1、杜仲含藥血清誘導骨髓間充質干細胞定向分化蛋白質組學研究【摘要】目的研究杜仲含藥血清誘導骨髓間充質干細胞(esenhyalsteells,Ss)向成骨細胞定向分化過程的蛋白表達差異，分析杜仲誘導Ss向成骨細胞分化的可能調控機制。方法對杜仲含藥血清干預前、干預后第2天、第7天，第14天的細胞提取總蛋白，通過雙向電泳別離、PDQuest-7.3.0膠圖分析軟件進展分析找出差異蛋白，并進展質譜分析、數(shù)據(jù)庫查詢建立功能蛋白質組。結果雙向電泳別離得到641個蛋白點，選取其中75個點進展質譜分析，經數(shù)據(jù)庫查詢得到6個功能蛋白。結論實驗認為補腎中藥杜仲可能通過上調波形蛋白、核纖層蛋白A的表達促進細胞分化，下調

2、鈣網(wǎng)織蛋白表達，釋放細胞內鈣，參與鈣結節(jié)的形成，與體內骨礦化過程有關。過氧化物歧化酶、膜聯(lián)蛋白A6與細胞的活力有關，調節(jié)著細胞的分裂增殖與分化，但是否與定向成骨細胞分化有著親密關系尚有待進一步研究。【關鍵詞】杜仲骨髓間充質干細胞蛋白質組學雙向電泳Abstrat:bjetiveTstudytheprtEinhangeinthepressfSsdifferentiatintsteblasguidingbybldseruntainingDuzhngrtexEuiae,anditspssibleregulatinehaniss.ethdsTtalprtEInfellsinterferedbybldse

3、runtainingDuzhngrtexEuiaefr0day,2days,7days,14days,asextrated,runutedbyt-diensinaleletrphresisandsearhedfrdifferentprteinsptbyPDQuest-7.3.0sftarefranalyzinggelpiture.Funtinalprteeasestablishedbyasshratgraphianalysisanddatabasequerying.Results641prteinsptserebtained,hse75sptstreeiveasshratgraphianaly

4、sis,and6funtinalprteinerebtainedbydatabasequerying.nlusinhinesedrugDuzhngrtexEuiaeayup-regulateexpressfvientinandlainAtprteelldifferentiatin,dn-regulateexpressfalretiulintreleaseintraellulara2+hihisrelatedta-ndusandbneineralizatininbdies.SDandannexinA6arenernedithrpusularvigr,regulaterpusulardivisin

5、grthanddifferentiatin,buthethertheyhaveintiaterelatinithdiretinaldifferentiatinfrSststeblastisunknn,aitingfrfurtherresearh.Keyrds:DuzhngrtexEuiae；Ss；Prtee；T-diensinaleletrphresis骨髓間充質干細胞Ss是一種多功能干細胞，在不同條件下可向成骨細胞、軟骨細胞、心肌細胞等分化。中醫(yī)學認為，腎藏精，主骨，生髓，經前期研究發(fā)現(xiàn)，杜仲含藥血清可以誘導Ss向成骨細胞分化并促進細胞增殖，但對于Ss向成骨細胞分化這一復雜過程的機制缺乏相關

6、研究。蛋白質組學研究是后基因組學時代又一重要研究工具，已經廣泛應用到生命科學各個領域。本文建立補腎中藥杜仲含藥血清干預Ss體外定向分化為成骨細胞過程，采用蛋白組學技術分析Ss分化過程中不同時間點蛋白表達的變化情況，從蛋白質分子程度上解釋杜仲干預Ss分化的可能機理。1器材1.1動物SPFSD大鼠2只，體質量150200g，雌雄不限，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。1.2試劑L-DE培養(yǎng)基、南美洲胎牛血清FBS、海克隆，杜仲產地云南，0.25%胰酶GIB公司，礦物油、標準蛋白、HAPS、DTT、Indaetaidesiga，尿素BBI，硫脲天津市化學試劑一廠，PH3-10兩性電解質Bi-Rad，

7、考馬斯亮藍(G2250、R2250)、低熔點瓊脂糖、苯甲基磺酰氟(PSF)、三羥甲基胺基甲烷(Tris)、N,N-甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉(SDS)、溴酚藍、甘油、無水碳酸鈉、硫代硫酸鈉、三氟乙酸(TFA)、無水甲醇、無水乙醇、冰醋酸為國產分析純，購于廣州威佳公司。1.3器材25，75，1752培養(yǎng)瓶ning，酶標儀Ther，2培養(yǎng)箱(Heraeus)，注射器針頭濾器，0.22濾膜ILLIpre，SIGA-3K15離心機siga，雙向電泳儀器：ultiphrIIAersha、PrteanIIxiellBi-Rad，IPG固相膠條17，PH：3-10，Bi-Rad，PDQuest凝

8、膠分析軟件(7.3.0版本)(美國Bi-Rad公司)、Perlk2100XL凝膠圖像掃描儀(美國UAX公司)、質譜儀器4700prteisAnalyzerABI公司，超低溫冰箱SANY。2方法2.1杜仲含藥血清的制備取杜仲藥材粗粉150g，加70%乙醇10倍量，加熱回流兩次，1h/次，過濾，合并濾液，濾液減壓濃縮至300l，室溫冷卻，4冰箱保存?zhèn)溆?。將中藥藥液稀釋?.3g生藥/l灌胃，1l/次，2次/d，連續(xù)給藥4d，最后一次給藥后1h經腹主動脈采血，室溫靜置3h后置4冰箱過夜，2500r/in離心20in，搜集上清液，針頭濾器過濾除菌，置-20保存?zhèn)溆谩?.2Ss別離、純化、擴增、誘導SD

9、大鼠以10%水合氯醛0.7l經腹腔麻醉后，75%酒精浸泡頸部以下軀體5in，無菌條件下取出雙下肢股骨和脛骨，修潔軟組織后，咬骨鉗修剪骨端，暴露髓腔，10l注射器汲取含10%胎牛血清的L-DE培養(yǎng)基反復沖洗髓腔，至到骨質外觀微微透亮。252培養(yǎng)瓶搜集骨髓沖洗液，放37、5%2孵箱培養(yǎng)，每3天換液1次。當原代長滿瓶底90%以上時0.25%胰酶消化后11傳代至752培養(yǎng)瓶，當細胞長滿752培養(yǎng)瓶時，以0.25%胰酶消化后12傳代至長滿4瓶752培養(yǎng)瓶，再以11傳代至1752培養(yǎng)瓶，當細胞長滿瓶底80%時其中3瓶參加含10%杜仲血清的L-DE，余下的一瓶細胞立即0.25%胰酶消化后搜集細胞，并分別于誘

10、導后第2天、第7天、第14天同法搜集細胞，置-80保存?zhèn)溆谩?.3細胞總蛋白的提取及定量細胞解凍后用10l/LTris/250l/LSrirsepH7.0洗滌3次，參加2l裂解液8l/L尿素，4%/VHAPS，65l/LDTT，2%PHaralyte-10混勻，加50g/lRNase及200g/lDnase，在4放置15in，再14000r/in，4離心30in，上清bradfrd法測濃度，-80保存。2.4第1向等電聚焦從冰箱中取出IPG預制膠條，用溶脹緩沖液8l/L尿素，2l/L硫脲，0.5HAPS,0.52%兩性電解質，0.02溴酚藍，1DTT將膠條泡脹12h。將膠條取出放入聚焦槽內，參

11、加礦物油至沒過上樣杯，上樣量為0.6g，并用溶脹buffer稀釋至190l。對好正、負極，蓋上蓋子。設置等電聚焦程序表1。聚焦完畢的膠條，立即進展平衡，第2向SDS電泳。表1等電聚焦程序略2.5膠條平衡將膠條放入平衡緩沖液I50l/LTris-Hl6.8，6l/L尿素，30甘油，2%SDS，2DTT，0.02溴酚藍程度振蕩15in，再將膠條轉入平衡緩沖液II50l/LTris-Hl6.8，6l/L尿素，30甘油，2%SDS，2.5IAA，0.02溴酚藍程度振蕩15in。2.6第2向聚丙烯酰胺凝膠SDS電泳膠條平衡之前配制丙烯酰胺凝膠4塊，別離膠濃度為12%配制如表2。表2聚丙烯酰胺凝膠的配置略

12、第2次平衡完畢后，將IPG膠條從樣品水化盤中移出，放到已配好的SDS凝膠上端，并將arker分子量為97，66，45，30，20.1和14.4kDa放到凝膠的一端，再用0.5的瓊脂糖將膠條和arker封嚴，切忌不能產生氣泡。并將膠板固定于電泳槽內。向電泳槽參加電泳緩沖液后，接通電源，100V恒壓電泳至溴酚藍條帶全部進入別離膠后調電壓至120150V恒壓電泳56h，待溴酚藍指示劑到達底部邊緣時即可停頓電泳。電泳完畢后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，進展染色。2.7考馬斯亮藍染色將凝膠放入裝有染色液10硫酸銨，10磷酸，0.12G250，20甲醇的程度盤內，并將程度盤置程度搖床上程度振蕩過夜。搜集染

13、色液，將凝膠浸于脫色液3冰醋酸溶液中，程度搖床振蕩。最后換成Q再洗滌30in。2.8圖像分析及蛋白鑒定圖像分析及蛋白鑒定：染色后的凝膠用水洗凈后，采用掃描儀進展掃描成像，掃描分辨率設為300dpi?？既緢D像分析采用PDQuest軟件(Bi-Rad)進展分析；分析過程包括點檢測和編輯、建立和編輯比擬組、比擬組的數(shù)據(jù)分析及點的計數(shù)和解釋等，詳細方法參照軟件操作說明進展。通過對分析膠的比照分析，可以找出比擬組中表達呈現(xiàn)差異的蛋白點，這些差異蛋白點在考染凝膠中的對應蛋白斑點將作為質譜分析對象。對目的蛋白點進展胰蛋白酶酶切，提取多肽混合物。取0.3l肽段提取液，與等體積-氰基-4-羥基肉桂酸飽和的0.1

14、TFA/50乙腈溶液混合后點于質譜儀的96孔不銹鋼靶上。按照說明進展操作。3結果經bradfrd法測定各組總蛋白濃度分別為0d3.24g/l，2d4.10g/l，7d4.7g/l，14d7.27g/l。說明杜仲含藥血清可以促進細胞增殖。整個圖譜來分析，點與點之間區(qū)分比擬明顯，可以對其進展蛋白質表達的差異分析。采用PDQuest-7.3.0膠圖分析軟件進展軟件分析，找出差異蛋白點共641個，選取其中75個點行質譜分析并進展數(shù)據(jù)庫查詢。其中6個點具有積極意義。見圖14。PDQuest-7.3.0膠圖分析軟件分析結果，各蛋白點表達量見表3。表3各蛋白點表達量略轉貼于論文聯(lián)盟.ll.對差異點進展ALD

15、I-TF分析，得到各自的肽質量圖譜見圖510。從圖譜中可見，各肽質量指紋圖譜信號較強，基線平穩(wěn)，合適進一步數(shù)據(jù)庫檢索鑒定。根據(jù)得到各肽質量指紋圖譜數(shù)據(jù)，及分子量范圍和其他相關數(shù)據(jù)，通過NBInr網(wǎng)站查詢與之相匹配的蛋白，搜素結果見表4。表4各點蛋白信息略F18為基質細胞衍生因子SDF-1，本研究中發(fā)現(xiàn)隨著杜仲含藥血清對Ss的誘導，SDF-1表達呈下調趨勢，第14天時不能檢測出，在杜仲含藥血清誘導Ss向成骨細胞誘導實驗中發(fā)現(xiàn)，該時期Ss已分化為成骨細胞，故不在表達SDF-1。說明基質細胞衍生因子表達于Ss，而不表達于成骨細胞中，可作為檢測Ss分化程度的標志。骨髓間充質干細胞高度表達SDF-1可能

16、是將骨髓間充質干細胞作為造血干細胞的基質細胞進展培養(yǎng)獲得成功1的機制。骨髓造血干細胞與骨髓間充質干細胞均屬于骨髓來源干細胞，骨髓間充質干細胞表達的SDF-1是第一個被發(fā)現(xiàn)能趨化D+34細胞的細胞因子，體內外實驗發(fā)現(xiàn)，D+34造血干細胞可根據(jù)SDF-1的濃度遷移。有些報道SDF-1也具有刺激活性，增加造血干細胞的增殖分化2，但是也有研究認為SDF-1僅具有趨化活性，SDF-1能刺激VEGF在造血中發(fā)揮作用3。目前在骨組織工程的種子細胞主要骨髓間充質干細胞和成骨細胞，而組織工程需要足夠的細胞，由實驗可以看出，以骨髓間充質干細胞作為種子細胞移植，可以比成骨細胞更多的聚集造血干細胞，造血干細胞具有分化

17、為血細胞、血管內皮細胞的功能4,5，能改善部分缺血狀態(tài)，更能到達組織工程的要求，如將兩者作為共育體移植將對骨缺血壞死的治療提供新的思路。G21是超氧化物歧化酶SD，屬于金屬酶，是一種主要的抗氧化酶，能去除超氧化物自由基，在防御氧的毒性、抑制老年疾病以及預防衰老等方面起著重要作用。實驗中發(fā)現(xiàn)，隨著Ss向成骨細胞分化，該酶的表達逐漸減少，細胞出現(xiàn)衰老趨勢或凋亡。Ss作為原始細胞，具有很強的增殖才能和在條件誘導作用下分化的才能，高度表達SD；而體細胞成骨細胞無再分化才能，隨著Ss向體細胞的分化，細胞活力呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，與SD表達下調有著親密關系。E17為鈣網(wǎng)織蛋白RT，是1974年命名的骨骼肌

18、肌質網(wǎng)膜上的鈣結合蛋白。結合鈣的才能極強，參與鈣的貯藏和信號轉導；細胞黏附；基因表達的調控等。當細胞內鈣網(wǎng)織蛋白含量下降時，鈣從細胞中釋放出，當細胞RT過表達時，內質網(wǎng)a2+儲量增多，a2+升高，SERA拮抗劑thapsigargin誘導內質網(wǎng)a2+釋放增多6；此時細胞對凋亡刺激的敏感性增強。實驗中發(fā)現(xiàn)，隨著Ss向成骨細胞分化，鈣網(wǎng)織蛋白表達量呈現(xiàn)出逐漸下調的趨勢，當成骨誘導20天后，鈣結節(jié)茜素紅染色陽性，推測該蛋白與鈣結節(jié)的形成有親密關系，在體內參與骨礦化過程。E4為波形蛋白(vientin)，是間充質來源細胞的中間纖維蛋白，附在細胞核、內質網(wǎng)及線粒體的旁邊或末端，因此相信波形蛋白在支撐及錨

19、固原生質內的細胞器有著重要的角色。它亦能維持細胞的形狀、細胞質的完好性及穩(wěn)定細胞骨架內的互相作用。在試驗誘導初期，骨髓間充質干細胞呈增生性變化，該蛋白表達量逐漸升高，后期向成骨細胞分化后，細胞增殖減慢，該表達量呈減低趨勢。F6為核纖層蛋白AlainA，與波形蛋白同屬于中間纖維蛋白的一種，是所有真核細胞核構造所必需的構造蛋白7，主要參與構成核的功能8，在核形成過程中起著重要作用9。兩者與細胞分化有親密關系。在分化實驗中，Ss誘導前沒有檢測出該蛋白，說明此時Ss尚處于增殖狀態(tài)；當向Ss的培養(yǎng)液中參加杜仲含藥血清后2d后細胞開場表達該蛋白，說明Ss開場分化。在杜仲含藥血清干預過程中，呈現(xiàn)出逐漸上調的

20、趨勢，至第7天達頂峰，14d后逐漸下降。結果說明杜仲含藥血清可以促進Ss的分化過程。F3為膜聯(lián)蛋白A6annexinA6，膜聯(lián)蛋白annexins是一類構造相關鈣依賴的磷脂結合蛋白超家族，約占細胞總蛋白的2。在細胞中參與膜轉運及膜外表一系列依賴于鈣調蛋白的活動，包括囊泡運輸、胞吐作用中的膜交融、信號傳導和鈣離子通道的形成、調控炎癥反響、細胞分化和細胞骨架蛋白間的互相作用等。每種annexin蛋白在機體的不同組織和部位執(zhí)行著不同的生物學功能，但是，每種annexin確切的生理功能尚不非常清楚。認為annexinI參與了膜的聚集、參與調控APK/ERK與PLA2介導的信號傳導、及在腫瘤細胞的增殖與

21、分化、甚至細胞凋亡等生理過程中起重要作用。從本實驗中發(fā)現(xiàn)，隨著Ss向成骨細胞分化，annexinA6的表達逐步升高，可以推斷該蛋白可能具有促進細胞分化、抑制細胞增殖的作用。4結論Ss向成骨細胞分化是一個復雜的過程，其機制還不明確，實驗認為杜仲可能通過上調波形蛋白、核纖層蛋白A的表達促進細胞分化，下調鈣網(wǎng)織蛋白表達，釋放細胞內鈣，參與鈣結節(jié)的形成，與體內骨礦化過程有關。過氧化物歧化酶、與膜聯(lián)蛋白A6與細胞的活力有關，調節(jié)著細胞的分裂增殖與分化，但是否與定向成骨細胞分化有著親密關系尚有待進一步研究。骨髓間充質干細胞在早期高度表達的基質細胞衍生因子SDF-1是第一個被發(fā)現(xiàn)能趨化D34+細胞的細胞因子

22、，體內外實驗發(fā)現(xiàn)，D34+造血干細胞可根據(jù)SDF-1的濃度遷移。有些報道SDF-1也具有刺激活性，增加造血干細胞的增殖分化，但是也有研究認為SDF-1僅具有趨化活性，SDF-1能刺激VEGF在造血中發(fā)揮作用。造血干細胞表達D34+，在D34+參與下，HS持續(xù)表達G蛋白耦聯(lián)受體(GprtEinupledereeptrs,GPRs),XR4，ysLT1，S1P，S1P1等,促使細胞發(fā)生趨化、粘附從而引起HS的遷移和聚集；證實骨髓間充質干細胞與造血干細胞有可能在同一培養(yǎng)條件下培養(yǎng)及共同移植?！緟⒖嘉墨I】1YinH,angX,KiSS,etal.Transplantatinfintatratgnadsusingvasularanastsis:effetsfrypreservatin,ishaeiaandgentypeJ.HuReprd,2022,18(6):1