1、動物細(xì)胞工程（含胚胎工程）的發(fā)展歷程1890年，希普將安哥拉兔的胚胎移入比利時(shí)兔的輸卵管內(nèi)，得到了兩只安哥拉兔，這是世界上胚胎移植成功的首例1907年，哈里森用一滴淋巴液成功培養(yǎng)了蝌蚪的神經(jīng)元，首創(chuàng)了動物組織體外培養(yǎng)法1951年，張明覺等發(fā)現(xiàn)了哺乳動物精子的獲能現(xiàn)象1958年，格登用非洲爪蟾進(jìn)行體細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)，成功培育出性成熟個(gè)體，同一時(shí)期，我國科學(xué)家童第周等開展了魚類細(xì)胞核移植工作1959年，試管家兔誕生，之后，多種試管動物相繼出生1975年，米爾斯坦和科勒等創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù)1978年，小鼠的桑椹胚被成功分割，次年，科學(xué)家分割綿羊胚胎獲得了同卵羔羊1981年，埃文斯等成功分離和培養(yǎng)了小

2、鼠的胚胎干細(xì)胞1996年，世界上第一只體細(xì)胞克隆羊多莉在英國誕生，隨后多種克隆動物相繼問世2006年，山中伸彌等獲得了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，我國科學(xué)家用這種細(xì)胞培育出了小鼠2014年，世界上第一個(gè)用單細(xì)胞基因組測序進(jìn)行遺傳病篩查的試管嬰兒在我國誕生2017年，我國科學(xué)家首次培育了體細(xì)胞克隆猴2.2 動物細(xì)胞工程動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞核移植動物細(xì)胞融合生產(chǎn)單克隆抗體其中動物細(xì)胞培養(yǎng)是最基礎(chǔ)的技術(shù)。2.2 動物細(xì)胞培養(yǎng)克隆猴中中和華華克隆皮膚 在治療大面積燒傷時(shí)，通常采用的辦法是取燒傷病人的健康皮膚進(jìn)行自體移植。 但對這樣的病人來說，自體健康皮膚非常有限，使用他人皮膚來源又不足，而且產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。 那

3、么，怎樣才能獲得大量的自體健康皮膚？能不能用自體皮膚的單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)出可供移植的皮膚？從社會中來克隆皮膚 科學(xué)家通過動物細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)建了人造皮膚 可以從病人身上取少量正常、健康的皮膚在體外進(jìn)行培養(yǎng)、擴(kuò)増。目前,科學(xué)家還在研究對皮膚干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),以獲得適合臨床上使用的人造皮膚。一、動物細(xì)胞培養(yǎng)1、概念：從動物體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個(gè)細(xì)胞，然后在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，讓這些細(xì)胞生長和增殖的技術(shù)。2、目的：獲得細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)物；不能獲得完整動物個(gè)體。3、原理：細(xì)胞增殖（有絲分裂）4、實(shí)例：那么，獲得這些細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)物需要哪些條件，具體過程又是怎樣的？克隆皮膚皮膚燒傷（一）、動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件1.

4、營養(yǎng)： 葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素、促生長因子、微量元素（合成培養(yǎng)基）+動物血清等2. 無菌、無毒的環(huán)境：培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具滅菌處理，無菌操作。添加一定量的抗生素？定期更換培養(yǎng)液，防止代謝物積累傷害細(xì)胞。3. 溫度、PH和滲透壓： 溫度36.5+0.5度，pH7.27.4，也需考慮滲透壓因素。4. 氣體環(huán)境： O2和CO2（95%空氣和5% CO2 ） O2和CO2的作用分別是什么？O2是細(xì)胞代謝所必需的CO2的主要作用維持培養(yǎng)液的pH為什么對動物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)通常要添加血清？補(bǔ)充資料：1、血清中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素等，2、氨基酸有多種，是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的基本成分，其中有些氨

5、基酸動物細(xì)胞本身不能合成（稱為必需氨基酸），必須由培養(yǎng)液提供。3、血清激素有胰島素、生長激素等及多種生長因子；血清還含有多種未知的促細(xì)胞生長因子、促貼附因子及其他活性物質(zhì)，能促進(jìn)細(xì)胞的生長、增殖和貼附。4、因此，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，要保證細(xì)胞能夠順利生長和增殖，一般需添加10%20%的血清。 血清中含有多種未知的促細(xì)胞生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)，這是細(xì)胞生長和增殖所必需的。（二）、動物細(xì)胞培養(yǎng)過程胚胎或幼齡動物器官組織取出組織剪碎胰蛋白酶處理單個(gè)細(xì)胞細(xì)胞懸液加培養(yǎng)液培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng) 轉(zhuǎn)入（ 細(xì)胞貼壁長成單層細(xì)胞,有接觸抑制現(xiàn)象）細(xì)胞貼壁接觸抑制原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)（原代培養(yǎng)）(分散組織)思考:（1）培養(yǎng)前為什么分散成

6、單個(gè)細(xì)胞？ 成塊組織中細(xì)胞與細(xì)胞靠在一起，彼此限制了生長與增殖 利于與培養(yǎng)液充分接觸，保證O2與營養(yǎng)供應(yīng)和代謝物及時(shí)排出。（2）將組織分散成單個(gè)細(xì)胞時(shí)為什么要用胰蛋白酶（或膠原蛋白酶）處理？胃蛋白酶可以嗎？胰蛋白酶可以將動物組織細(xì)胞間的蛋白質(zhì)成分酶解，使細(xì)胞分散開，獲得單個(gè)細(xì)胞。纖維蛋白、膠原蛋白等胃蛋白酶不可以，pH不適宜。（3）在用胰蛋白酶處理組織時(shí)應(yīng)注意什么？細(xì)胞膜含有蛋白質(zhì)，長時(shí)間處理會損傷細(xì)胞要控制好時(shí)間原代培養(yǎng)初次培養(yǎng)傳代培養(yǎng)分瓶后的培養(yǎng)拓展1：動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中涉及到名詞解釋1:細(xì)胞貼壁：懸液中分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上(單層)。要求：培養(yǎng)瓶（皿）內(nèi)表面光滑、無毒、易于貼附。2

7、:接觸抑制： 當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長到表面相互接觸時(shí)，細(xì)胞就會停止分裂增殖。細(xì)胞的接觸抑制3:原代培養(yǎng) 把動物組織經(jīng)處理后的初次培養(yǎng)統(tǒng)稱為原代培養(yǎng)。4:傳代培養(yǎng) 將分瓶之后的細(xì)胞培養(yǎng)稱為傳代培養(yǎng)。 當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長停止，這時(shí)如果要使細(xì)胞繼續(xù)生長，就要及時(shí)用胰蛋白酶等，使細(xì)胞從瓶壁上解離下來，然后加入新的培養(yǎng)液，將細(xì)胞分離稀釋，并從原培養(yǎng)瓶內(nèi)轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)瓶內(nèi)的過程。5:細(xì)胞株 從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出進(jìn)行傳代培養(yǎng)的細(xì)胞，能傳到40-50代，其遺傳物質(zhì)沒有發(fā)生變化。6:細(xì)胞系 傳到40-50代后有部分細(xì)胞遺傳物質(zhì)發(fā)生了變化，具有癌細(xì)胞的特點(diǎn)，失去接觸抑制，可能在培養(yǎng)條件下無限制的傳代下去。細(xì)胞系

8、的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細(xì)胞的特點(diǎn)，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。區(qū)別：分瓶培養(yǎng)10代細(xì)胞50代細(xì)胞無限增殖保持細(xì)胞正常二倍體核型部分細(xì)胞核型改變遺傳物質(zhì)改變突破細(xì)胞壽限危機(jī)1危機(jī)2(三) 動物細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)危機(jī)：原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)（遺傳物質(zhì)沒改變）（遺傳物質(zhì)有的改變）拓展1：核型 核型是指一個(gè)體細(xì)胞中的全部染色體，按其大小、形態(tài)特征順序排列所構(gòu)成的圖像。 在完全正常的情況下，一個(gè)體細(xì)胞的核型一般可代表該個(gè)體的核型。思考討論 P451.幼齡動物的細(xì)胞與老齡動物的細(xì)胞比較，分化程度低的細(xì)胞與分化程度高的細(xì)胞比較，哪些細(xì)胞更易于培養(yǎng)？為什么？ 細(xì)胞的增殖能力與供體的年齡有關(guān)，幼齡動物的細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，有絲

9、分裂旺盛，老齡動物的細(xì)胞則相反。所以，一般來說，幼齡動物的細(xì)胞比老齡動物的細(xì)胞易于培養(yǎng)。同樣，分化程度越低的細(xì)胞，増殖能力越強(qiáng)，所以更容易培養(yǎng)。動物胚胎或幼齡動物的組織、器官細(xì)胞懸浮液胰蛋白酶10代細(xì)胞50代細(xì)胞無限傳代單個(gè)細(xì)胞加培養(yǎng)液離體的植物器官、組織或細(xì)胞愈傷組織根、芽植物體脫分化再分化接種至培養(yǎng)基動物細(xì)胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)思考:動物細(xì)胞培養(yǎng)與植物組織培養(yǎng)有什么相同和不同之處？比較項(xiàng)目植物組織培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)原理培養(yǎng)基性質(zhì)培養(yǎng)基特有成分培養(yǎng)結(jié)果培養(yǎng)目的獲得細(xì)胞及代謝產(chǎn)物細(xì)胞的全能性細(xì)胞株、細(xì)胞系植物體快速繁殖、培育無病毒植株等葡萄糖、動物血清蔗糖、植物激素液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基細(xì)胞增殖拓展2

10、：植物組織培養(yǎng)和動物細(xì)胞培養(yǎng)的比較二、干細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用3、干細(xì)胞類型：1、胚胎干細(xì)胞：存在于早期胚胎中，具有分化成為成年動物體內(nèi)任何一種類型的細(xì)胞，并進(jìn)一步形成機(jī)體的所有組織和器官甚至個(gè)體的潛能。2、干細(xì)胞分布：早期胚胎、骨髓和臍帶血等多種組織和器官中胚胎干細(xì)胞（ ES細(xì)胞）成體干細(xì)胞全能干細(xì)胞多能干細(xì)胞專能干細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞4、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞應(yīng)用體外誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞iPS臨床治療人類疾病多種體細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化如：白血病、帕金森病、阿而茨海默病等 人的核移植胚胎干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化，形成相應(yīng)的組織、器官后，可用于組織器官的移植。 干細(xì)胞將在再生醫(yī)學(xué)、藥物安全性與有效性檢測等領(lǐng)域發(fā)揮大作用。練習(xí)與應(yīng)用1. 2. A拓展應(yīng)用（1）像建立骨髓庫一樣，有研究團(tuán)隊(duì)正在嘗試建立HA(Human Leukocyte Antigen，人類白細(xì)胞抗原)多態(tài)性豐富的iPS細(xì)胞庫，可以為需要的人找到HLA匹配度較高的iPS細(xì)胞，這樣不僅可以節(jié)省時(shí)間、成本，還能減輕異體干細(xì)胞移植后發(fā)生的免疫排斥反