1、延時(shí)符目錄 Contents02延時(shí)符第五節(jié) 單核細(xì)胞增生李斯特菌檢驗(yàn)技術(shù) GB 4789.302016 一、單核細(xì)胞增生李斯特菌生物學(xué)特性 二、單核細(xì)胞增生李斯特菌定性檢驗(yàn)（第一法） 三、單核細(xì)胞增生李斯特菌平板計(jì)數(shù)法（第二法） 四、單核細(xì)胞增生李斯特菌MPN 計(jì)數(shù)法（第三法）一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性04延時(shí)符概況單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM）簡(jiǎn)稱單增李斯特菌，歸屬李斯特氏菌菌屬，該屬含有6個(gè)菌種，分別為單核細(xì)胞增生李斯特菌(L. monocytogenes）、格氏李斯特菌(L. grayi)、斯氏李斯特菌(L. seeligeri

2、)、威氏李斯特菌(L. welshimeri) 、伊氏李斯特菌(L. ivanovii)、英諾克李斯特菌(L. innocua)。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes）和伊氏李斯特菌(L. ivanovii)（又稱綿羊李斯特菌）具有致病性，其余菌種均為非致病菌；單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes）是李斯特菌屬的代表種，是李斯特氏菌屬中唯一能引起人類疾病的菌種。一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性04延時(shí)符概況單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes）能引起新生兒敗血癥、腦膜炎、孕婦流產(chǎn)等疾病，具有較高的臨床死亡率(20%70%)。單核

3、細(xì)胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes）廣泛存在于自然界中，耐低溫，4 的環(huán)境中能增殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes）主要污染乳及乳制品、肉類制品、生蔬菜、冰淇淋以及水產(chǎn)品等。 一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性04延時(shí)符菌體形態(tài)特征單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes）為規(guī)則短桿狀，兩端純圓，大小為0.4 m 0.5 m 0.5 m2.0 m，多單生，偶有排列為V型或短鏈。 G+，無(wú)芽孢，一般不形成莢膜，但在營(yíng)養(yǎng)豐富的生境中也可形成莢膜。20 25 培養(yǎng)可產(chǎn)生4根周生鞭毛，有動(dòng)力，穿刺培

4、養(yǎng)2-5天可見(jiàn)“倒傘狀”生長(zhǎng)。肉湯培養(yǎng)物在顯微鏡下可見(jiàn)翻跟斗運(yùn)動(dòng)。一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性04延時(shí)符培養(yǎng)特征需氧或兼性厭氧，生長(zhǎng)溫度范圍1 45 ，最適生長(zhǎng)溫度30 37 ，4 或以下溫度能緩慢增殖。對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，在一般培養(yǎng)基上均能良好的生長(zhǎng)，在血清或全血瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，加入0.21葡萄糖和23甘油更利于其生長(zhǎng)。 一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性04延時(shí)符菌落特征普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上為微帶珠光露水樣菌落，細(xì)小，半透明、邊緣整齊；45度斜射光下，菌落呈特征性藍(lán)綠光澤。血平板上培養(yǎng)的菌落呈灰白色、圓潤(rùn)，型溶血，溶血環(huán)直徑達(dá)3 mm，4 放置4 d 后, 菌落和溶血環(huán)直徑均

5、增至5 mm，呈典型的奶油滴狀。一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性04延時(shí)符菌落特征液體培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h24 h后，呈輕度渾濁，數(shù)天后產(chǎn)生黏稠的沉淀，振蕩時(shí)呈螺旋狀上升，繼續(xù)培養(yǎng)可形成顆粒狀沉淀，不形成菌環(huán)、菌膜。半固體培養(yǎng)基中37 、24 h穿刺培養(yǎng)，沿穿刺線呈云霧狀，隨后緩慢擴(kuò)散，在培養(yǎng)基表面下3 mm5 mm處呈傘狀。一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性04延時(shí)符生化特征單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes）37 、24 h培養(yǎng),可以分解葡萄糖、果糖、海藻糖、水楊苷、鼠李糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不分解棉子糖、肌醇、菊淀粉、衛(wèi)茅醇、側(cè)金盞花醇、木糖和甘露醇。MR和VP試

6、驗(yàn)陽(yáng)性，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，硫化氫陰性。 一、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性04延時(shí)符血清分型單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes）的血清型是由O抗原（菌體抗原）和H抗原（鞭毛抗原）的特異性組合決定，共有13種血清型：1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e和7。O抗原用阿拉伯?dāng)?shù)字表示，H抗原用英文字母表示。 二、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)-GB 4789.30-2016 第一法 04延時(shí)符單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)程序流程圖 適用于食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的定性檢驗(yàn)。 二、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)-GB 4789

7、.30-2016 第一法 04延時(shí)符 增菌 以無(wú)菌操作取樣品25 g(mL)加入到含有225 mL LB1 增菌液的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1 min2 min；或放入盛有225 mL LB1 增菌液的均質(zhì)杯中，以8,000 r/min10,000 r/min均質(zhì)1 min2 min。于30 1 培養(yǎng)24 h2 h，移取0.1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mLL B2 增菌液內(nèi)，于30 1 培養(yǎng)24 h2 h。分離 取LB2 二次增菌液劃線接種于李斯特氏菌顯色平板和PALCAM 瓊脂平板，于36 1 培養(yǎng)24 h48 h，觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落。典型菌落在PALCAM 瓊脂平板上為小的圓形灰

8、綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷；在李斯特氏菌顯色平板上的菌落特征，參照產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行判定。二、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)-GB 4789.30-2016 第一法 04延時(shí)符初篩 自選擇性瓊脂平板上分別挑取3個(gè)5個(gè)典型或可疑菌落，分別接種木糖、鼠李糖發(fā)酵管，于36 1 培養(yǎng)24 h2 h，同時(shí)在TSA-YE平板上劃線，于36 1 培養(yǎng)18 h24 h，然后選擇木糖陰性、鼠李糖陽(yáng)性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行鑒定。二、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)-GB 4789.30-2016 第一法 04延時(shí)符鑒定(或選擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)等) 染色鏡檢動(dòng)力試驗(yàn) 生化鑒定 過(guò)氧化氫

9、酶試驗(yàn)，過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性反應(yīng)的菌落繼續(xù)進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)和 MR-VP試驗(yàn)。 溶血試驗(yàn) 協(xié)同溶血試驗(yàn)cAMP(可選項(xiàng)目)小鼠毒力試驗(yàn)(可選項(xiàng)目)二、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)-GB 4789.30-2016 第一法04延時(shí)符結(jié)果與報(bào)告 綜合以上生化試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)的結(jié)果，報(bào)告25 g(mL)樣品中檢出或未檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。 三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB 4789.30-2016第二法 04延時(shí)符單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)程序流程圖 適用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌含量較高的食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的計(jì)數(shù)。三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB 4789.30-201

10、6 第二法 04延時(shí)符樣品的稀釋以無(wú)菌操作取樣品25 g(mL)，放入盛有225 mL 緩沖蛋白胨水或無(wú)添加劑的LB肉湯的無(wú)菌均質(zhì)袋內(nèi)(或均質(zhì)杯)內(nèi)，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1 min2 min或以8,000 r/min10,000 r/min均質(zhì)1 min2 min。液體樣品，振蕩混勻，制成1:10的樣品勻液。用1 mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL緩沖蛋白胨水或無(wú)添加劑的LB肉湯的無(wú)菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面)，振搖試管，制成1:100的樣品勻液。依次制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無(wú)菌吸管或吸頭。三

11、、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB 4789.30-2016 第二法 04延時(shí)符樣品的接種根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2個(gè)3個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液)，每個(gè)稀釋度的樣品勻液分別吸取1 mL以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的接種量分別加入3塊李斯特氏菌顯色平板，用無(wú)菌L棒涂布整個(gè)平板，注意不要觸及平板邊緣。培養(yǎng) 通常情況下，涂布后，將平板靜置10 min；如樣液不易吸收，可將平板放在培養(yǎng)箱36 1 培養(yǎng)1 h，等樣品勻液被吸收后翻轉(zhuǎn)平皿，倒置于培養(yǎng)箱，36 1 培養(yǎng)24 h48 h。三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB 4789.30-2016 第二

12、法 04延時(shí)符確認(rèn)實(shí)驗(yàn)-初篩典型菌落確定： 李斯特氏菌顯色平板上的菌落特征以產(chǎn)品說(shuō)明為準(zhǔn)。典型菌落挑選：從典型菌落中任選5個(gè)菌落(小于5個(gè)全選)，分別初篩和鑒定。自選擇性瓊脂平板上分別挑取3個(gè)5個(gè)典型或可疑菌落，分別接種木糖、鼠李糖發(fā)酵管，于36 1 培養(yǎng)24 h2 h，同時(shí)在TSA-YE平板上劃線，于36 1 培養(yǎng)18 h24 h，然后選擇木糖陰性、鼠李糖陽(yáng)性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行鑒定。 確認(rèn)實(shí)驗(yàn)-鑒定 ：染色鏡檢、動(dòng)力試驗(yàn)、生化鑒定、溶血試驗(yàn)、協(xié)同溶血試驗(yàn)cAMP(可選項(xiàng)目)三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB 4789.30-2016 第二法 04延時(shí)符典型菌落計(jì)數(shù)以及對(duì)應(yīng)的計(jì)算公式的

13、應(yīng)用計(jì)數(shù)范圍要求：選擇有典型菌落的平板，菌落數(shù)合計(jì)在15 CFU150 CFU之間的平板，計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。計(jì)算公式1計(jì)算公式2.三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB 4789.30-2016 第二法 04延時(shí)符典型菌落計(jì)數(shù)以及對(duì)應(yīng)的計(jì)算公式的應(yīng)用計(jì)數(shù)范圍要求：選擇有典型菌落的平板，菌落數(shù)合計(jì)在15 CFU150 CFU之間的平板，計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。公式1適用情況只有一個(gè)稀釋度的平板菌落數(shù)在15 CFU150 CFU 之間且有典型菌落，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落。所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于15 CFU且有典型菌落，應(yīng)計(jì)數(shù)最低稀釋度平板上的典型菌落。某一稀釋度的平板菌落數(shù)大于150 CFU

14、 且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒(méi)有典型菌落，應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落。所有稀釋度的平板菌落數(shù)大于150 CFU且有典型菌落，應(yīng)計(jì)數(shù)最高稀釋度平板上的典型菌落。所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在15 CFU150 CFU之間且有典型菌落，其中一部分小于15 CFU或大于150 CFU時(shí)，應(yīng)計(jì)數(shù)最接近15 CFU或150 CFU的稀釋度平板上的典型菌落。三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB 4789.30-2016 第二法 04延時(shí)符公式1應(yīng)用舉例:計(jì)算并報(bào)告下表檢測(cè)結(jié)果 樣品序號(hào)樣品勻液稀釋度菌落總數(shù)（平板1/平板2/平板3）典型菌落數(shù)（平板1/平板2/平板3）初篩做鑒定的典型菌落數(shù)鑒

15、定為單核細(xì)胞增生李斯特菌的菌落數(shù)結(jié)果報(bào)告110-167（23/24/20）30（8/12/10）5410-212（3/5/4）1（0/1/0）11210-113（5/6/2）4（2/2/0）4310-28（2/3/3）2（0/1/1）22310-1194（68/60/66）65（18/26/21）5310-279（21/30/28）0（0/0/0）00410-1196（58/68/70）40（12/18/10）5210-2158（45/53/60）25（8/12/5）54510-1154（36/53/65）15（6/5/4）5310-29（2/3/4）3（0/1/2）32三、單核細(xì)胞增生李斯特

16、氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB 4789.30-2016 第二法 04延時(shí)符公式1應(yīng)用舉例 結(jié)果如下： 根據(jù)計(jì)數(shù)公式的要求，對(duì)表內(nèi)數(shù)據(jù)與GB 4789.30-2016的計(jì)數(shù)要求進(jìn)行比對(duì)分析，其中樣品序號(hào)15適用計(jì)算公式1，按照公式1進(jìn)行計(jì)算具體計(jì)算如下：樣品1：T=（8+12+10）450.1=240；報(bào)240 CFU/g(mL)或2.4102 CFU/g(mL)。樣品2：T=（2+2+0）340.130；報(bào)30 CFU/g(mL)。樣品3：T=(18+26+21) 350.1=390; 報(bào)390 CFU/g(mL)或3.9102 CFU/g(mL)。樣品4：T=(8+12+5) 450.01=2000

17、; 報(bào)2,000 CFU/g(mL)或2.0103 CFU/g(mL)。樣品5：T=(6+5+4) 350.1=90; 報(bào)90 CFU/g(mL)。注：菌落數(shù)小于100CFU 時(shí),按“四舍五入”原則修約,以整數(shù)報(bào)告；菌落數(shù)大于或等于100CFU 時(shí)，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后,取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù);也可用10的指數(shù)形式來(lái)表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字；T0,則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。 三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB 4789.30-2016 第二法 04延時(shí)符典型菌落計(jì)數(shù)以及對(duì)應(yīng)的計(jì)算公式的應(yīng)用計(jì)數(shù)范圍要求：選擇有典型菌落的平板，菌落數(shù)合

18、計(jì)在15 CFU150 CFU之間的平板，計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。公式2適用情況2個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)均在15 CFU150 CFU之間且均有典型菌落。 三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB 4789.30-2016 第二法 04延時(shí)符公式2應(yīng)用舉例： :計(jì)算并報(bào)告下表檢測(cè)結(jié)果 樣品序號(hào)樣品勻液稀釋度菌落總數(shù)（平板1/平板2/平板3）典型菌落數(shù)（平板1/平板2/平板3）初篩做鑒定的典型菌落數(shù)鑒定為單核細(xì)胞增生李斯特菌的菌落數(shù)結(jié)果報(bào)告110-1122（32/40/50）3（12/8/11）5210-270（28/41/1）16（6/9/1）53具體計(jì)算如下： T=(12+8+11) 25 (6

19、+9+1) 35 1.10.1=733.09; 報(bào)730 CFU/g(mL)或7.3102 CFU/g(mL)。注：菌落數(shù)小于100CFU 時(shí),按“四舍五入”原則修約,以整數(shù)報(bào)告；菌落數(shù)大于或等于100CFU 時(shí)，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后,取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù);也可用10的指數(shù)形式來(lái)表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字；T0,則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。 三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法-GB 4789.30-2016 第二法04延時(shí)符結(jié)果與報(bào)告 根據(jù)計(jì)算結(jié)果，報(bào)告每g(mL)樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌數(shù)，以CFU/g(mL)表示；如T 值為0，則

20、以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。四、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌MPN 計(jì)數(shù)法-GB 4789.30-2016 第三法 04延時(shí)符適用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌含量較低(100 CFU/g)而雜菌含量較高的食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的計(jì)數(shù)，特別是牛奶、水以及含干擾菌落計(jì)數(shù)的顆粒物質(zhì)的食品。四、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌MPN計(jì)數(shù)法-GB 4789.30-2016第三法04延時(shí)符樣品的稀釋以無(wú)菌操作稱取樣品25 g(mL)，放入盛有225 mL 緩沖蛋白胨水或無(wú)添加劑的LB肉湯的無(wú)菌均質(zhì)袋內(nèi)(或均質(zhì)杯)內(nèi)，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1 min2 min或以8,000 r/min10,000 r/min均質(zhì)1

21、min2 min。液體樣品，振蕩混勻，制成1:10的樣品勻液。用1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL緩沖蛋白胨水或無(wú)添加劑的LB肉湯的無(wú)菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面)，振搖試管或換用1支1 mL無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。依次制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無(wú)菌吸管或吸頭。四、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌MPN計(jì)數(shù)法-GB4789.30-2016 第三法04延時(shí)符接種和培養(yǎng)根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選取3個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液)，接種于10 mL LB1肉湯，每一稀釋度接種3管，每管接種1 mL(