1、酶工程酶分子定向進化第1頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三酶分子定向進化 酶分子定向進化又稱為酶分子體外進化，屬于蛋白質(zhì)的非理性設(shè)計，是蛋白質(zhì)工程的新策略，是在試管中模擬達爾文進化的過程，利用分子生物學手段在分子水平創(chuàng)造分子的多樣性，結(jié)合靈敏的篩選技術(shù)，迅速得到理想的突變體。與傳統(tǒng)的理性設(shè)計相比，它不需事先了解蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、活性位點、催化機制等因素，而是人為地創(chuàng)造特殊的進化條件，模擬自然進化機制（隨機突變、基因重組和自然選擇），在體外改造酶基因，產(chǎn)生基因多樣性，并結(jié)合定向篩選（或選擇）技術(shù)，獲得具有某些預期特征的改構(gòu)酶。 第2頁，共73頁，2022年，5月20日，21

2、點1分，星期三 生物的自然進化進化過程： 突變自然選擇遺傳后代進化結(jié)果： 基因多樣性：為完成同一功能所表現(xiàn)出的 多個 基因或同一個基因(同源性) 代謝途徑的多樣性：同樣產(chǎn)物，多條途徑 代謝產(chǎn)物的多樣性：同一底物，不同產(chǎn)物 生物多樣性：整個生態(tài)系統(tǒng)中的生物第3頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三酶的定向進化酶分子的合理設(shè)計(rational design)酶分子的定向進化(directed evolution)第4頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三酶的合理設(shè)計第5頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三體外定向進化的意義理論上，蛋白質(zhì)分子

3、蘊藏著很大的進化潛力，很多功能有待于開發(fā)，這是酶的體外定向進化的基本先決條件。所謂酶的體外定向進化，又稱實驗分子進化，屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計，它不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機制，通過人為地創(chuàng)造特殊的條件，模擬自然進化機制(隨機突變、重組和自然選擇)，在體外改造酶基因，并定向選擇出所需性質(zhì)的突變酶。酶的體外定向進化技術(shù)極大地拓展了蛋白質(zhì)工程學的研究和應用范圍，特別是能夠解決合理設(shè)計所不能解決的問題，為酶的結(jié)構(gòu)與功能研究開辟了嶄新的途徑，并且正在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域逐漸顯示其生命力。第6頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三定向進化的原理在待進化酶基因的PCR擴增反應中，利用

4、Taq DNA聚合酶不具有3-5校對功能的性質(zhì)，配合適當條件，以很低的比率向目的基因中隨機引入突變，構(gòu)建突變庫，憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶(或蛋白質(zhì))，從而排除其他突變體。定向進化的基本規(guī)則是“獲取你所篩選的突變體”。定向進化=隨機突變+選擇。前者是人為引發(fā)的，后者雖相當于環(huán)境，但只作用于突變后的分子群，起著選擇某一方向的進化而排除其他方向突變的作用，整個進化過程完全是在人為控制下進行的第7頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三DNA改組和外顯子改組DNA改組（DNA shuffling）又稱有性PCR(sexual PCR)，原理。 該策略的目的是創(chuàng)造將親本基

5、因群中的突變盡可能組合的機會，導致更大的變異，最終獲取最佳突變組合的酶。通過DNA改組, 不僅可加速積累有益突變，而且可使酶的2個或更多的已優(yōu)化性質(zhì)合為一體。外顯子改組（exon shuffling）類似于DNA改組，兩者都是在各自含突變的片段間進行交換，前者尤其適用于真核生物。在自然界中，不同分子的內(nèi)含子間發(fā)生同源重組，導致不同外顯子的結(jié)合，是產(chǎn)生新蛋白質(zhì)的有效途徑之一。與DNA改組不同，外顯子改組是靠同一種分子間內(nèi)含子的同源性帶動，而DNA改組不受任何限制，發(fā)生在整個基因片段上。第8頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三定向進化的選擇策略1、定向進化中，突變具有隨機性，但

6、通過選擇特定方向的突變限定了進化趨勢，加之控制實驗條件，限定突變種類， 降低突變率，縮小突變庫的容量，這不僅減少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的進化速度。2、通常,篩選方法必須靈敏,至少與目的性質(zhì)相關(guān)。另有一些其他的篩選方法，如加入能產(chǎn)生可見光信號的底物或利用綠色熒光蛋白的熒光性質(zhì)等。高通量的篩選體系第9頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三酶性質(zhì)突變方法枯草桿菌蛋白酶E有機相活性/穩(wěn)定性易錯PCR-內(nèi)酰胺酶總活力/底物專一性DNA改組枯草桿菌蛋白酶BPN穩(wěn)定性 盒式誘變對硝基苯酯酶底物專一性/有機相活性易錯PCR/DNA改組 胸腺嘧啶核苷激酶底物專一性盒式誘變-半乳

7、糖苷酶底物專一性DNA改組綠色熒光蛋白熒光DNA改組核酶底物專一性易錯PCR/DNA改組天冬氨酸酶活性與穩(wěn)定性隨機/定位誘變藥物和疫苗活性/專一性/最佳表達DNA改組酶的體外定向進化應用實例回本章目錄第10頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三分子進化工程的種類第11頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三人工獲取新基因的方法常規(guī)的基因工程方法 生物功能 蛋白質(zhì) 基因新基因的理性設(shè)計和人工合成 根據(jù)已有基因的序列和功能進行設(shè)計基因的直接進化（directed evolution) 可使已有基因獲得新的特性 可獲得自然界中不存在的基因 可解決許多新的理論和應用問

8、題第12頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三基因直接進化的用途提高酶活性天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性提高30倍改變底物特異性和對映異構(gòu)體選擇性 酯酶可水解非天然酯類改善酶的工藝性冷適應和熱適應酶改變酶的拓撲結(jié)構(gòu)二體酶變?yōu)閱误w酶獲取許多新的理論知識第13頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三基因直接進化的用途提改變酶的特性-多功能或單功能酶高酶活性-天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性提高30倍改變底物特異性和對映異構(gòu)體選擇性-酯酶可水解非天然酯類改變酶的工藝性-冷適應和熱適應酶改善酶的穩(wěn)定性-二體酶變?yōu)閱误w酶或單體酶變?yōu)槎w酶獲取許多新的理論知識第14頁，共73頁，202

9、2年，5月20日，21點1分，星期三TLPs 的失活曲線第15頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三TLP-ste突變蛋白的三維結(jié)構(gòu)第16頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三酶拓撲結(jié)構(gòu)的變化第17頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三蛋白質(zhì)的耐熱機制天然耐熱蛋白質(zhì)特性： 減少內(nèi)腔體積；引入鹽橋束；減少表面積/體積比；除去氧化還原活性基；埋藏暴露的疏水基；除去-支鏈氨基酸；除去能脫氨基的氨基酸。 所有耐熱蛋白質(zhì)的氨基酸同源性低至36%，最高不超過75%。分子進化耐熱蛋白質(zhì)特性： 鄰-硝基苯酯酶（p-nitrobenzyl esterase）

10、突變體8g8的了穩(wěn)定性提高了17C，但突變的氨基酸數(shù)僅有13個，與天然酯酶同源性高達97%。第18頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三基因直接進化的步驟突變 基因突變庫的建立篩選 基因突變庫的活體或離體篩選基因復制與遺傳第19頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三建立基因突變庫的方法定向誘變： 點突變堿基刪除、增補和替換隨機誘變： 易錯PCR法(Error-prone PCR) 降低一種dNTP的量（降至5-10） 加入dITP來代替被減少的dNTP 緩沖液中另加0.5mmol/L Mn2+第20頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三第2

11、1頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三易錯PCR 第22頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三同序法（consensus approach）對一組同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列進行比較，以一定的標準程序計算出各氨基酸序列的共有序列；人工合成同序基因后重組表達。 Martin Lehmann等（20002002）把這種方法應用在真菌植酸酶家族設(shè)計合成了同序植酸酶基因，并表達出具熱穩(wěn)定性的同序植酸酶。第23頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三真菌植酸酶aa序列的同序比較 第24頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三 同序植酸酶-1

12、的最適溫度為71，而親代植酸酶的最適溫度為45-55，增加了16-26, 同序植酸酶-1Tm為78，比親代植酸酶增加了15-22，而催化性質(zhì)與大多數(shù)親本植酸酶相似。 第25頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三DNA Shuffling:外顯子、單基因和基因家族的重組裝隨機引物延伸法交錯延伸法隨機片段活體突變: 線狀基因和隨機片段共轉(zhuǎn)化酵母細胞第26頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三基因突變庫的篩選方法Screening the Library and Selecting the Right Clone 平板分析使抗生素失效的酶類(如頭孢菌素酶，b -乳

13、糖酶）提高耐熱性易于觀察的菌落表型（如菌落顏色等）營養(yǎng)缺陷型的輔助篩選 第27頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三噬菌體展示、細胞表面展示 根據(jù)所需要的特性，對經(jīng)Shuffling后的DNA文庫在噬菌體或細菌細胞表面（細菌、纖毛蟲細胞表面）的表現(xiàn)特征進行篩選，獲得提高目的底物親和力的突變子。減少篩選工作量 突變文庫大的突變子庫小的突變子庫單克隆第28頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三噬菌體表面展示(phage surface display) 將外源基因或隨機序列的DNA分子群與噬菌體外殼蛋白基因相連接，使外源DNA所編碼的蛋白質(zhì)以融合蛋白形式表達在噬

14、菌體外殼表面的方法。易于用免疫反應或配體特異性結(jié)合等方法篩得目的克隆。 第29頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三噬菌體展示篩選模式第30頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三DNA Shuffling技術(shù)DNA ShufflingDNA改組DNA洗牌DNA攪亂重排1994年，Stemmer等，用DNA Shuffling技術(shù)體外快速進化蛋白有性PCR法1997年 ，F(xiàn)rance Aronld研究組將DNA Shuffling技術(shù)做了改進交錯延伸法第31頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三What happens after DNA s

15、huffling Generation of a large library of novel genes (chimeras) Selection for improved/desired bio-functions crossovers, deletions, insertions, inversions, point mutationsDarwinian EvolutionNatural selection of existing mutationsDirected Evolution Targeted selection of created mutationsWhat is DNA

16、shuffling?DNA Shuffling的內(nèi)涵第32頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三DNA Shuffling：指DNA分子的體外重組，是基因在分子水平上進行有性重組(Sexual Recombination)。通過改變單個基因(或基因家族，gene family)原有的核苷酸序列，創(chuàng)造新基因，并賦予表達產(chǎn)物以新功能。DNA Shuffling的內(nèi)涵第33頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三項目進化速度進化對象進化周期影響對象突變效率常規(guī)定向進化緩慢進化整個基因組多年完整基因組高DNAShuffling快速進化特定基因/操縱子/病毒幾天部分基因

17、組低DNA Shuffling與常規(guī)定向進化的比較第34頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三How DNA shuffling works - 1How DNA shuffling is done in the tube Random fragmentation of a pool of related genes; Self-priming polymerase reaction and template switching (causing crossovers); PCR amplification with primers of reassembled produc

18、ts 第35頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三How DNA shuffling works - 2Similar mutants generated byerror-prone PCR, random and site-directed mutagenesis . . . . .Single gene shufflinglibrary of point mutantsFamily gene shufflinglibrary of chimerasGenerating chimeras with crossovers of large blocks of sequence

19、s第36頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三DNA 重組裝的過程第37頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三隨機引物PCR和重組裝第38頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三第39頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三連續(xù)易錯PCR (sequential error prone PCR)策略即將一次PCR擴增得到的有用突變基因作為下一次PCR擴增的模板，連續(xù)反復地進行隨機誘變。 第40頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三易錯PCR方法 第41頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三交

20、錯延伸PCR突變法第42頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三磷脂酶熱穩(wěn)定催化活性的分子進化（Jae Kwang Song等，2000）DNA Shuffling技術(shù)的應用第43頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三枯草桿菌蛋白酶E熱穩(wěn)定性的分子進化（Huimin Zhao等，1999）第44頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三進化后的枯草桿菌蛋白酶E正面反面第45頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三耐熱p-硝基苯酯酶的分子進化(Lori Giver等，1998）第46頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，

21、星期三-葡糖苷酶耐熱性的提高(Mara Jesu s Arrizubieta等，2000）第47頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三部分DNA Shuffling技術(shù)的研究成果類 型示 例特 性活性增加倍數(shù)潛在應用領(lǐng)域蛋 白綠色熒光蛋白熒光強度45基礎(chǔ)研究重組蛋白RecA重組率100基礎(chǔ)研究抗 體人源抗體親和性400生物制藥酶天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化特異性10，000生物制藥 -內(nèi)酰胺酶抗生素抗性32，000抗生素枯草桿菌蛋白酶E耐熱性65耐熱時間17200工業(yè)酶細胞因子人類干擾素抗病毒285，000基因治療腫瘤抑制因子P5337半衰期12基因治療代謝途徑砷酸鹽代謝途徑砷酸鹽解毒

22、40生物制藥汞代謝途徑汞解毒12生物制藥第48頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三綠色熒光蛋白 （green fluorescence protein;GFP;green fluorescent protein ）從水母(Aequorea victoria)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的發(fā)光蛋白。分子質(zhì)量為26kDa，由238個氨基酸構(gòu)成，第6567位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成發(fā)光團，是主要發(fā)光的位置。其發(fā)光團的形成不具物種專一性，發(fā)出熒光穩(wěn)定，且不需依賴任何輔因子或其他基質(zhì)而發(fā)光。綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)化入宿主細胞后很穩(wěn)定，對多數(shù)宿主的生理無影響，是常用的報道基因。 第49頁，共73頁

23、，2022年，5月20日，21點1分，星期三 2008年諾貝爾化學獎得主2008年的諾貝爾化學獎授予了從事有關(guān)“綠色熒光蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn),表達和發(fā)展”并取得重要成就的三位科學家:下村修、馬丁查爾菲和錢永健。 第50頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三熒光蛋白在三大領(lǐng)域“發(fā)光”目前，熒光蛋白在很多領(lǐng)域都發(fā)揮著重大作用，包括有毒物質(zhì)檢測、神經(jīng)生物分析及轉(zhuǎn)基因動物研究等。比如，可用熒光蛋白檢測水井中是否含有砷(俗稱砒霜)。砷中毒問題在東南亞地區(qū)較為嚴重，常使很多人集體中毒。研究人員已經(jīng)研發(fā)出帶有熒光蛋白的抗砷性細菌，只要水中含有砷，細菌就會發(fā)出熒光并被儀器檢測到，提醒人們不要飲用。G

24、FP還可用作檢測TNT(一種烈性炸藥)、重金屬等。熒光蛋白在神經(jīng)生理學上的應用也很受人關(guān)注，在它的幫助下，研究人員能看到以前所不能見的新世界，包括大腦神經(jīng)細胞的發(fā)育過程和癌細胞的傳播方式等。熒光蛋白的另一種重要應用就是轉(zhuǎn)基因動物。近年來，美國、韓國、日本等國曾多次培養(yǎng)出“發(fā)光的動物”，我國也在去年12月首次培養(yǎng)出綠色熒光轉(zhuǎn)基因豬。轉(zhuǎn)基因動物是指，將一種動物基因在另一種動物體內(nèi)表達的過程，在遺傳研究、器官移植、特種改良等領(lǐng)域具有重大意義。熒光蛋白由于結(jié)構(gòu)簡單可作為“報告基因”(一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因)，大大簡化了轉(zhuǎn)基因動物的培養(yǎng)過程。第51頁，共73頁，2022年，5月20日，21點

25、1分，星期三Random-priming recombination(RPR)隨機引物重組法第52頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三隨機挑取枯草桿菌蛋白酶RPR庫中10個克隆序列第53頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三DNA重組裝原理圖(DNA shuffling)1. DNaseI產(chǎn)生隨機片段；2. 隨機片段變性；3. 隨機片段復性；4. 延伸 反復重復2-4步后，可獲得全長DNA片段 第54頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三隨機挑取枯草桿菌蛋白酶DNA重組裝庫中10個克隆序列第55頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三Table 1 Frequency of active clones obtained after DNA shuffling under different conditionsa As suggested in ref. 7.b Clones exhibiting 10% wild-type subtilisin E activity. 第56頁，共73頁，2022年，5月20日，21點1分，星期三DNA重組裝過