1、第3章 細胞生物學(xué)研究方法第1頁本章主要內(nèi)容細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察方法細胞及其組分分析方法細胞培養(yǎng)與細胞工程細胞及其生物大分子動態(tài)改變模式生物與功效基因組研究第2頁第一節(jié) 細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察方法病毒 20-200 nm支原體 0.1-0.3 m細菌 0.5-5.0 m動植物細胞 20-30 m活細胞多是無色透明直徑第3頁 顯微鏡觀察范圍 肉眼觀察范圍第4頁肉眼 0.2 mm光學(xué)顯微鏡 0.2 m電子顯微鏡 0.2 nm掃描隧道顯微鏡樣品制備技術(shù)分辨率第5頁一、光學(xué)顯微鏡 (light microscope)從細胞發(fā)覺、細胞學(xué)說建立，直至今天光學(xué)顯微鏡依然是細胞生物學(xué)研究主要工具1. 目鏡 2. 準(zhǔn)焦螺

2、旋3. 物鏡 4. 載物臺5. 反光鏡第6頁（一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡組成由3 部分組成：光學(xué)放大系統(tǒng)（目鏡與物鏡） 照明系統(tǒng)（光源和聚光鏡）鏡架及調(diào)整系統(tǒng)第7頁（一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡成像放大倒立虛像經(jīng)物鏡形成倒立實像經(jīng)目鏡深入放大成虛像第8頁（一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡分辨率分辨率：顯微鏡最主要性能參數(shù)分辨率是指能區(qū)分開兩個質(zhì)點間最小距離普通光學(xué)顯微鏡最大分辨率0.2 m: 光源波長N : 介質(zhì)折射率, 空氣為1, 油為1.4: 物鏡鏡口角(最大140o, Sin/2 最大0.94 )第9頁 鏡口角是指被觀察點射入物鏡前透鏡邊緣光線之間夾角。 第10頁（一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡樣品制備Figure

3、 9-10, 11a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science )石蠟切片H.E染色第11頁（二）相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡利用光線干涉原理，將相位差轉(zhuǎn)換成振幅差，實現(xiàn)對非染色活細胞觀察A. 當(dāng)兩束光相位相同時，相互干涉結(jié)果使光波振幅增加B. 當(dāng)兩束光相位相反時，則造成光波振幅降低第12頁（二）相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡相差顯微鏡是在普通光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上，添加 “環(huán)狀光闌”和 “相差板”，將光程差或相位差，轉(zhuǎn)換成振幅差體外培養(yǎng)MDCK 細胞在普通（明視場）光學(xué)顯微鏡（A）和相 差顯微鏡（B）下拍攝圖像效果比較第13頁（二）相差顯微鏡和微分干

4、涉顯微鏡微分干涉顯微鏡以平面偏振光為光源，使樣品中厚度上微小區(qū)分轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)分分辨率比普通光鏡提升了一個數(shù)量級錄像增差顯微鏡能夠用來直接觀察顆粒物質(zhì)沿著微管運輸動態(tài)過程Figure 9-9 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science )第14頁Four types of light microscopy (A) The image of a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the cell, a technique known

5、 as bright-field microscopy (B) phase-contrast microscopy (C) Nomarski differential-interference-contrast microscopy (D) dark-field microscopyFigure 9-8 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science )第15頁正置顯微鏡與倒置顯微鏡比較組成一樣，倒置顯微鏡物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)活細胞，含有相差物鏡。第16頁（三）熒光顯微鏡基本原理熒光：分子吸收入射光

6、能量后電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，再從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)而發(fā)出可見光(波長比入射光長)第17頁（三）熒光顯微鏡基本原理光源和光學(xué)系統(tǒng)與普通光學(xué)顯微鏡不一樣關(guān)鍵部件是濾光片系統(tǒng)及專用物鏡鏡頭濾光片系統(tǒng)由激發(fā)濾光片和阻斷濾光片組成第18頁1.照明方式通常為落射式 2.光源為紫外光或其它短波 長光 3.有兩個特殊濾光片 (發(fā)射濾片和阻斷濾片)第19頁熒光顯微鏡光路系統(tǒng)第20頁（三）熒光顯微鏡樣品制備免疫熒光技術(shù)熒光素直接標(biāo)識技術(shù)綠色熒光蛋白(GFP)基因與編碼某種蛋白質(zhì)基因相融合表示兩種以上熒光素標(biāo)識同一樣品，可同時顯示不一樣成份在細胞中定位第21頁（三）熒光顯微鏡應(yīng)用在光鏡水平上，對細胞內(nèi)特異蛋白質(zhì)、核酸

7、、糖類、脂質(zhì)以及一些離子等組分進行定性定位研究有力工具熒光顯微鏡顯示出在有絲分裂中期細胞中，紡錘體微管（綠色）、中期染色體（藍色）和原纖維狀蛋白（fibrillarin）（紅色）等結(jié)組成份第22頁（四）激光掃描共焦顯微鏡以激光為光源聚光鏡和物鏡同時聚焦到同一點上，排除焦平面以外成像利用激光掃描裝置和計算機高速采集與處理匯聚每一個點上信息，形成清楚二維圖像分辨率比普通熒光顯微鏡1.41.7 倍第23頁（四）激光掃描共焦顯微鏡可經(jīng)過“光學(xué) 切片” 疊加后重構(gòu)出樣品三維結(jié)構(gòu)Figure 9-20 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science )(二向

8、)第24頁3D Image Reconstructionzxy第25頁zxyzyy第26頁熒光顯微鏡（a）和激光掃描共焦顯微鏡（b）第27頁二、電子顯微鏡透射電鏡 transmission electron microscope, TEM掃描電鏡 scanning electron microscope, SEM第28頁（一）透射電子顯微鏡 電子束作為光源電磁透鏡聚焦鏡筒高度真空圖像經(jīng)過熒光屏或感光膠片統(tǒng)計第29頁1電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡基本區(qū)分Figure 9-42 (part 1 of 2) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science )

9、第30頁 光鏡 電鏡光源 可見光（300-700nm）電子束 紫外光（200nm）分辨率 200nm 0.2nm透鏡 玻璃透鏡 磁透鏡真空 無要求 1.33*10-310-5Pa電子束波長與加速電壓相關(guān)。當(dāng)加速電壓為50100千伏時，電子束波長約為0.00530.0037納米 第31頁2電子顯微鏡分辨本事與有效放大倍數(shù)電子顯微鏡分辨率可達0.2 nm電鏡分辨本事是指電鏡處于最正確狀態(tài)下分辨率第32頁3電子顯微鏡基本結(jié)構(gòu)電子束照明系統(tǒng)成像系統(tǒng)真空系統(tǒng)統(tǒng)計系統(tǒng)第33頁（二）透射電鏡制樣技術(shù)超薄切片技術(shù)戊二醛和四氧化鋨環(huán)氧樹脂厚度40-50nm重金屬鹽超薄切片黑白圖像第34頁超薄切片技術(shù)顯示細胞超微

10、結(jié)構(gòu)應(yīng)用超薄切片技術(shù)，幾乎能夠觀察細胞各種超微結(jié)構(gòu)Figure 9-45 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science )第35頁（二）透射電鏡制樣技術(shù)負染色技術(shù)觀察線粒體基粒、核糖體、蛋白顆粒及細胞骨架纖維甚至病毒等重金屬鹽沉積在銅網(wǎng)上，而樣品未被染色（故名負染）分辨率可達1.5 nm 左右第36頁（二）透射電鏡制樣技術(shù)冷凍蝕刻技術(shù)包含冰凍斷裂與蝕刻復(fù)型兩步觀察膜斷裂面上蛋白質(zhì)顆粒和膜表面形貌特征，圖像有立體感樣品不需固定包埋 第37頁冰凍蝕刻電鏡照片 第38頁透射電鏡照片與冰凍斷裂和冰凍蝕刻電鏡照片比較第39頁電鏡三維重構(gòu)與低溫電鏡技術(shù)電鏡

11、三維重構(gòu)技術(shù)低溫電鏡技術(shù)電子掃描斷層成像技術(shù)核孔復(fù)合物第40頁（三）掃描電鏡技術(shù)利用電子“探針”在樣品表面進行“掃描”激發(fā)樣品表面放出二次電子成像，能夠得到樣品表面立體形貌第41頁（三）掃描電鏡技術(shù)樣品利用CO2 臨界點干燥法處理樣品觀察前噴鍍一層金膜普通掃描電鏡分辨本事僅為3 nmFigure 9-49 (part 1 of 2) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science )第42頁小結(jié)：光鏡、透射電鏡與掃描電鏡原理比較注意樣品制備技術(shù)差異！第43頁三、掃描隧道顯微鏡探測微觀世界物質(zhì)表面形貌利用量子力學(xué)中隧道效應(yīng)含有原子尺度高分辨本事 能

12、夠在真空、大氣、液體等各種條件下工作非破壞性測量/wiki/File:ScanningTunnelingMicroscope_schematic.png第44頁第二節(jié) 細胞及其組分分析方法第45頁一、用超離心技術(shù)分離細胞組分差速離心：利用不一樣離心速度所產(chǎn)生不一樣離心力，將各種質(zhì)量和密度不一樣亞細胞組分和各種顆粒分開差速離心第46頁一、用超離心技術(shù)分離細胞組分密度梯度離心：經(jīng)過離心力作用使樣品中不一樣組分以不一樣沉降率在密度梯度溶液中沉降，形成不一樣沉降帶第47頁二、細胞成份細胞化學(xué)顯示方法顯色劑與細胞組分中特殊基團結(jié)合經(jīng)過顯色劑在細胞中定位及顏色深淺來判斷蛋白質(zhì)、核酸、多糖和脂質(zhì)在細胞中分布

13、和相對含量第48頁福爾根反應(yīng) Feulgen stain特異顯示細胞內(nèi)呈紫紅色DNA 分布原理：酸水解能夠去除RNA，僅保留 DNA，并除去DNA 上嘌呤脫氧核糖核苷鍵嘌呤，使 脫氧核糖醛基暴露。所暴露自由醛基與希夫試劑 （Schiffs reagent）反應(yīng)呈紫紅色第49頁三、特異蛋白抗原定位與定性細胞內(nèi)特異蛋白顯示可經(jīng)過抗原抗體特異結(jié)合方法得以實現(xiàn)若抗體偶聯(lián)熒光染料，則能夠經(jīng)過熒光顯微鏡、激光共焦顯微鏡觀察為了觀察特異蛋白在細胞內(nèi)精細定位，抗體需偶聯(lián)電子致密物(膠體金)，用電鏡觀察第50頁（一）免疫熒光技術(shù)直接間接免疫熒光技術(shù)（A）間接免疫熒光技術(shù)（B）第51頁（二）免疫電鏡技術(shù)在超微結(jié)構(gòu)

14、水平上研究特異蛋白抗原定位免疫膠體金技術(shù)受到越來越多青睞第52頁四、細胞內(nèi)特異核酸定位與定性原位雜交：用標(biāo)識核酸探針經(jīng)過分子雜交確定特異核苷酸序列在染色體上或在細胞中位置第53頁原位雜交技術(shù)光鏡水平同位素標(biāo)識或熒光素標(biāo)識探針電鏡水平生物素標(biāo)識探針與抗生物素抗體相連膠體金標(biāo)識結(jié)合 第54頁FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)第55頁五、定量細胞化學(xué)分析與細胞分選技術(shù)流式細胞術(shù)第56頁 流式細胞術(shù)是對細胞進行快速定量分析與分選一門技術(shù)。在分析或分選過程中，包在鞘液中細胞經(jīng)過高頻振蕩控制噴嘴，形成包含單個細胞液滴，在激光束照射下，這些細胞發(fā)出散射光和熒光，

15、經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可依據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度細胞亞群，分離純度可達99%。（flow cytometer）。第57頁/resources/education/tutorials/4Intro_Flow/player.html第58頁應(yīng)用1.分析細胞中DNA, RNA 含量和細胞表面分子含量2. 細胞、細胞組分分選第59頁第三節(jié) 細胞培養(yǎng)與細胞工程/The_Origin_of_Hela_Cells第60頁一、細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)分為原代細胞和傳代細胞細胞系：有限細胞系和連續(xù)細胞系細胞株：基本形態(tài)：成纖維樣細胞和上皮樣細胞貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)第61頁動物細胞

16、培養(yǎng)原代細胞 110代以內(nèi)細胞傳代細胞 在體外培養(yǎng)條件下連續(xù)傳代培養(yǎng)細胞接觸抑制 貼壁生長細胞分裂生長到表面接觸時停頓分裂 生長現(xiàn)象細胞系 （Cell line) 極少數(shù)細胞在傳10代后可渡過危 機而傳下去40-50代次并仍保持原來染色體二 倍體數(shù)量及接觸抑制行為 有限細胞系 永生細胞系：細胞發(fā)生了遺傳改變(染色體顯著改 變)，有癌變特點細胞株（Cell strain) 單個細胞增殖而來，全部細胞含有相 同遺傳性狀.第62頁當(dāng)前試驗室中慣用幾個細胞系細胞系名稱細胞類型起源3T3成纖維細胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細胞人BHK21成纖維細胞敘利亞倉鼠PtKl上皮細胞袋鼠L6成肌細胞大鼠PC12嗜鉻細

17、胞大鼠SP2漿細胞小鼠SP20骨髓瘤漿細胞小鼠CHO卵巢細胞中國地鼠第63頁一、細胞培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)：用花藥或花粉在人工培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，經(jīng)過發(fā)育成胚狀體，然后長成單倍體植株；或者通 過愈傷組織誘導(dǎo)分化出芽和根，最終長成植株第64頁一、細胞培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)：體細胞經(jīng)纖維素酶處理去掉細胞壁原生質(zhì)體經(jīng)誘導(dǎo)分化長成植株第65頁二、細胞工程第66頁（一）細胞融合與單克隆抗體技術(shù)細胞融合滅活病毒化學(xué)物質(zhì)（如PEG）電融合同核體（homokaryon）異核體（heterokaryon）合核體（synkaryon）第67頁單克隆抗體與多克隆抗體第68頁單克隆抗體制備第69頁（二）顯

18、微操作技術(shù)與動物克隆細胞拆合：胞質(zhì)體，核體物理法：機械法或短波光化學(xué)法：細胞松弛素顯微鏡下用顯微操作裝置對細胞進行拆合或微量注射，如核移植、顯微注射基因等第70頁克隆羊多莉培育第71頁第四節(jié) 細胞及生物大分子動態(tài)改變Martin D N , Baehrecke E H Development ;131:275-284第72頁一、熒光漂白恢復(fù)技術(shù)親脂性或親水性熒光分子，如熒光素、綠色熒光蛋白等與蛋白或脂質(zhì)耦聯(lián)高能激光束照射使某一區(qū)域熒光不可逆淬滅因為生物膜流動性，淬滅區(qū)熒光強度逐步恢復(fù)測定脂質(zhì)或蛋白質(zhì)在細胞中運動速率第73頁fluorescence photobleaching recovery

19、， FPRFigure 10-36a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science )第74頁二、單分子技術(shù)與細胞生命活動研究指在單分子水平上對生物分子行為(構(gòu)象改變、相互作用、相互識別等）實時動態(tài)檢測以及在此基礎(chǔ)上操縱調(diào)控等第75頁use optical traps to probe the stepping of single molecules of kinesinFluorescent image of single motor proteins (left): Motion of two diffusing kinesin molec

20、ules (green) on a microtubule (red) shown as a time series kymograph. Schematic (right): By dragging diffusing kinesin molecules with laser tweezers over a microtubule, the friction force between the motor and its microtubule track can be measured very precisely第76頁三、酵母雙雜交技術(shù)在體內(nèi)分析蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用利用轉(zhuǎn)錄激活因子DN

21、A 結(jié)合域(DB)和轉(zhuǎn)錄激活域(AD)結(jié)合在一起才含有完整轉(zhuǎn)錄激活功效原理第77頁四、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)分子含有不一樣能級：分子中外層電子，普通處于電子基態(tài)S0 (electronic ground state ) 最低振動能級吸收光能以后，它能夠被激發(fā)到第一電子激發(fā)態(tài)S1任意振動能級。這過程發(fā)生在10-15s時間內(nèi)被激發(fā)分子，首先釋放能量回到S1最低振動能級，此過程發(fā)生在10-12s內(nèi)；然后從S1最低振動能級回到S0各振動能級，并以光子形式釋放能量，即發(fā)射熒光第78頁FRET產(chǎn)生條件D、A都能發(fā)熒光D發(fā)射光譜和A激發(fā)（或吸收）光譜必須有部分重合D和A之間距離必須小于10nm。第

22、79頁FRET 基本原理第80頁檢測活細胞內(nèi)兩種蛋白質(zhì)分子是否直接相互作用假如兩個蛋白相互作用，其中一個蛋白激發(fā)后發(fā)出熒光可激發(fā)另一蛋白產(chǎn)生熒光兩個蛋白未相互作用相互作用第81頁五、放射自顯影技術(shù)利用放射性同位素電離射線對乳膠(含AgBr 或 AgCl)感光作用，對細胞內(nèi)生物大分子進行定性、定位與半定量研究兩個主要步驟：即同位素標(biāo)識生物大分子前體摻入和細胞內(nèi)同位素顯示第82頁依據(jù)試驗要求選擇適當(dāng)同位素研究DNA 合成時通慣用氚（3H）標(biāo)識3H-TdR研究RNA 合成用3H-U在研究含硫蛋白分子代謝時，用 35S 標(biāo)識蛋氨酸和半胱氨酸第83頁對細胞或生物體內(nèi)生物大分子動態(tài)研究和追蹤：連續(xù)標(biāo)識、脈

23、沖標(biāo)識顯微放射自顯影電鏡放射自顯影第84頁胰島B細胞電鏡放射自顯影結(jié)果3H-亮氨酸脈沖標(biāo)識完成10分鐘后，被標(biāo)識胰島素蛋白（黑色銀顆粒）從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進入高爾基復(fù)合體中3H-亮氨酸脈沖標(biāo)識完成45分鐘后，被標(biāo)識胰島素蛋白進入分泌顆粒內(nèi)第85頁第五節(jié) 模式生物與功效基因組研究Figure 1-44 Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition ( Garland Science )第86頁一、細胞生物學(xué)研究慣用模式生物模式生物通常個體較小，輕易培養(yǎng)，操作簡 單，生長繁殖快因為基因在進化上保守性以及遺傳密碼通用性，從一個試驗生物得到相關(guān)基因性質(zhì)或功效方面信息往往也適合用于其它生物第87頁Why do we need model systems?All cells are descended from a common ancestorSimple systems to study a biological questionExtrapolate （外推）results to higher organismsAdvantageous characteristics found in model organismsAmenable to genetic manipulation Reproduce rapidlyTr