1、分子生物學 PBL第一次討論Contents1. 人類細胞質(zhì)RNA的提取2. RT-PCR的原理、方法3.瓊脂凝膠電泳結(jié)果分析及應用 人類細胞質(zhì)RNA的提取 真核細胞質(zhì)總RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核內(nèi)小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）組成，其rRNA、tRNA和mRNA位于細胞質(zhì)中。 人類細胞質(zhì)RNA的提取分析不同發(fā)育時期基因的表達狀況獲得新基因AIMS研究基因的拼接分析相應的蛋白產(chǎn)物 人類細胞質(zhì)RNA的提取原理：RNA的不穩(wěn)定性 由于核糖殘基的2和3位置帶有羥基，RNA易于被RNA酶切割水解 RNA酶含量豐富，加熱后仍能夠正確折疊恢復活性，不易失活。 所

2、以需要RNA酶抑制劑來抑制RNA酶的活性，從而達到成功提取RNA。 人類細胞質(zhì)RNA的提取 RNA提取的一般步驟：破碎組織分離RNA沉淀RNA洗滌RNA融解RNA保存RNA 破碎組織和滅活RNA酶可以同步進行可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、蛋白酶K等破碎組織 加入-巰基乙醇可以抑制RNA酶活性 分離RNA一般用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經(jīng)過此步，離心，RNA一般分布于上層，與蛋白層分開 沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH=5.2）或異丙醇。 人類細胞質(zhì)RNA的提取 洗滌RNA使用70乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則

3、不易溶解 融解RNA一般使用TE（三羥甲基氨基甲烷和EDTA配置而成） 保存RNA應該盡量低溫。為了防止痕量RNase（核糖核酸酶）的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對于長期貯存也應該如此 RT-PCR 的原理及方法 背景 基因的表達 不同細胞或組織表達不同的基因基因組DNA (genomic DNA)信使RNA (messenger RNA, mRNA)蛋白質(zhì)產(chǎn)物 RT-PCR 的原理及方法 目的通過反轉(zhuǎn)錄(reverse transcription，RT)和聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，P

4、CR)的方法，檢測目的基因在特定組織或細胞中、mRNA水平的表達豐度 RT-PCR 的原理及方法原理及方法mRNA (messenger RNA)cDNA (complementary DNA) PCR產(chǎn)物RT(反轉(zhuǎn)錄) PCR(聚合酶鏈反應)Diagram 瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳主要是應用瓊脂糖凝膠作為支持物的電泳法，借助瓊脂糖凝膠的分子篩作用，核酸片段因其分子量或者分子形狀的不同，電泳速度有差異而分離，這種技術(shù)是基因操作中常用的一種方法。 與其他支持物電泳最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。 瓊脂糖凝膠電泳 PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的 電泳檢測 在基因組DNA的提取中，用蒸餾水溶解提取出的DNA，在1.0%的瓊脂糖膠進行電泳，以Marker(分子質(zhì)量標準)作為參照，用5V/cm的電泳 30-60分鐘，最后采用EB溶液進行染色后在凝膠成像系統(tǒng) 中進行觀察拍照。 瓊脂糖凝膠電泳 應用（廣泛應用與分子生物學、遺傳學和生物化學）分離提取大分子DNA 可區(qū)分相差100bp的DNA片段測定糖化血紅蛋白PCR擴增產(chǎn)物的檢測免疫擴散法 利用瓊脂糖凝膠作為擴散介質(zhì)，使抗原與抗體在瓊脂糖凝膠