1、基因病的分子診斷分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 第十一、十二章遺傳病分類單基因遺傳病染色體病體細(xì)胞遺傳病線粒體遺傳病多基因遺傳病基因突變點(diǎn)突變 (Point Mutation)插入或缺失 (Insert/Deletion)缺失或重復(fù) (Deletion/Duplication)基因倒位 (Inversion)基因融合 (Fusion)動(dòng)態(tài)突變 (Dynamic)單基因遺傳病的分子診斷鐮狀細(xì)胞貧血鐮狀細(xì)胞貧血（SICKLE CELL ANAEMIA）1949年世界上最早發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)分子病，由此開創(chuàng)了疾病分子生物學(xué);患者出生半年后，癥狀和體征逐漸出現(xiàn)，生長(zhǎng)發(fā)育不良，易發(fā)生感染。有貧血、黃疸和肝、脾增大，心、肺

2、功能常受損，可發(fā)生充血性心力衰竭，甚至產(chǎn)生肌肉骨骼痛、腹痛等痛性危象。血紅蛋白血紅蛋白是由珠蛋白和血紅素組成；其中珠蛋白多肽鏈有7種：、G、A、。成年人血紅蛋白中血紅蛋白A（HbA）由兩條珠蛋白肽鏈和兩條珠蛋白肽鏈組成，占血紅蛋白總量的97%以上；血紅蛋白A2（HbA2）由兩條珠蛋白肽鏈和兩條珠蛋白肽鏈組成，占血紅蛋白總量的2%-3%；其余為血紅蛋白F(HbF)；血紅蛋白病可以分為兩大類；一是由于珠蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化所導(dǎo)致的異常血紅蛋白??；另一類是由于珠蛋白多肽鏈的組成比例改變和珠蛋白含量降低所導(dǎo)致的地中海貧血；7鐮狀細(xì)胞貧血珠蛋白基因的第6位密碼子由正常的GAG突變?yōu)镚TG（AT），使其編碼

3、的珠蛋白N端第6位氨基酸由正常的谷氨酸變成了纈氨酸，形成HbS；這種血紅蛋白分子表面電荷改變，出現(xiàn)一個(gè)疏水區(qū)域，導(dǎo)致溶解度下降；在氧分壓低的毛細(xì)血管中，溶解度低的HbS聚合形成凝膠化的棒狀結(jié)構(gòu)，使紅細(xì)胞變成鐮刀狀；ATGGTGCATCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCA ATGGTGCATCTGACTCCTGTGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGT

4、GGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCA 診斷：根據(jù)種族和家族史、鐮變?cè)囼?yàn)陽性和血紅蛋白電泳顯示主要成分為HbS，結(jié)合臨床表現(xiàn)，即可明確診斷。實(shí)驗(yàn)室檢查：外周血血紅蛋白為50100g/L。網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)常在10%以上。紅細(xì)胞大小不均，可見有核紅細(xì)胞、靶形紅細(xì)胞、異形紅細(xì)胞。鐮狀紅細(xì)胞并不多見，若發(fā)現(xiàn)則有助于診斷。通常采用“鐮變?cè)囼?yàn)”檢查有無鐮狀細(xì)胞；骨髓象示紅系顯著增生，在再生障礙危象時(shí)增生低下，在巨幼細(xì)胞危象時(shí)有巨幼細(xì)胞變；血清膽紅素輕中度增高，溶血危象時(shí)顯著增高。本病的溶血雖以血管外溶血為主，但

5、也存在著血管內(nèi)溶血；血漿結(jié)合珠蛋白降低，血漿游離血紅蛋白可能增高；紅細(xì)胞半衰期測(cè)定顯示紅細(xì)胞生存時(shí)間明顯縮短至515 天正常為(285)天；血紅蛋白電泳顯示HbS占80%以上，HbF增多至2%15%，HbA2正常，而HbA缺如；點(diǎn)突變檢測(cè)方法：Southern Blot斑點(diǎn)雜交PCR-RFLPPCR-測(cè)序PCR-SSCPDHPLCMst IICCTG AGGCCTG TGG突變型野生型1.15kb0.2kb1.35kbMstII: CC/TNAGG 1.35 kb1.15 kb / /S S/S 限制酶切片段電泳后，經(jīng)Southern Blot檢測(cè)已知突變Gene部位和性質(zhì)，合成寡和苷酸探針，

6、32P標(biāo)記，進(jìn)行Southern Blot 雜交/斑點(diǎn)雜交。Normal Gene ProbeMutation S Gene ProbeASO探針診斷allele specific oligonucleotide正常探針突變探針/ /S S/S斑點(diǎn)雜交結(jié)果地中海貧血血紅蛋白血紅蛋白是由珠蛋白和血紅素組成；其中珠蛋白多肽鏈有7種：、G、A、。成年人血紅蛋白中血紅蛋白A（HbA）由兩條珠蛋白肽鏈和兩條珠蛋白肽鏈組成，占血紅蛋白總量的97%以上；血紅蛋白A2（HbA2）由兩條珠蛋白肽鏈和兩條珠蛋白肽鏈組成，占血紅蛋白總量的2%-3%；其余為血紅蛋白F(HbF)；血紅蛋白病可以分為兩大類；一是由于珠蛋

7、白一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化所導(dǎo)致的異常血紅蛋白??；另一類是由于珠蛋白多肽鏈的組成比例改變和珠蛋白含量降低所導(dǎo)致的地中海貧血；16地中海貧血由于組成血紅蛋白的某種肽鏈的合成速率降低，另一種過剩，導(dǎo)致血紅蛋白四聚體組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起的溶血性貧血；最常見的是和b地中海貧血；212112111211地中海貧血表型基因型正常人/靜止型地中海貧血/輕型地中海貧血/HbH病/Hb Bart綜合征/地中海貧血地中海貧血珠蛋白基因缺失或突變導(dǎo)致珠蛋白功能異常；地中海貧血表型和基因型；地貧的基因診斷基因不同程度的缺失引起不同類型的地貧，基因缺失14個(gè)；正?；蛴肂amHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一個(gè)基因時(shí)可

8、得到10kb片段；BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe14kb10kbaa/aaaa/a-aa/- -a-/- - -/- - 正常 缺1 缺2 缺3 缺4b地中海貧血由于b珠蛋白基因缺失或突變導(dǎo)致的溶血性疾病LCRGA1IVS-IIVS-II 在b珠蛋白基因第2內(nèi)含子第654位核苷酸CT突變（IVS-II-654 CT ，簡(jiǎn)稱b654），是中國人所特有的，而且是最常見的b地貧基因突變之一，占中國人b地貧總數(shù)的17%。b654 mRNA的剪接模式ABCb-globin genemRNA(N)mRNA(M)IVS IIVS II654*57973bpIVS IIVS IIN

9、ormalPatient254bp181bpRT-PCR肌營養(yǎng)不良杜氏肌營養(yǎng)不良DMD；X連鎖隱性遺傳??；抗肌萎縮蛋白DMD基因的缺失；DMD基因 2.4 Mb 病例外顯子 1 2 3 4 5 6 7 8Pm34350136476052bp535113多重PCR擴(kuò)增后電泳檢測(cè)結(jié)果血友病血友病是一種遺傳性出血性疾?。话l(fā)病原因是由于患者的血液中先天缺乏某種因子；根據(jù)缺乏因子的不同分為三種類型：血友病甲（缺乏凝血因子VIII，又稱血友病A）、血友病乙（缺乏凝血因子，又稱血友病B）和血友病丙（缺乏凝血因子）；血友病甲和血友病乙均屬X性聯(lián)隱性遺傳，一般由女性傳遞，男性發(fā)病。血友病丙較少見，為常染色體不完

10、全隱性遺傳，男女均可發(fā)??；通常所說的血友病是指血友病甲；50%的A型血友病有FVIII22號(hào)內(nèi)含子倒位引起；20161421.51417.521.5kb20.0kb17.5kb16.0kb14.0kbHA患者的FVIII 基因倒位的DNA印跡分析復(fù)雜基因病的分子診斷腫瘤（癌癥）的分子診斷癌癥癌癥是基因引起的疾病，當(dāng)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的基因發(fā)生突變或損壞時(shí)，使得細(xì)胞增殖失去控制，持續(xù)的生長(zhǎng)及分裂而產(chǎn)生腫瘤。32癌癥的特點(diǎn)幾乎癌組織都是克隆性增殖;患者的所有癌細(xì)胞都起源于單一的癌細(xì)胞;大多數(shù)癌癥不能用單基因遺傳方式解釋;某些類型的癌癥，親屬發(fā)生同類腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加，但不表現(xiàn)孟德爾遺傳;許多癌癥與環(huán)境的物

11、理化學(xué)因子或生物因子有關(guān); 遺傳因素一些特殊的基因突變會(huì)造成特定的癌癥性別乳腺癌以女性為主環(huán)境因素石棉、輻射線、抽煙、油煙壓力持續(xù)的工作壓力食品添加劑亞硝酸的添加病毒感染HPV與子宮頸癌藥物雌激素替代療法與乳腺癌生活方式運(yùn)動(dòng)不足和不當(dāng)飲食造成癌癥的因素細(xì)胞增殖調(diào)控調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)主要有兩大類基因：原癌基因：主要是一些參與促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、修復(fù)和維持體內(nèi)平衡腫瘤抑制基因：是負(fù)責(zé)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、調(diào)控有絲分裂和細(xì)胞復(fù)制 35細(xì)胞周期受細(xì)胞周期素及相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞周期素依賴激酶 (cyclin-dependent kinase，CDK)嚴(yán)格調(diào)控；細(xì)胞周期的每階段都有一組 CDKs與cyclins 交互作用來調(diào)控；C

12、DK的磷酸化及cyclin-CDK抑制劑(CKIs)的活化都會(huì)影響細(xì)胞周期；36細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞系統(tǒng)( Intracellular signal transduction systems)RAS家族是信號(hào)傳遞通路G-protein的成份，藉由跨膜蛋白與Gprotein的結(jié)合將信號(hào)傳至核內(nèi);蛋白質(zhì)-酪胺酸激酶( protein tyrosine kinase) ABL是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞蛋白與信號(hào)傳遞至核內(nèi)有關(guān);核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子; MYC是DNA結(jié)合蛋白，而JUN是轉(zhuǎn)錄因子；細(xì)胞周期有關(guān)的蛋白;調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)的激酶和激酶抑制物；癌基因和抑癌基因原癌基因參與細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分裂和細(xì)胞分化的正?；?；當(dāng)其發(fā)生

13、突變后就會(huì)變成致癌基因；原癌基因是致癌基因的前體；在如放射性物質(zhì)，化學(xué)物質(zhì)和病毒的作用影響下會(huì)引發(fā)癌癥；目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過100種的原癌基因；原癌基因根據(jù)其編碼的蛋白質(zhì)被分類：生長(zhǎng)因子和生長(zhǎng)因子受體蛋白；G蛋白，如由Ras原癌基因編碼的非受體-蛋白激酶；核酸轉(zhuǎn)錄因子；致癌的染色體畸變；病毒來源的致癌基因；40病毒性癌基因只有少數(shù)人類反轉(zhuǎn)錄病毒引起人類癌癥HIV 可以促進(jìn)細(xì)胞增殖和增加體細(xì)胞突變的機(jī)會(huì)，或插入基因組促使鄰近基因活化引起免疫缺陷而間接促進(jìn)腫瘤的產(chǎn)生病毒癌基因插入宿主癌化的原因有些癌基因產(chǎn)物作用如同細(xì)胞癌基因產(chǎn)物有時(shí)插入的病毒癌基因是斷裂的，這些斷裂的序列可能是基因內(nèi)的調(diào)控序列有些病毒

14、癌基因的產(chǎn)物與細(xì)胞癌基因產(chǎn)物共存，可能調(diào)節(jié)癌蛋白活化 腫瘤抑制基因可抑制原癌基因作用的基因，稱腫瘤抑制基因；抑癌基因的蛋白產(chǎn)物能抑制細(xì)胞不正常生長(zhǎng)及抑制細(xì)胞癌化；遺傳學(xué)上一般屬于陰性 ( recessive)；攜帶視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因Rb突變的人是視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的高風(fēng)險(xiǎn)人群；攜帶p53基因突變的人經(jīng)常是李-佛美尼綜合癥的患者；APC基因是與大腸直腸癌發(fā)生有關(guān)的腫瘤抑制基因；BRCA1和BRCA2基因的突變則和乳癌相關(guān)；42Rb正常細(xì)胞中具有活性的RB蛋白（pRB）在細(xì)胞中保持著低磷酸化或無磷酸化的狀態(tài)，它與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子E2F結(jié)合，抑制E2F的活性從而抑制G1期到S期的進(jìn)行，也就抑制了轉(zhuǎn)錄活性

15、。RB蛋白的失活途徑有以下幾種：基因突變導(dǎo)致RB蛋白失活；細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白Cyclin-D與Cdk4（Cyclin-dependent kinase 4，細(xì)胞周期蛋白依賴激酶4）、Cdk6結(jié)合形成的活性物質(zhì)可以使pRB被磷酸化進(jìn)而失活；一些病毒蛋白如腺病毒E1A蛋白、SV40T癌病毒蛋白、乳頭狀病毒HPV16 E7蛋白等可以與pRB上的特異性結(jié)合位點(diǎn)“口袋區(qū)（Pocket region）”進(jìn)行結(jié)合，導(dǎo)致E2F無法在此區(qū)域與RB蛋白結(jié)合，引起蛋白功能的失效；在人體內(nèi)的MDM2蛋白在過度表達(dá)的情況下會(huì)使pRB通過蛋白酶體介導(dǎo)的途徑被降解，使pRB無法發(fā)揮其應(yīng)有的功能；43p53p53蛋白在避免癌癥

16、發(fā)生機(jī)制上扮演重要的角色，如細(xì)胞凋亡 (apoptosis) 、基因組穩(wěn)定性 (genetic stability) 、抑制血管新生 (angiogenesis)等。p53蛋白通過一下機(jī)制避免癌癥發(fā)生:當(dāng)DNA受損時(shí)，p53蛋白能活化DNA修復(fù)蛋白 (DNA repair proteins)；p53蛋白能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)周期停留于G1/S的節(jié)律點(diǎn)上，以達(dá)成DNA損壞辨識(shí)。 若細(xì)胞的DNA受損已不能修復(fù)，p53蛋白能起始細(xì)胞凋亡程序，避免擁有不正常遺傳資訊的細(xì)胞繼續(xù)分裂生長(zhǎng)；活化的p53蛋白能接合于DNA，包括基因p21基因。 p21 (WAF1)接合于G1-S/CDK (CDK2) 和S/CDK復(fù)合體 (此蛋白在G1/S細(xì)胞周期節(jié)律點(diǎn)上有重要功能) 以抑制該復(fù)合體的活性。 當(dāng)p21蛋白 (WAF1) 與CDK2形成復(fù)合體時(shí)，細(xì)胞將無法進(jìn)入到細(xì)胞分裂的階段；44癌癥基因相關(guān)現(xiàn)象 染色體不穩(wěn)定性；癌化的細(xì)胞中常見到三倍體和單倍體；染色體的缺失，還有染色體大片段的重排(插入、重復(fù)、缺失、倒轉(zhuǎn)、易位) ；利用FISH相關(guān)技術(shù)檢測(cè)