1、實(shí)驗(yàn)二、 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR 1、小鼠肝臟組織總RNA的提取 2、RNA的變性瓊脂糖凝膠電泳 3、以總RNA為模板的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 4、PCR5、PCR產(chǎn)物的電泳及回收實(shí)驗(yàn)內(nèi)容RNA提取的注意事項(xiàng) RNA酶：a. 廣泛存在灰塵、人體唾液、實(shí)驗(yàn)器材表面。 b. 生物活性非常穩(wěn)定耐熱、耐酸、耐堿。 1、 盡量避免外源性RNase 污染 A. 操作環(huán)境空氣潔凈（帶手套、口罩） B. 用新開封的化學(xué)試劑（試劑應(yīng)該專用） C. 一次性塑料器材最好是新開封， (DEPC水處理后）高壓滅菌。 D. 玻璃器材、水都應(yīng)該經(jīng)過去RNase 處理。 對玻璃器材還應(yīng)該進(jìn)行高溫烘烤。 2、抑制內(nèi)源性RNase 活性

2、： RNase 抑制劑。 RNA分離的關(guān)鍵因素：避免RNA酶的污染。 1、mRNA: 1-5% 5鳥嘌呤7位甲基化CH3修飾。 1）免受核酸酶破壞， 2）起始、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。 3poly(A)尾巴結(jié)構(gòu) 20-200個A，翻譯所必需。 起始密碼：AUG 終止密碼：UAA, UAG, UGA。 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亞基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亞基40S: 18S=1874nt真核細(xì)胞的總RNA1) 領(lǐng)?。嚎谡帧⒚弊?、1mL Trizol。2) 實(shí)驗(yàn)教師操作: 取新鮮小鼠肝臟組織，組織塊不宜過大, 放在玻片

3、上立即研磨,研磨要徹底。3) 將研磨后的組織(小米粒大小)轉(zhuǎn)移至1mL Trizol 試劑中，蓋緊蓋，上下顛倒混合2 min以上。使組織細(xì)胞充分裂解。肉眼觀察可見液體變成均勻渾濁狀。 4) 室溫孵育10 min。一、小鼠肝臟組織RNA提取的實(shí)驗(yàn)操作1、異硫氰酸胍法： GuSCN 是一種強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性劑，能夠裂解細(xì)胞的同時，還能有效地抑制內(nèi)源性 Rnase的活性，通過有機(jī)溶劑的分步抽提，可獲得純度較高的細(xì)胞總RNA。 特點(diǎn)：需低溫操作，但價格經(jīng)濟(jì)。2、Trizol 試劑 特點(diǎn)：商品化，簡單、快速、提取量大、純度高 在室溫下可以提取細(xì)胞總RNA。3、mRNA提取試劑盒 真核細(xì)胞mRNA的3末端有p

4、loy(A)尾，利用寡聚 dT纖維素結(jié)合mRNA，將其從細(xì)胞總RNA中分離出來。RNA提取的幾種方法5) 加入200 l氯仿， 震蕩混勻20-30s， 室溫放置5 min 此期間液體開始分層， 不要輕易攪動液體) 10000rpm 離心 5min。7) 將清澈透明的上層水相轉(zhuǎn)移至另一離心管中。RNA (清澈透明)DNAProtein注意！一、小鼠肝臟組織RNA提取的實(shí)驗(yàn)操作8) 加0.5ml異丙醇，上下顛倒混勻，室溫10 min。 10, 000rpm，4C，離心10 min棄上清。9) 加1ml 75%乙醇洗滌管壁。 10) 7500rpm，4C 離心 1 min，棄上清。 再離心幾秒鐘，用

5、加樣器將管壁液體完全移凈。注意：75%乙醇的作用 不起沉淀作用，只是為了清洗管壁。加入方法 貼管壁在沉淀的對側(cè)緩慢加入，不要攪動沉淀。沉淀RNA12）溶解RNA：吸取13.5l冰冷DEPC水，吹打溶解RNA。 （溶解的RNA置冰上保存）注意： RNA沉淀的溶解一定要耐心充分，一定要用加樣器反復(fù)多次吹打方可。但由于溶液體積非常小，要避免出現(xiàn)氣泡影響RNA的溶解。避免氣泡的方法：a. 用加樣器的第一擋b. 每次吹打都不要打出氣體判斷溶解程度：吹打時液體流動不拐彎用TriZol試劑提取總RNA時，全程均在室溫進(jìn)行。當(dāng)RNA沉淀用水溶解后，應(yīng)該注意在冰上操作，操作要迅速。13)吸出9 l RNA ,放

6、到冰上備用（將用于RT-PCR）. 剩余4.5l RNA,放到冰上備用 (將用于電泳).AAAAAA(n)mRNAAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-568-70oC, annealingAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-537-42oC, RTase mRNAmRNAcDNA10min1-2h RT二、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄酶reverse transcriptase： 存在于逆轉(zhuǎn)錄病毒體內(nèi)。 常見有哺乳動物型37oC，禽類型42oC 。 以mRNA為模板的DNA聚合酶，形成與RNA堿基相互補(bǔ)DNA鏈，后者稱為互補(bǔ)DNAcDNA。按照下列方法進(jìn)行RT反應(yīng)：總RNA 9 lOlig

7、o dT (0.05g/ml) 1 l (終：2.5 ng/ml) 防止RNA形成二級結(jié)構(gòu)終體積： 10 l輕彈管底混合，65水浴10min，立即冰浴2min。第一步：打開RNA鏈之間的二級結(jié)構(gòu)，使Oligo dT 特異性地結(jié)合到 PolyA 尾。 總結(jié)：RT 關(guān)鍵點(diǎn)：RNA是否充分溶解根據(jù)RNA的量確定逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的體積：通常利用1ml Trizol試劑提取出來的總RNA適合于20l體積的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。引物的量是否合適：RT引物的用量非常少，因?yàn)槟０辶渴枪潭ǖ?，而且只進(jìn)行一次反應(yīng)。高溫退火避免Oligo dT錨錠點(diǎn)錯誤，同時，打開RNA鏈之間的二級結(jié)構(gòu)，利于Oligo dT 的結(jié)合。 與Oligo dT完成退火后，一定迅速放在冰上，防止RNA形成二級結(jié)構(gòu)，阻礙RT的延伸?；具^程同DNA電泳一樣，但為防止RNA酶對RNA的降解，必須用對RNA酶有抑制作用的DEPC水配制所有溶液，所有與RNA接觸的儀器和裝置都要嚴(yán)格處理以盡量減少RNA酶對樣品的降解。另外，由于RNA分子具有二、三級結(jié)構(gòu)可影響電泳結(jié)果，因此電泳時應(yīng)在變性劑存在下進(jìn)行，常用的變性劑為甲醛和戊二醛。 三、RNA的甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳RNA電泳結(jié)果 rRNA可以作為內(nèi)部Marker分子，通過觀察rRNA的兩條帶（28S和18S）的比例，可以