1、關(guān)于常用分子生物學(xué)技術(shù)第1頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四第一節(jié) 分子雜交技術(shù)具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下 按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則退火形成雙鏈的過(guò)程。雜交的雙方是待測(cè)核酸和已知核酸序列，已知核酸序列稱探針。第2頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開(kāi)成兩條單鏈的過(guò)程。雙鏈間氫鍵的斷裂！2、DNA變性的本質(zhì)1、DNA變性的概念第3頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA復(fù)性過(guò)程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同

2、一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex) 。第4頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四變性復(fù)性 DNA-DNA雜交雙鏈分子第5頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四核酸分子雜交第6頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四探針技術(shù) 探針 (probe) 一小段用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。 第7頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月2

3、0日，1點(diǎn)29分，星期四一、Southern印跡此技術(shù)由Southern 1975年首先設(shè)計(jì)。被檢測(cè)對(duì)象為DNA。第8頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四帶有DNA片段的凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳至膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）上轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜Southern 印跡雜交的技術(shù)流程第9頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四從凝膠上轉(zhuǎn)移DNA第10頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四二、Northern 印跡應(yīng)用DNA探針檢測(cè)特異mRNA的一種雜交技術(shù)，主要用于分析mRNA

4、的轉(zhuǎn)錄或mRNA分子大小。其方法類似于Southern印跡雜交。第11頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四三、Western 印跡將待檢測(cè)蛋白質(zhì)（或酶）經(jīng)SDS電泳并染色后，轉(zhuǎn)移到濾膜上固定，再用“抗體-抗原”免疫反應(yīng)或“DNA-protein”結(jié)合反應(yīng)鑒別濾膜上的蛋白質(zhì)。第12頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四三種 印跡比較1. DNA印跡技術(shù) (Southern blotting) 檢測(cè)DNA2. RNA印跡技術(shù) (Northern blotting) 檢測(cè)RNA3. 蛋白質(zhì)的印跡分析 (Western blotting) 檢測(cè)蛋白質(zhì)第13頁(yè)，

5、共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四三種印跡技術(shù)的比較第14頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四四、原位雜交 (in situ hybridization)1、定義： 將標(biāo)記探針與細(xì)胞或組織中核酸按堿基配對(duì)原則進(jìn)行特異性雜交，并應(yīng)用組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位或基因表達(dá)的檢測(cè)技術(shù)稱原位雜交（hybridization in situ)。2、操作步驟： 載片的清潔與處理；組織與細(xì)胞的固定；探針； 濕盒第15頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四熒光原位雜交第16頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星

6、期四五、生物芯片chip生物芯片（biochip）是近年來(lái)在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高新技術(shù)。是將核酸、多肽或蛋白質(zhì)分子、組織切片和細(xì)胞等制成探針，以預(yù)先設(shè)計(jì)的方式有序地、高密度地排列在玻片或硅片等載體上，構(gòu)成二維分子陣列，然后與待測(cè)生物樣品靶分子雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)實(shí)現(xiàn)快速、高效和高通量樣品檢測(cè)。因該技術(shù)常用玻片或硅片等材料作為固相支持物，且在制備過(guò)程中模擬計(jì)算機(jī)芯片的制備技術(shù)，所以稱之為生物芯片。其原理也是分子雜交技術(shù)。第17頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四微型化高通量提高信息量平行化提高信息的可比性微量化降低待檢樣品用量自動(dòng)化提高工作效率低成本可迅速普

7、及推廣生物芯片技術(shù)的特點(diǎn)第18頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四生物芯片使用步驟芯片制作把探針固定于載體表面樣品處理目標(biāo)分子富集分子間的雜交結(jié)果檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析第19頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四生物芯片分類（1）基因芯片（2）蛋白質(zhì)芯片（3）細(xì)胞芯片（4）組織芯片第20頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四基因芯片概念：基因芯片，也叫DNA芯片，是將大量特定序列的DNA片段（分子探針）有序地固定在經(jīng)過(guò)處理后的尼龍膜、玻璃片、硅片等支持物上 ，從而能快速、準(zhǔn)確地對(duì)大量DNA分子序列進(jìn)行測(cè)定和分析的一種類似電腦的芯片。原理：利

8、用堿基的互補(bǔ)配對(duì)原則（DNA分子雜交）材料：分子探針，尼龍膜，玻璃片，硅片1、基因芯片第21頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四制作基因芯片的大致步驟第22頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四第23頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四可在基因組水平進(jìn)行基因表達(dá)和發(fā)現(xiàn)研究、突變、序列測(cè)定等，已方泛應(yīng)用于基因組研究和人類疾病的診斷等多領(lǐng)域。基因芯片應(yīng)用第24頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四應(yīng)用基因微矩陣芯片研究宮頸癌相關(guān)基因表達(dá)DNA微點(diǎn)陣已廣泛和流行的用于疾病診斷、基因組比較、以及新型癌癥的分類。第25頁(yè)

9、，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四2、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片（protein chip）, 又稱蛋白質(zhì)微陣列，是指以蛋白質(zhì)或多肽作為配基，將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列；用標(biāo)記了熒光的蛋白質(zhì)或其它分子與之作用，洗去未結(jié)合的成分，經(jīng)熒光掃描等檢測(cè)方式測(cè)定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，來(lái)分析蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與其它分子之間的相互作用關(guān)系。 第26頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用特異性抗原抗體的檢測(cè) 生化反應(yīng)的檢測(cè) 疾病診斷 對(duì)疾病分子機(jī)制的研究 藥物篩選及新藥的研制開(kāi)發(fā) 第27頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)2

10、9分，星期四3、細(xì)胞芯片又稱細(xì)胞微陣列，是以活細(xì)胞為研究對(duì)象的一種生物芯片，在芯片上完成對(duì)細(xì)胞的捕獲、固定、平衡、運(yùn)輸、刺激及培養(yǎng)的精確控制，并通過(guò)微型化的化學(xué)分析方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞樣品的高通量、多參數(shù)、連續(xù)原位信號(hào)檢測(cè)和細(xì)胞組分的理化分析等。 第28頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四4、組織芯片組織芯片, 又稱組織微陣列，是將不同生物體的組織按預(yù)先設(shè)計(jì)或研究需要排列在固相載體上所形成的組織微陣列。組織芯片最大的優(yōu)勢(shì)在于可以對(duì)大量組織標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，只需一次實(shí)驗(yàn)過(guò)程即可完成，縮短時(shí)間，減少誤差，提高了可比性。 第29頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星

11、期四第二節(jié) 目的基因制備技術(shù)第30頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 概念 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外擴(kuò)增特異DNA片斷的技術(shù),能在短時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)百萬(wàn)個(gè)特異DNA序列的拷貝。第31頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四（一）PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)第32頁(yè)，共110頁(yè)，20

12、22年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物第33頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5AUCG

13、CG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶第34頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1971年，Khorana提出：經(jīng)過(guò)DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因。但由于測(cè)序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了第35頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶

14、鏈反應(yīng)的發(fā)明1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coli DNA聚合酶進(jìn)行PCR耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)Kary Mullis “我不大喜歡動(dòng)手,我寧肯不動(dòng)手,我不喜歡做費(fèi)力的事。作為一個(gè)發(fā)明家,重要的一點(diǎn)是為解決某些問(wèn)題而盡力設(shè)計(jì)一個(gè)簡(jiǎn)捷的動(dòng)手方案。” 第36頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四1、 PCR擴(kuò)增DNA片段的原理 PCR是在模板DNA、引物和四中脫氧核苷酸

15、等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應(yīng)，整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程分三步：（二）PCR技術(shù)的基本原理和操作第37頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四 變性：加熱，模板DNA形成兩條單鏈 退火：降溫，模板單鏈DNA與引物配對(duì)結(jié)合 延伸：在DNA聚合酶及鎂離子等存在的條件下， 引物3-端向前延伸，合成與模板配對(duì)的新鏈第38頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四 上述三步為一個(gè)循環(huán)，經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)DNA量增加一倍。新合成的鏈又可以成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過(guò)25-30個(gè)循環(huán)后目的DNA就可以擴(kuò)增106109 倍。 通過(guò)循環(huán)可以提高PCR的特異性。第39頁(yè)，共110頁(yè)，

16、2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四1）模板DNA2）特異性引物3）耐熱DNA聚合酶4）dNTPs5）Mg2+6）緩沖液 2、PCR的基本成份第40頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四模板DNA953、PCR的基本操作第41頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)50引物1引物2DNA引物第42頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶第43頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29

17、分，星期四PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72第1輪結(jié)束95第2輪開(kāi)始第44頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)955072TaqTaqTaqTaq第45頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72第2輪結(jié)束第46頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四第47頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四是不是循環(huán)次數(shù)越多越好？PCR擴(kuò)增的平臺(tái)效應(yīng)第48頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分

18、，星期四引物設(shè)計(jì)（1) 序列應(yīng)位于高度保守區(qū)，與非擴(kuò)增區(qū)無(wú)同源序列。（2）引物長(zhǎng)度以15-40 bp為宜。（3）堿基盡可能隨機(jī)分布。（4）引物內(nèi)部避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補(bǔ)序列。（6）引物3端為關(guān)鍵堿基；5端無(wú)嚴(yán)格限制第49頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)特異性強(qiáng)靈敏度高操作簡(jiǎn)單、省時(shí)對(duì)待檢原始材料質(zhì)量要求低高效率的基因擴(kuò)增技術(shù)第50頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四引物引物3555基因組PCR技術(shù)的特點(diǎn)：擴(kuò)增特異的DNA片段第51頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四1、目的基因的克隆2、基

19、因的體外突變3、DNA和RNA的微量分析4、DNA序列測(cè)定5、基因突變分析（三）PCR的主要應(yīng)用第52頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理第53頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）以細(xì)胞內(nèi)總RNA或mRNA為材料進(jìn)行體外擴(kuò)增的技術(shù)。主要用于克隆 cDNA、合成cDNA探針，檢測(cè)RNA病毒、分析基因表達(dá)等逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA方式：以隨機(jī)進(jìn)行的PCR擴(kuò)增所需的下游引物作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物以oligo(dT)作為引物，mRNA3末端polyA尾與之互補(bǔ)以人工合成的隨機(jī)序列六核苷酸混合物作為引物，進(jìn)行擴(kuò)增。第54頁(yè)

20、，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四reverse transcription逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增第55頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四二、cDNA文庫(kù) cDNA library第56頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四 一個(gè)生物體的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶部分酶切后，將酶切片段插入到載體DNA分子中，所有這些插入了基因組DNA片段的載體分子的集合體，將包含這個(gè)生物體的整個(gè)基因組，也就是構(gòu)成了這個(gè)生物體的基因文庫(kù)(gene library)。第57頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分

21、，星期四 cDNA文庫(kù)是以特定的組織或細(xì)胞mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成的互補(bǔ)DNA（cDNA）與適當(dāng)?shù)妮d體（常用噬菌體或質(zhì)粒載體）連接后轉(zhuǎn)化受體菌形成重組DNA克隆群，這樣包含著細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織或細(xì)胞的cDNA文庫(kù)。 cDNA文庫(kù)具有組織或細(xì)胞特異性。 cDNA文庫(kù)顯然比基因組DNA文庫(kù)小得多，能夠比較容易從中篩選克隆得到細(xì)胞特異表達(dá)的基因。 第58頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四（一）從cDNA文庫(kù)建立第59頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四基因組DNA文庫(kù)第60頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分

22、，星期四1）制備靶基因的核酸探針2）若靶基因表達(dá)蛋白已知，可反推部分基因序列，制備寡核苷酸探針3）差異顯示雜交（二）cDNA文庫(kù)目的基因的篩選 利用核酸分子雜交分離目的基因：第61頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四 差異顯示雜交不需要核苷酸序列信息，而耍擁有兩種不同的細(xì)胞群體：目的基因正常表達(dá)細(xì)胞群和在基因不表達(dá)細(xì)胞群。制備兩種不同mRNA提取物，一是含有目的基因mRNA的總mRNA群體，一是不含有目的基因mRNA種的總mRNA群體。因此，可以通過(guò)這兩種總mRNA(或是它們的cDNA拷貝)為探針的平行雜交，對(duì)由表達(dá)目的基因的細(xì)胞總mRNA構(gòu)建的克隆庫(kù)進(jìn)行篩選。當(dāng)使用存在

23、目的基因的mRNA探針時(shí)，所有包含著重組體的菌落都呈陽(yáng)性反應(yīng)，在x光底片上呈現(xiàn)黑色斑點(diǎn)，而使用不存在目的基因的mRNA探針時(shí)，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈陽(yáng)性反應(yīng)，在x光底片上呈現(xiàn)黑色斑點(diǎn)。比較這兩種底片井對(duì)照原平板，便可以挑選出含目的基因的菌落。 第62頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四1）在基因組水平上研究某基因?qū)ζ鞴?、組織和細(xì)胞在個(gè)體發(fā)育中的影響2）cDNA文庫(kù)的篩選比較簡(jiǎn)單易行，尤其適用于某些特殊組織基因的制備3）由于每一個(gè)cDNA克隆都包含一種mRNA序列，這樣在篩選中出現(xiàn)假陽(yáng)性的概率就會(huì)很低4）為了測(cè)定mRNA序列，利用它的cDNA拷貝序列就

24、可以有效分析外顯子的基因結(jié)構(gòu)（三）cDNA文庫(kù)的優(yōu)越性第63頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列。三、化學(xué)合成第64頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四化學(xué)合成法主要應(yīng)用作為核酸分子雜交探針作為引物，用于測(cè)序和PCR用于制備小的基因、不易獲得基因或用于改造天然基因作為DNA末端改造中的接頭用于制備cDNA，篩選克隆基因，或基因定位或基因的定點(diǎn)突變第65頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四第三節(jié) 基因敲除技術(shù) 基因敲除（geneknockout）又稱基因剔除，或基因打靶（genetargetin

25、g）是指通過(guò)DNA定點(diǎn)同源重組，定向改變基因組中的某一特定基因，使機(jī)體特定基因失活或缺失，從而研究此基因的功能的一種分子生物學(xué)技術(shù)。第66頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四由于胚胎干細(xì)胞的這種特殊性，ES細(xì)胞基因打靶技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物之中。從80年代到90年代初，小鼠ES細(xì)胞基因打靶技術(shù)已發(fā)展到成熟階段。1984年，Bradly等成功地用顯微注射法將ES細(xì)胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，獲得生殖系嵌合體，再適當(dāng)交配，獲得源于ES細(xì)胞系純系小鼠?；蚯贸陌l(fā)展歷程第67頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四此實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)體外培養(yǎng)的ES細(xì)

26、胞能在體內(nèi)分化發(fā)育成生殖系嵌合體并可獲得小鼠純合體子代。1987年，人們利用ES細(xì)胞技術(shù)建立了次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hprt)基因敲除(Gene knockout)的動(dòng)物模型。第68頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四轉(zhuǎn)抗凝血酶素V基因、轉(zhuǎn)-干擾素基因羊。第69頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四如何敲除其胰島素基因，成為糖病模型？猴的基因編碼與人類只有1%的差別，通過(guò)轉(zhuǎn)基因猴，可以研究各種疾病對(duì)人的影響，并開(kāi)發(fā)出相應(yīng)的治療方法。如引進(jìn)老年性癡呆病的基因，加快針對(duì)這種疾病疫苗的開(kāi)發(fā)研究。還可引進(jìn)糖尿病、乳腺癌、帕金森氏癥等基因，為人類最終戰(zhàn)勝社些疾

27、病提供幫助。第70頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四一、基因敲除的一般原理利用胚胎干細(xì)胞進(jìn)行基因敲除。1）構(gòu)建常規(guī)基因敲除載體，載體中的外源基因與靶基因高度同源，且被修飾和改造；2）敲除載體質(zhì)粒導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞；3）篩選發(fā)生同源重組的陽(yáng)性胚胎干細(xì)胞；4）通過(guò)顯微注射將陽(yáng)性胚胎干細(xì)胞導(dǎo)入胚囊；5）轉(zhuǎn)入假孕雌鼠子宮；6）獲得嵌合體小鼠。第71頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologous recombination)，又稱基本重組（general recombination）。通過(guò)鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)DN

28、A分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。同源重組是最基本的DNA重組方式第72頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四Holliday模型的4個(gè)關(guān)鍵步驟： 兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊；一個(gè)DNA的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)DNA對(duì)應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體；通過(guò)分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈DNA；Holliday中間體切開(kāi)并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體DNA，分別為：第73頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四 內(nèi)切酶 (recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移 (recA) 內(nèi)切酶(recBCD) DNA 連接酶5353535353535353535

29、35353535333535335535353Holiday中間體53535353第74頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四Holiday中間體535353535535533335555333355553335555333355553333內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC) DNA連接酶 DNA連接酶片段重組體拼接重組體第75頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四 knock-out ：the gene of interest is disrupted 同源重組抗性選擇第76頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四RBDT-ADT-

30、AhptEnLBWaxy重組整合WaxyhptEnWaxy重組intron1表達(dá)載體受體基因組打靶結(jié)果基因打靶（gene targeting）第77頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四二、基因敲除載體構(gòu)建第78頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四獲得目的基因的同源片段，即5-臂和3-臂。第79頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四打靶載體的選擇性標(biāo)記基因質(zhì)粒篩選抗性基因：AmpR，KanR陽(yáng)性篩選基因表達(dá)：轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞存活，最多見(jiàn)Neo陰性篩選基因表達(dá)：轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞死亡，DTA， HSV-TK第80頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月

31、20日，1點(diǎn)29分，星期四1、插入性載體(gene-insertionvector)： 插入型載體中與靶基因同源的區(qū)段中含有特異的酶切位點(diǎn)，線性化后，同源重組導(dǎo)致基因組序列的重復(fù)，從而干擾了目標(biāo)基因的功能?；蚯贸d體類型第81頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四獲得目的基因的同源片段，即5-臂和3-臂。第82頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四2、置換型載體(gene-replacementvector)： 斷裂位點(diǎn)位于同源序列區(qū)域的外側(cè)或兩側(cè)，選擇基因位于同源目的序列內(nèi)部或外側(cè)。基因重組時(shí)以載體的同源序列取代染色體靶位序列，載體DNA同源目的序列

32、與染色體靶位點(diǎn)進(jìn)行兩次同源重組。目前，大多數(shù)基因敲除都采用置換型載體。第83頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四取代型（a）或插入型（b）載體第84頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四三、基因敲除載體導(dǎo)入ES細(xì)胞1、ES 細(xì)胞的獲得現(xiàn)在基因敲除一般采用是胚胎干細(xì)胞，最常用的是鼠，而兔，豬，雞等的胚胎干細(xì)胞也有使用。常用的鼠的種系是129及其雜合體，因?yàn)檫@類小鼠具有自發(fā)突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。而其他遺傳背景的胚胎干細(xì)胞系也逐漸被發(fā)展應(yīng)用。ES能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性！第85頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，

33、1點(diǎn)29分，星期四常用于基因敲除的靶細(xì)胞是小鼠ES細(xì)胞。導(dǎo)入方式有顯微注射法、電穿孔法、精子載體法和逆轉(zhuǎn)錄病毒法等，目前應(yīng)用較多的是電穿孔法。 2、重組DNA導(dǎo)入ES第86頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四（1）顯微注射法 (Microinjection technique)顯微鏡下，用一根極細(xì)的玻璃針（直徑1-2微米）直接將DNA注射到胚胎的細(xì)胞核內(nèi)，再把注射過(guò)DNA的胚胎移植到動(dòng)物體內(nèi)，使之發(fā)育成正常的幼仔。用這種方法生產(chǎn)的動(dòng)物約有10%是整合外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。缺點(diǎn)：一次只能轉(zhuǎn)一個(gè)細(xì)胞第87頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四（2）電穿孔法

34、 在高壓電場(chǎng)的短暫作用下，細(xì)胞膜上可出現(xiàn)可逆的孔洞，外源DNA可通過(guò)此孔洞進(jìn)入胞內(nèi)。雖然轉(zhuǎn)染效率低于顯微注射法，但可以大量細(xì)胞轉(zhuǎn)染，便于篩選，方法穩(wěn)定，目前應(yīng)用最多。（3）DNA-磷酸鈣共沉淀法 將DNA與CaCl溶液混合，再緩慢滴加入含有磷酸的HEPES溶液中，形成DNA-磷酸鈣共沉淀顆粒。 小心地將顆粒加入到培養(yǎng)的靶細(xì)胞表面，保溫?cái)?shù)小時(shí)后，使DNA被靶細(xì)胞攝取。第88頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四（4）DEAE-右旋糖苷法 該法先用來(lái)促進(jìn)病毒DNA導(dǎo)入，后來(lái)發(fā)展為一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移方法。 方法：用外源DNA和DEAE-右旋糖酶的混合物處理細(xì)胞。 常用于克

35、隆化基因的瞬間表達(dá)，不用于細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。（5）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種RNA病毒，基因大小為3-10kb。不同于其它病毒，它具有二倍體基因，即含有兩個(gè)相同的RNA分子，有典型的真核mRNA結(jié)構(gòu)（包括帽子和尾巴）。缺點(diǎn)：片段不能太長(zhǎng)第89頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四四、篩選與鑒定由于基因轉(zhuǎn)移的同源重組自然發(fā)生率極低，動(dòng)物的重組概率為10-210-5。因此如何從眾多細(xì)胞中篩出真正發(fā)生了同源重組的胚胎干細(xì)胞非常重要。目前常用的方法是正負(fù)篩選法（PNS法，Positive-Negative Screening），標(biāo)記基因的特異位點(diǎn)表達(dá)法以及PCR法。應(yīng)用最多的是

36、PNS法。第90頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四正負(fù)雙向篩選系統(tǒng)：（positiveandnegativeselection，PNS），PNS采用置換型載體，該載體含有正負(fù)選擇基因各一個(gè)，正向選擇基因多為neo基因，插入載體的同源序列中；負(fù)向選擇基因常用DTA基因，置于同源序列的外側(cè)。同源重組時(shí)，載體的同源區(qū)發(fā)生重組，同源區(qū)以外部分將被切除，所以在同源重組時(shí)，DTA基因?qū)⒈磺谐鴣G失。而在隨機(jī)整合時(shí)，所有序列均保留。 1、正負(fù)篩選法（PNS）第91頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四1） 在隨機(jī)插入的情況下，如果有DTA表達(dá)，DTA可以直接殺死細(xì)

37、胞。2） 在同源重組時(shí)，細(xì)胞對(duì)G418有抗性，隨機(jī)整合時(shí)只對(duì)G418有抗性。3）未進(jìn)行任何方式整合的細(xì)胞則被G418殺死。第92頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四neoDTAPNS載體目標(biāo)基因neo同源重組結(jié)果一、同源重組第93頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四neoDTAneoDTAPNS載體 基因組隨機(jī)整合結(jié)果二、隨機(jī)整合第94頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四正負(fù)篩選法（PNS法）篩選已發(fā)生同源重組的細(xì)胞第95頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四2、正向篩選法正向篩選標(biāo)記基因Neo具有雙重作用，

38、一方面導(dǎo)致了靶基因的插入突變；同時(shí)作為重組細(xì)胞的正向篩選標(biāo)志，該基因產(chǎn)物可使細(xì)胞在含有新霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。正向篩選法可分為無(wú)啟動(dòng)子篩選法、無(wú)增強(qiáng)子篩選法和無(wú)polyA篩選法。 第96頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四（1）啟動(dòng)子缺失篩選法原理是在重組基因載體的目的片段中插入一個(gè)啟動(dòng)子缺失的正向選擇基因neoneomycin，同時(shí)，目的基因片段也不包含該基因的啟動(dòng)序列。如果基因載體和細(xì)胞基因組發(fā)生同源重組，則正向選擇基因可以在靶位點(diǎn)基因啟動(dòng)子的作用下得以表達(dá)，使陽(yáng)性細(xì)胞具有G418抗性，從而在選擇培養(yǎng)基中得到同源重組陽(yáng)性克隆。 第97頁(yè)，共110頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)29分，星期四（2）Poly-A缺失篩選法Poly-A缺失篩選的載體設(shè)計(jì)與啟動(dòng)子缺失的設(shè)計(jì)基本相同，當(dāng)打靶基因不能被誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，則考慮選用