn)行熒光檢測。用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟6。6、熒光觀測和結(jié)果分析：檢測JC-10單體時可以把激發(fā)光設(shè)置為490nm，發(fā)射光設(shè)置為530nm ;檢測JC-10 聚合物時，可以把激發(fā)光設(shè)置為525nm ,發(fā)射光設(shè)置為590nm。注意：此處測定熒光 時不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長。如使用熒光顯微鏡觀 察，檢測JC-10單體時可以參考觀察其它綠

8、色熒光時的設(shè)置，如觀察GFP或FITC時的 設(shè)置；檢測JC-10聚合物時可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙啶或。尸3時的設(shè)置。出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色 熒光說明線粒體膜電位比較正常，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。注意*項：1、JC-10 Stain(200 x)應(yīng)完全溶解混勻后使用，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。必須先把JC-10用 ddH2O充分溶解混勻后，才可加入JC-10 Buffer(lx)。不可先配制JC-10 Buffer(lx)再加 入JC-10 Stain(200 x)，否則導(dǎo)致JC-10很難充分溶解，嚴(yán)重影響后續(xù)的檢測。2、JC-10探針裝載完并洗滌后盡量在30min內(nèi)完成后續(xù)檢測，在檢測前需冰浴保存。3、勿把JC-10 Buffer(5x)全部配制成1x,因為操作過程中需直接使用JC-10 Buffer(5x)。4、如JC-10 Buffer(5x)中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，為促進(jìn)溶解可以在37加 熱。5、CCCP為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有一定毒性，請注意小心防護(hù)。有效期：12個月有效。相關(guān)：編號名稱CS0001ACK 紅細(xì)