1、PAGE3聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度1試劑的配制（1）丙烯酰胺和N,N-甲叉雙丙烯酰胺用去離子水配制29%（29 g/100mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N,N-甲叉雙丙烯酰胺的貯存液。由于丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在貯存過(guò)程中會(huì)分別緩慢轉(zhuǎn)變?yōu)楸┧岷碗p丙烯酸，這一反應(yīng)是由光或堿催化的。因此在每次使用前，應(yīng)核實(shí)溶液的ol/L、的Tris緩沖液（濃縮膠緩沖液）。（4）TEMEDN,N,N,N-四甲基乙二胺TEMED通過(guò)催化過(guò)硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。（5）過(guò)硫酸銨用去離子水配制10%的過(guò)硫酸銨溶液。過(guò)硫酸銨提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液須配制新鮮

2、液。（6）Tris甘氨酸電泳緩沖液25mmol/LTris，250mmol/L甘氨酸，%的SDS。（7）樣品處理液50mmol/LTrisHCl，100mmol/LDTT巰基蘇糖醇或用5%的巰基乙醇，2%的SDS，%的溴酚藍(lán)，10%的甘油。（8）染色液%的考馬斯亮藍(lán)R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸。（9）脫色液10%的甲醇和10%的冰醋酸。由于制備凝膠的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，并且容易被皮膚吸收，因此操作必須在通風(fēng)櫥內(nèi)或通風(fēng)處進(jìn)行。TEMED和過(guò)硫酸胺對(duì)黏膜和上呼吸道組織、眼睛、皮膚等有很大的破壞作用，吞服可致命。因此在進(jìn)行電泳操作時(shí)一定按照實(shí)驗(yàn)要求和步驟，在老師的指導(dǎo)下

3、完成。操作時(shí)要戴好一次性手套。2電泳（1）根據(jù)廠(chǎng)家說(shuō)明書(shū)安裝電泳用的玻璃板。（2）配制SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠溶液。用去離子水，30%的丙烯酰胺，、的Tris緩沖液，10%的，10%的過(guò)硫酸胺，混合均勻，迅速灌注在兩玻璃板的間隙中間，要留出灌注濃縮膠所需空間梳子的齒長(zhǎng)再加0.5 cm，再在膠液面上小心注入一層水（約高23mm），以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液。（3）分離膠聚合完全后（約30min），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。（4）配制SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠溶液。用去離子水，30%的丙烯酰胺，、的Tris緩沖液，10%的，10%的過(guò)硫酸胺，混合均勻，直接灌注在聚合的分離膠上，并立即

4、在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)注意避免氣泡的產(chǎn)生。然后再補(bǔ)加濃縮膠溶液，使其充滿(mǎn)梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下聚合。（5）在等待濃縮膠聚合時(shí)，可對(duì)樣品進(jìn)行處理。在電泳樣品中按11體積比加入樣品處理液，在100 溫度下加熱3（6）濃縮膠聚合完全后（30min），小心移出梳子。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入Tris甘氨酸電泳緩沖液。必須設(shè)法排出凝膠底部?jī)刹ＡО逯g的氣泡。（7）按順序加樣，加樣量通常為1025L。樣品可以多加幾個(gè)，例如，血漿樣品紅細(xì)胞破碎后即進(jìn)行凝膠色譜分離之前的樣品和凝膠色譜分離之后的樣品。（8）將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為8V/cm。當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，把電壓提高到15V/cm，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部上方約1 cm處，關(guān)閉電源。（9）從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮刀撬開(kāi)玻璃板。將緊靠最左邊一孔（第一槽）凝膠下部切去一角，以標(biāo)注凝膠的方位。（10）將電泳凝膠片放在考馬斯亮藍(lán)染色液中染色12h。換脫色液脫色310h，其間需多次更換脫色液至背景清楚。脫色后，可將凝膠浸于水中，長(zhǎng)期封裝在塑料