1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)王凱娟2011研究生課程1主要內(nèi)容實(shí)驗(yàn)動(dòng)物概述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)作用與意義動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)的重要組成部分 研究生科研重要的研究方法和手段重要意義：對(duì)醫(yī)學(xué)理論的研究和發(fā)展， 對(duì)當(dāng)前醫(yī)藥學(xué)各個(gè)學(xué)科的教學(xué)、科研， 對(duì)新的治療方法的發(fā)展， 對(duì)新的醫(yī)藥學(xué)理論體系的創(chuàng)立3一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物概述定義：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是指以實(shí)驗(yàn)研究為目的，在一定的環(huán)境條件控制下，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)馴化，具有明確的生物學(xué)特性和清楚的遺傳和微生物背景的動(dòng)物。4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)的幕后功臣 諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)創(chuàng)立百年以來(lái)，三分之二的獲獎(jiǎng)?wù)咚〉玫难芯砍晒且揽縿?dòng)物實(shí)驗(yàn)，共有75個(gè)獎(jiǎng)項(xiàng)得益于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。 在這75個(gè)獎(jiǎng)項(xiàng)中，使用4種

2、或以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的獎(jiǎng)項(xiàng)有7項(xiàng)，使用3種的有11項(xiàng)，使用2種的有16項(xiàng)，使用1種的有41項(xiàng)5針對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩嘤龅母鞣N實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在各類(lèi)科學(xué)研究中發(fā)揮著獨(dú)特的作用近交系動(dòng)物：活的精密分析天平無(wú)菌動(dòng)物：活的分析純?cè)噭┟庖呷毕輨?dòng)物：活的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和克隆動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)7-轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的出現(xiàn) 轉(zhuǎn)基因技術(shù)可將人類(lèi)的致病基因?qū)氡尘扒逦?、各種條件得到嚴(yán)格控制的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳組成中去，通過(guò)精確地激活或增強(qiáng)這些基因的表達(dá)，制作各種人類(lèi)遺傳疾病的動(dòng)物模型, 其研究結(jié)果具有較高的真實(shí)性, 可用于診斷、治療和新藥篩選。 由美國(guó)密蘇里大學(xué)培育出的 含有熒光水母基因的小豬。左為熒光小豬，右為正常小豬。8 按微生物控制

3、的程度，我國(guó)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為四個(gè)等級(jí)： （1）普通級(jí)動(dòng)物：一般為教學(xué)示范用。 （2）清潔級(jí)動(dòng)物：國(guó)內(nèi)科研工作要求的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物，適合于大多數(shù)科研課題。 （3）無(wú)特定病原體動(dòng)物（SPF動(dòng)物）：國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。 （4）無(wú)菌動(dòng)物（CF動(dòng)物）和悉生動(dòng)物：僅在特殊課題需要時(shí)使用。10（二）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇 首先要從研究目的和實(shí)驗(yàn)要求來(lái)選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其次要考慮是否容易獲得、是否經(jīng)濟(jì)及容易飼養(yǎng)等因素。111盡量選用機(jī)能、代謝、結(jié)構(gòu)及其它方面機(jī)能與人相似的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般來(lái)說(shuō)，動(dòng)物的進(jìn)化階段愈高，機(jī)能、代謝、結(jié)構(gòu)愈復(fù)雜，也就愈接近人類(lèi)。 選擇原則12 選用標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程也在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中飼養(yǎng)的動(dòng)物 排除因動(dòng)物雜

4、交、遺傳上的不均質(zhì)及環(huán)境條件的變化，所引起的個(gè)體反應(yīng)不一致 排除因動(dòng)物攜帶細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)和潛在疾病的影響，才能便于分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高科學(xué)性，準(zhǔn)確性，把所獲得的結(jié)果與同類(lèi)研究進(jìn)行比較、交流，并得到承認(rèn)。14在實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)避免使用隨意交配繁殖的動(dòng)物，而應(yīng)根據(jù)研究目的選擇用遺傳學(xué)控制的方法培育出來(lái)的近交系、突變系、系統(tǒng)雜交或封閉群動(dòng)物。同時(shí)應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行微生物控制，發(fā)展使用無(wú)菌動(dòng)物、已知菌動(dòng)物或無(wú)特定病原體（SPF）動(dòng)物。15心血管病研究 豬(辛克萊小型豬/廣西巴馬小型豬/歐米尼豬) 豬冠狀動(dòng)脈，在解剖學(xué)、血液動(dòng)力學(xué)上與人類(lèi)相似。對(duì)高膽固醇食物的反應(yīng)與人一樣，很容易出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬

5、化的典型病灶。17實(shí)驗(yàn)外科學(xué)研究犬(比格犬/華北犬/西北犬/狼犬)內(nèi)臟與人相似，比例近似。臨床醫(yī)生在研究新的手術(shù)或麻醉方法時(shí)往往選用犬來(lái)做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，取得經(jīng)驗(yàn)和技巧后用于臨床。如心血管外科，腦外科，斷肢再植， 器官和組織移植等。18行為學(xué)和精神病及神經(jīng)生物學(xué)研究獼猴。制造和鑒定脊髓灰質(zhì)炎疫苗 獼猴是唯一的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。194選用不同種屬品系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物某些特殊反應(yīng)，使適合于不同研究目的的需要腫瘤研究常選用近交系小鼠， 如AKR小鼠白血病 發(fā)生率可達(dá)90； C3H小鼠乳腺癌發(fā)病率達(dá)97， 而不選用C57BL等，因其乳腺癌發(fā)病率極低(5)。發(fā)熱、解熱和檢查致熱源實(shí)驗(yàn)適宜選用兔做實(shí)驗(yàn)， 因?qū)俸銣貏?dòng)物，對(duì)致熱物

6、質(zhì)反應(yīng)敏感。20高血壓病研究選用SHR大鼠，因自發(fā)性高血壓，心血管疾病發(fā)病率高，對(duì)降壓藥物有反應(yīng)。耳科學(xué)研究豚鼠聽(tīng)神經(jīng)對(duì)聲波特別是7002000Hz的純音最敏感，常用于聽(tīng)覺(jué)和內(nèi)耳疾病的研究。免疫學(xué)研究豚鼠易引起變態(tài)反應(yīng)，產(chǎn)生大量補(bǔ)體，是過(guò)敏性休克和變態(tài)反應(yīng)研究的首選動(dòng)物。215實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬、品系的選擇如果實(shí)驗(yàn)結(jié)論只針對(duì)某一品系則使用一個(gè)品系。如果實(shí)驗(yàn)結(jié)論針對(duì)整個(gè)物種在內(nèi)的一般性研究則使用多個(gè)不同來(lái)源的品種、品系。一般對(duì)多物種進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)先選小型動(dòng)物，再推廣到大型物種；要求只能建立在對(duì)多個(gè)物種進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，才能推廣到人類(lèi)，也稱(chēng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)外推。常用順序時(shí)小鼠、大鼠、兔、犬、猴。22（2）性別不

7、同性別動(dòng)物對(duì)同一實(shí)驗(yàn)處理（如藥物、刺激等）的感受性常有差異，在實(shí)驗(yàn)研究中如無(wú)特殊要求，一般宜選用雌雄各半做實(shí)驗(yàn)。（3）實(shí)驗(yàn)季節(jié)和晝夜過(guò)程不同季節(jié)和不同晝夜，動(dòng)物機(jī)體反應(yīng)性會(huì)有一定改變，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇中也應(yīng)予以注意。24（4）生理狀態(tài)與健康情況動(dòng)物的不同生理狀態(tài)如懷孕、授乳時(shí)對(duì)外界刺激的反應(yīng)常有所改變，在一般研究中應(yīng)從實(shí)驗(yàn)組中刪除；必須選用健康動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。25二、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)具備的條件。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本類(lèi)型 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的樣本含量 271、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)具備的條件 必須掌握相關(guān)的專(zhuān)業(yè)知識(shí)實(shí)驗(yàn)對(duì)象、處理因素和實(shí)驗(yàn)效應(yīng)。28實(shí)驗(yàn)對(duì)象：品系，年齡，性別，等級(jí)，價(jià)格等因素 29實(shí)驗(yàn)處理

8、因素：包括很多方面 例題：7只小鼠的血紅蛋白HB（g/100ml）與微量元素(ug/100ml)測(cè)定結(jié)果，通過(guò)聚類(lèi)分析希望找出具有代表性的指標(biāo)，以便經(jīng)濟(jì)、快速地評(píng)價(jià)小鼠貧血程度30統(tǒng)計(jì)學(xué)處理對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響 31 實(shí)驗(yàn)效果指實(shí)驗(yàn)結(jié)果和對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素很多，重要有實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是否合理，實(shí)驗(yàn)方法是否正確，數(shù)據(jù)處理是否合理，實(shí)驗(yàn)條件是否控制等。可以看出：統(tǒng)計(jì)學(xué)處理貫穿于整個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)始終。 32實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本原則 創(chuàng)新性和先進(jìn)性；科學(xué)性和重復(fù)性；有用性和可控性；經(jīng)濟(jì)性和易行性 33工作程序 34實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的實(shí)施352、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本類(lèi)型 完全隨機(jī)化設(shè)計(jì)（簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣） 隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)（分

9、層隨機(jī)抽樣） 配對(duì)設(shè)計(jì) 其他設(shè)計(jì)361） 完全隨機(jī)化設(shè)計(jì) 隨機(jī)分組：先將動(dòng)物按順序編號(hào)，再用隨機(jī)化工具，將動(dòng)物分組，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單，容易操作，靈活，統(tǒng)計(jì)分析也比較簡(jiǎn)單，抗數(shù)據(jù)缺失能力較強(qiáng)亡，信息損失較小。缺點(diǎn)：對(duì)非實(shí)驗(yàn)因素缺乏有效控制，只能靠隨機(jī)化方法平衡有關(guān)因素的影響。結(jié)果精確度降低，誤差往往偏高。所以一般適用于實(shí)驗(yàn)對(duì)象同質(zhì)較好的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。37動(dòng)物的編號(hào) 染色法：3%-5%的苦味酸溶液，可將毛色染成黃色，適應(yīng)于大鼠、小鼠和家兔，可保持2-3個(gè)月耳孔法：用打孔機(jī)直接再實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的耳朵上打孔編號(hào)。掛牌法：使用于較大的動(dòng)物狗，猴等。38動(dòng)物的編號(hào)10203070809039動(dòng)物的

10、編號(hào)091240動(dòng)物的編號(hào)412） 隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì) 隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)開(kāi)始應(yīng)用于農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)。例如小麥的產(chǎn)量首先與小麥的品種（factor）有關(guān)，另外很可能與地塊（level）有關(guān)。這種設(shè)計(jì)的結(jié)果不但可以確定處理因素的效果，還可以確定“區(qū)組”影響。實(shí)際上影響小麥產(chǎn)量的因素還有很多 42一窩小鼠可以看作是一個(gè)區(qū)組，很明顯不同區(qū)組之間，在同一個(gè)品種內(nèi)是有一定差異的。為了減少這種差異，需要將各個(gè)區(qū)組的動(dòng)物隨機(jī)分配到處理組和對(duì)照組中。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)是一種混合抽樣，其特點(diǎn)是將總體按變異原因或程度劃分成若干個(gè)區(qū)組，然后再用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣方法。43隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)舉例44注意事項(xiàng)：每個(gè)區(qū)組的動(dòng)物數(shù)量應(yīng)該等于或大于處理組要求的實(shí)

11、驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量。如少于處理組數(shù)，則這組不能采用，特別不能用別窩的動(dòng)物來(lái)補(bǔ)充；如大于處理組數(shù)，則這組能采用，多余的動(dòng)物將舍棄。45隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)特點(diǎn)把總體分為幾個(gè)比較同質(zhì)區(qū)組，從而提高抽樣的準(zhǔn)確度。顯然比簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣準(zhǔn)確；運(yùn)用了隨機(jī)原理，同時(shí)運(yùn)用局部控制原理，從而降低了抽樣誤差，也可以來(lái)估算抽樣誤差；缺點(diǎn)：抗缺失數(shù)據(jù)能力差，如果一個(gè)區(qū)組發(fā)生意外，整個(gè)區(qū)組必須放棄。463） 配對(duì)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體之間的差異較大時(shí)，可采用配對(duì)設(shè)計(jì)。選擇個(gè)體差異較小的動(dòng)物配成對(duì)子，然后隨機(jī)分配給處理組和對(duì)照組。主要用于封閉群大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如狗、貓、猴，個(gè)體差異大，不易獲得較大數(shù)量的相似個(gè)體，一般采用配對(duì)設(shè)計(jì)。其他設(shè)計(jì)類(lèi)型

12、：順序抽樣、整體抽樣、典型抽樣。47一般，要知道或計(jì)算樣本大小，必須提供3或4個(gè)已知因素1）效應(yīng)大?。ㄒ话銥閮山M間的差別）；2）群體標(biāo)準(zhǔn)誤差（SD，對(duì)連續(xù)性變量）；3）測(cè)定假定效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)期望力度用表示；4）顯著性水平，用a表示。五、樣本大小的確定48我們可以從專(zhuān)業(yè)網(wǎng)站上得到計(jì)算樣本量大小的服務(wù)： ,/hyperstat/power.html/rlench/power/index.htmlwww.zoology.ubc.ca/-krebs/power.html.uk/hbook14.htm49一般估測(cè)的樣本數(shù) 小動(dòng)物(大鼠、小鼠、蛙、魚(yú))：每組10-30例,計(jì)量資料每組不少于10例, 計(jì)數(shù)資料每

13、組不少于30例； 中等動(dòng)物(豚鼠、家兔)： 每組8-20例,計(jì)量資料每組不少于8例, 計(jì)數(shù)資料每組不少于20例； 大動(dòng)物(犬、貓、豬、羊等)： 每組6-20例,計(jì)量資料每組不少于6例, 計(jì)數(shù)資料每組不少于20例。50幾個(gè)計(jì)算公式：1、二分變量（比率或百分率）N=C（PcQc-PeQe）/d2-2/d +22、連續(xù)變量N=1+2C（s/d）2 用于研究比較兩組的平均值51對(duì)照的設(shè)立在實(shí)驗(yàn)中設(shè)立對(duì)照組動(dòng)物，是為了與實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物有一個(gè)直接對(duì)應(yīng)的關(guān)系，以消除過(guò)多變量和未知變量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響。對(duì)照的種類(lèi)有以下幾種：1）陽(yáng)性對(duì)照2）陰性對(duì)照3）空白對(duì)照4）媒介物對(duì)照5）比擬物對(duì)照52陽(yáng)性對(duì)照：一般在陽(yáng)

14、性對(duì)照組希望有變化作用：作為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)量各實(shí)驗(yàn)組間差異的程度。例如：毒物試驗(yàn)，動(dòng)物給予毒物作為對(duì)照，結(jié)果是產(chǎn)生損傷或變化53陰性對(duì)照：期望有正常狀態(tài)不產(chǎn)生變化作用：保證未知變量對(duì)實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物引起相反的效應(yīng)不存在，即排出假陽(yáng)性54空白對(duì)照模擬處理組的過(guò)程而實(shí)際上沒(méi)有給予動(dòng)物以受試物或處理。移植或損傷媒介物對(duì)照在測(cè)試化合物溶于一種媒介時(shí)，這種媒介需要對(duì)照作用：觀察溶劑是否引起反應(yīng)比擬物對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照性質(zhì)一樣，使用一個(gè)已知的處理來(lái)對(duì)比待測(cè)的處理例如：藥物治療，使用一種已知臨床藥物，對(duì)比實(shí)驗(yàn)藥物。55四 動(dòng)物福利動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)必須遵循“3R”原則替代（Replacement）：盡可能使用低等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或非

15、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。減少（Reduction）：盡可能用較少的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獲得滿意的統(tǒng)計(jì)結(jié)論。優(yōu)化（Refinement）：優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作，以減輕動(dòng)物的痛苦。56三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的最后考慮 1、實(shí)驗(yàn)步驟的確定實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前必須通過(guò)IACUC和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的確認(rèn)。包括動(dòng)物飼養(yǎng)管理和使用的具體操作方法按照相關(guān)法律提供申請(qǐng)書(shū)時(shí)，需要相關(guān)證明實(shí)驗(yàn)涉及到危險(xiǎn)品，還需要其他委員會(huì)的批準(zhǔn)572、人員必須有相關(guān)培訓(xùn)人員才能承擔(dān)實(shí)驗(yàn)我國(guó)由省級(jí)科技主管部門(mén)進(jìn)行培訓(xùn)583、小規(guī)模的預(yù)實(shí)驗(yàn)小規(guī)模的預(yù)實(shí)驗(yàn)是使用少量的動(dòng)物得到預(yù)示性的數(shù)據(jù)或通過(guò)預(yù)實(shí)將操作和技術(shù)固定并完善，以便于進(jìn)行大規(guī)模的正式實(shí)驗(yàn)通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用量證明實(shí)驗(yàn)合理性預(yù)實(shí)驗(yàn)同樣需要經(jīng)過(guò)IACUC同意59 4、數(shù)據(jù)的輸入和分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)該規(guī)定在數(shù)據(jù)分析前，制定保證數(shù)據(jù)質(zhì)量的措施和程序，確