1、基因治療載體的研究現(xiàn)狀【關(guān)鍵詞】基因；治療;載體基因治療是一種新的治療手段，可用于多種疾病的治療，包括癌癥、遺傳性疾并感染性疾并心血管疾病和自身免疫性疾病等.基因治療通常是指將遺傳物質(zhì)DNA或RNA引入到患者的細(xì)胞中，以到達(dá)治療疾病的目的的方法13.它是伴隨著DNA重組技術(shù)的成熟而開(kāi)展起來(lái)的新型的分子學(xué)治療手段，是當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)開(kāi)展中的重大打破.1968年，美國(guó)科學(xué)家邁克爾布萊澤首次在醫(yī)學(xué)界提出了基因治療的概念.1990年，美國(guó)科學(xué)家Andersn等進(jìn)展了首例真正意義上的基因治療臨床試驗(yàn)，獲得了初步成功4.在基因治療過(guò)程中，基因?qū)胂到y(tǒng)是最關(guān)鍵的技術(shù).目前，在基因?qū)胼d體方面出現(xiàn)了兩大主流，即病

2、毒載體系統(tǒng)及非病毒載體系統(tǒng).本文對(duì)基因治療載體應(yīng)用的原理、種類和研究現(xiàn)狀進(jìn)展了綜述.1病毒載體外源基因進(jìn)入細(xì)胞中通常需要運(yùn)輸工具，而病毒是在漫長(zhǎng)的自然進(jìn)化過(guò)程中存活下來(lái)的無(wú)細(xì)胞構(gòu)造的最孝最簡(jiǎn)單的生命寄生形式.病毒通?？梢愿咝实剡M(jìn)入特定的細(xì)胞，表達(dá)自身蛋白，產(chǎn)生新的病毒粒子，因此被改造的病毒首先成為了基因治療的載體.病毒載體在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用廣泛，約70%的治療方案采用病毒載體5，6.病毒載體包括反轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體及單純皰疹病毒載體等.1.2腺病毒載體腺病毒是無(wú)包膜的線性雙鏈DNA病毒，在自然界分布廣泛，至少存在100種以上的血清型.腺病毒基因組長(zhǎng)度約為36kb，兩端

3、各有1個(gè)反向末端重復(fù)區(qū)，其內(nèi)側(cè)為病毒包裝信號(hào).腺病毒基因組上分布著4個(gè)早期轉(zhuǎn)錄元E1,E2,E3,E4承當(dāng)調(diào)節(jié)功能，和1個(gè)晚期轉(zhuǎn)錄元負(fù)責(zé)構(gòu)造蛋白編碼.作為基因治療的載體，腺病毒載體具有如下優(yōu)點(diǎn)：1基因包裝容量較大，因此可插入大片段外源基因，最多可達(dá)35kb；2感染效率高，可高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)不同類型的人組織細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率接近100%轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；3)可轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞；4)在細(xì)胞培養(yǎng)物中有高滴度的重組病毒產(chǎn)量；5進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并不整合到宿主細(xì)胞基因組，僅瞬間表達(dá)，因此平安性較高.第一代腺病毒載體為E1或E3基因缺失，缺失區(qū)插入外源治療基因，但此型載體可引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥反響或免疫反響，且表達(dá)外源基因

4、的時(shí)間較短.第二代腺病毒載體那么另外讓E2a或E4基因缺失，產(chǎn)生較弱的免疫反響，在載體容量和平安性方面亦有較大改良.第三代腺病毒載體缺失了全部的無(wú)病毒載體或大局部腺病毒基因微型腺病毒載體，僅保存反向末端重復(fù)區(qū)和包裝信號(hào)序列，最多可插入35kb的基因，且所引起的細(xì)胞免疫反響更弱，在它的載體中引入核基質(zhì)附著區(qū)基因可使外源基因保持長(zhǎng)期表達(dá)，并可增加穩(wěn)定性.1.3腺相關(guān)病毒載體腺相關(guān)病毒屬于非致病性的微小病毒科家族成員，只有依賴于輔助病毒才可能增殖.腺相關(guān)病毒基因組很小，如2型腺相關(guān)病毒是由4681個(gè)核苷酸組成的單鏈DNA，包含2個(gè)基因，即rep基因編碼負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)病毒復(fù)制、構(gòu)造基因表達(dá)和整合到宿主基因組

5、中的蛋白及ap基因編碼衣殼構(gòu)造蛋白，基因組的1個(gè)末端存在1個(gè)145bp的末端重復(fù)區(qū).腺相關(guān)病毒可感染分裂期及靜止期細(xì)胞,能插入到宿主細(xì)胞染色體內(nèi),或以染色體外串聯(lián)體DNA的形式長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，可有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)腦、骨骼肌及肝臟等類型的細(xì)胞，具有抗原性、毒性小及不致病等特點(diǎn)，被認(rèn)為是目前最好的載體，在遺傳病的基因治療方面顯示出優(yōu)勢(shì)，也被廣泛應(yīng)用于治療惡性腫瘤、自身免疫性疾并感染性疾病及器官移植和組織細(xì)胞工程研究等11，12.但腺相關(guān)病毒載體存在著不能插入較大的外源基因，缺少高效的包裝細(xì)胞，制備過(guò)程復(fù)雜及制備滴度低等缺陷.1.4單純皰疹病毒載體型單純皰疹病毒屬于人嗜神經(jīng)病毒，可在神經(jīng)元內(nèi)呈埋伏感染狀態(tài).型

6、單純皰疹病毒基因組為152kb大小的線性雙鏈DNA分子，已鑒定了80個(gè)以上的基因，其中50左右為非必需基因.野生型病毒感染神經(jīng)元后，通常處于埋伏感染狀態(tài)，它的基因組以附加體的形式位于細(xì)胞核內(nèi)，且不被人體免疫系統(tǒng)所識(shí)別，埋伏期可持續(xù)至終生.當(dāng)受到生理性損傷或周圍神經(jīng)損傷等刺激后，埋伏的人單純皰疹病毒可被激活，進(jìn)入裂解性感染期.型單純皰疹病毒可被改造為2類載體：擴(kuò)增子載體僅把型單純皰疹病毒的復(fù)制起點(diǎn)和包裝信號(hào)序列插入到細(xì)菌質(zhì)粒中，當(dāng)其轉(zhuǎn)染至包裝細(xì)胞后，用型單純皰疹病毒輔助病毒超感染，便可獲得含有擴(kuò)增子的假病毒；重組型單純皰疹病毒，可刪除與復(fù)制相關(guān)及非必需基因，減少細(xì)胞毒性，可在宿主神經(jīng)元中長(zhǎng)期表達(dá)

7、外源治療基因，但假如宿主神經(jīng)元內(nèi)已埋伏了野生型單純皰疹病毒，那么其可能被重新激活，繼而進(jìn)入裂解期.美國(guó)哈佛大學(xué)姚豐博士利用病毒自身的反式主要負(fù)調(diào)節(jié)物構(gòu)建了既可抑制自身病毒復(fù)制，又可抑制野生型病毒復(fù)制的重組病毒.此病毒可作為新型、平安性單純皰疹病毒載體，應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)研究.型單純皰疹病毒載體不僅感染神經(jīng)元，亦可感染非神經(jīng)細(xì)胞，如上皮細(xì)胞.目前，型單純皰疹病毒載體已被臨床試驗(yàn)于惡性間皮瘤及帕金森綜合癥等疾病的治療.2非病毒載體雖然病毒載體作為基因傳遞的工具被廣泛地采納，但仍存在著局限性，即病毒性載體均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生某種程度的免疫反響，存在著插入突變等致瘤及致毒的風(fēng)險(xiǎn)，且載體容量有限，制備滴度不高等

8、.而非病毒載體那么具有無(wú)傳染性，不限制載體容量，可大量制備及具有靶向性等優(yōu)點(diǎn)13.目前，所應(yīng)用的非病毒DNA轉(zhuǎn)移方法有4種，即裸DNA、脂質(zhì)體、多聚物及分子耦聯(lián)體.裸DNA可將攜帶外源基因的質(zhì)粒直接注射或通過(guò)基因槍導(dǎo)入到組織細(xì)胞中，主要應(yīng)用于DNA疫苗，可激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫.脂質(zhì)體是由脂質(zhì)雙分子層組成的顆粒，可介導(dǎo)基因穿過(guò)細(xì)胞膜.最常用的脂質(zhì)體為陽(yáng)離子脂質(zhì)體，主要由帶正電荷的脂類及中性輔助脂類以等摩爾混合而成.帶陽(yáng)性電荷的脂質(zhì)體與帶陰性電荷的DNA之間可有效地形成復(fù)合物，并通過(guò)內(nèi)吞作用移入細(xì)胞內(nèi).多聚物，即利用陽(yáng)離子多聚體，如多聚左旋賴氨酸上的正電荷與DNA上的負(fù)電荷結(jié)合發(fā)生電性中和胍，而形成穩(wěn)定的多聚物/DNA復(fù)合物.復(fù)合物仍帶正電荷，可與細(xì)胞外表帶負(fù)電荷的受體結(jié)合，而被滲入至細(xì)胞內(nèi).分子耦聯(lián)體是將外源性DNA通過(guò)某種方式共價(jià)結(jié)合到細(xì)胞外表特異受體的配基或單克隆抗體或病毒胞膜蛋白上，利用特異的結(jié)合特性介導(dǎo)外源性基因?qū)胫聊骋活愋图?xì)胞中.目前，所知的臨床研究方案中，脂質(zhì)體是除反轉(zhuǎn)錄病毒載體外應(yīng)用最廣泛的基因傳遞方法，特別在腫瘤及囊性纖維化等疾病的治療中應(yīng)用較多.盡管非病毒載體可防止引起病毒載體所帶來(lái)的毒副作用，但質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體復(fù)合物與腺病毒一樣，也可引發(fā)炎癥.非病毒載體易于制備，并能形成規(guī)模消費(fèi)，但基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)效率較低仍是困擾它開(kāi)展的主要障礙.最近研究結(jié)果說(shuō)明，超