用Image-ProPlus(IPP)

分析免疫組化圖片1.免疫組化圖片分析原理根據(jù)染色染料顏色的深淺(光密度)及分布面積大小來確定目標(biāo)蛋白的量。染色區(qū)域分布面積與目標(biāo)蛋白量成正比。染色的顏色深淺(光密度)與目標(biāo)蛋白量的定量關(guān)系符合朗伯-比爾定律，是對(duì)數(shù)關(guān)系。1.1光密度與灰度—迷惑人的不同概念光密度：吸收光的物質(zhì)的光學(xué)密度。（opticaldensity,就是常說的OD值）光密度值是直接與染色物質(zhì)的量相關(guān)的?；叶龋夯沂遣粔蚝冢欠瓷淞炼鹊膯挝?。電子照片上像素的亮度稱為灰度。OpticalDensity:

吸收光線的物質(zhì)的光學(xué)密度.被測物質(zhì)的量越多，光密度(OD值)越高，透射出的光越少，反映在照片上就越黑。OD值與物質(zhì)的量直接相關(guān)，灰度值與OD值成對(duì)數(shù)關(guān)系，符合朗伯-比爾定律。理論上OD值是從零到無窮大。實(shí)際應(yīng)用中，OD值的范圍常用

0-2.0或者0-3.0。用OD值是正確的分光光度計(jì)與酶標(biāo)儀的測定值是OD值透射的顯微鏡圖象上的光強(qiáng)度要用OD值蛋白電泳條帶的測量也是OD值。螢光顯微鏡及螢光分光光度計(jì)的測量值是螢光強(qiáng)度(Fluorescenceintensity)用EB染色的DNA凝膠電泳條帶也是螢光強(qiáng)度，但處理方法與光密度相同，故也用OD值。這個(gè)OD與前面的OD又有不同的意義。它就是熒光的光密度。反映著熒光物質(zhì)的多少。WesternBlot條帶的測定也要使用OD值來進(jìn)行定量.處理照片時(shí)用的卻是灰度各種圖象被拍攝成照片進(jìn)行數(shù)字圖象處理時(shí)，是對(duì)照片的灰度進(jìn)行測量和計(jì)算的。但最后得到的結(jié)果還是需要換算回OD值來表達(dá)。所以對(duì)免疫組化照片的分析結(jié)果應(yīng)該是一個(gè)OD值，光密度。不應(yīng)該是灰度。準(zhǔn)確地說，是對(duì)免疫組化照片的特定染色區(qū)域的灰度進(jìn)行分析從而測量出組織切片的光密度值。用標(biāo)準(zhǔn)樣品才能把OD值

與樣品量關(guān)聯(lián)到一起OD值是一個(gè)沒有單位的相對(duì)值。使用酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)時(shí)要作標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)電泳條帶進(jìn)行定量分析時(shí)一樣要作標(biāo)準(zhǔn)曲線。電泳條帶照片的灰度值與樣品量的關(guān)系為指數(shù)函數(shù)。在把灰度值轉(zhuǎn)換成OD值時(shí)，用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)進(jìn)行定量分析是不準(zhǔn)確的。多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線亦有很大誤差，因此只能說是半定量分析。在實(shí)際應(yīng)用時(shí),可以直接測量OD值,用以表達(dá)染色物質(zhì)的相對(duì)的量.1.3比較兩張照片的染色物質(zhì)量的差別兩張照片染色深度一樣，染色面積大的質(zhì)量大照片A照片B這回該怎么看？A的顏色深，面積小。B的顏色淺，面積大。照片A照片B1.4實(shí)際圖片的情況很復(fù)雜的。陽性樣品染色深，陰性樣品染色淺。直接比較整張圖片的IOD

等于在比較整張圖片的meandensity哪一個(gè)染色物更多？染色區(qū)域顏色接近，染色面積有差異。使用不同的area會(huì)得到不同的結(jié)論

要結(jié)合病理情況來判斷。IOD對(duì)整張圖片的面積作平均。IOD對(duì)特定組織區(qū)域面積作平均?！蘄OD對(duì)顯色的組織區(qū)域作平均。對(duì)整張圖片區(qū)域進(jìn)行平均的情況比較少也許應(yīng)是這個(gè)特定的組織區(qū)域這個(gè)區(qū)域是染色的區(qū)域。往往在計(jì)算IOD時(shí)同時(shí)計(jì)算出來，但以此為平均面積往往并不正確。邊界不清晰的貼壁細(xì)胞整張圖片IOD/細(xì)胞個(gè)數(shù)（照片中細(xì)胞數(shù)目不多，數(shù)起來不費(fèi)事）細(xì)胞簇的分析測量整張圖片黃色區(qū)域IOD。再測量細(xì)胞分布的區(qū)域面積area。對(duì)染成藍(lán)色的細(xì)胞核計(jì)數(shù)，作為細(xì)胞數(shù)N。以IOD/（N*area）作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。2.1測定整張照片的光密度-圖象分析儀其測定原理有點(diǎn)象分光光度計(jì)，直接測定切片的整體光密度?？梢愿鶕?jù)照片上象素點(diǎn)的亮度來區(qū)分測定區(qū)域其缺陷是顯而易見的。復(fù)染上的其他顏色的染料也會(huì)產(chǎn)生光密度吸收，導(dǎo)致嚴(yán)重的干擾。2.2抽樣測量光密度在彩色電子圖片上選取目標(biāo)顏色區(qū)域，抽樣測量這些小區(qū)域的灰度值，取其平均值作為比較染色深淺的指標(biāo)。隨機(jī)選取幾個(gè)區(qū)域

但是能作到“隨機(jī)”嗎？2.3ImageProplus(IPP)的獨(dú)特優(yōu)勢。準(zhǔn)確地按照一個(gè)顏色標(biāo)準(zhǔn)來選取一個(gè)AOI(areaofinteresting)。測量這個(gè)區(qū)域的光密度參數(shù)。3.用IPP分析免疫組化圖片過程選取圖片上具有染料色調(diào)的區(qū)域（AOI，areaofinteresting）。測量該區(qū)域的IOD。選擇并測量有效統(tǒng)計(jì)區(qū)域的面積計(jì)算選擇區(qū)域內(nèi)的光密度平均值IOD/area（densitymean）計(jì)算同一實(shí)驗(yàn)組切片各照片的平均及標(biāo)準(zhǔn)差。用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析各實(shí)驗(yàn)組的平均densitymean之間是否有顯著性差異。3.1用于免疫組化半定量分析的照片拍攝與普通顯微鏡照片不同，用于免疫組化分析的顯微鏡照片有其特殊的拍攝要求。顯微鏡光源正確調(diào)整顯微鏡光源為日光色溫的白色光。此時(shí)是加藍(lán)色濾光片，燈絲電壓為10V左右。一般的顯微鏡上都會(huì)有指示的。此時(shí)的鏡下視野會(huì)感覺明亮得有點(diǎn)刺眼。不能通過調(diào)整光圈的方法減低亮度，這會(huì)影響到圖象的清晰度。光圈與聚光鏡要按照柯勒方法調(diào)整以保證照片的清晰.不能加過大的灰度鏡減低亮度。用25%的灰度濾光片還行。6%的灰度濾光片會(huì)導(dǎo)致色彩失真。如果照明光源不白，有偏色，將直接影響到照片色彩，從而使得測量結(jié)果不準(zhǔn)確。固定顯微鏡的工作條件不僅是光源亮度，除了更換樣品時(shí)調(diào)節(jié)載物臺(tái)位置，其他部件一律固定下來。特別是不要來回切換使用不同放大倍數(shù)的物鏡。使用一個(gè)物鏡拍攝所有的照片后，再切換到另一個(gè)物鏡上拍攝照片。為保證顯微鏡光源的穩(wěn)定一致，所有照片應(yīng)該一次拍攝完成。不能分?jǐn)?shù)次拍攝。若能給顯微鏡加上穩(wěn)壓電源就更好了。這能保證顯微鏡光源亮度的穩(wěn)定。應(yīng)該使用手動(dòng)控制曝光的相機(jī)對(duì)每張照片要使用相同的曝光時(shí)間，而不是由相機(jī)自動(dòng)控制曝光。染色深的陽性樣品就應(yīng)該拍攝得較暗。染色淺的陰性對(duì)照樣品則應(yīng)該拍攝得較明亮?？刂葡鄼C(jī)曝光時(shí)間要把相機(jī)曝光時(shí)間控制到使視野中空白的地方呈現(xiàn)純亮的白色。拍攝出的照片上，沒有組織的空白處的背景灰度值應(yīng)達(dá)到230左右?？梢允褂脠D象分析軟件測量一下空白處的背景灰度值。低于230的背景灰度值很容易產(chǎn)生色彩的偏離，會(huì)影響到圖像分析數(shù)值的偏差。把空白灰度值調(diào)到230相當(dāng)于在分光光度計(jì)上調(diào)節(jié)100%透射。背景的影響左圖：暗且偏藍(lán)的背景嚴(yán)重降低了黃色的IOD值。而且影響到了陽性區(qū)域的色調(diào)。較暗的背景值對(duì)分析測量的影響顯著性差異無顯著性差異扣背景后依然沒有顯著性差異注意誤差線，依然沒有顯著性差異避免使用相機(jī)的自動(dòng)白平衡自動(dòng)白平衡功能是相機(jī)根據(jù)照片總體色彩情況自動(dòng)對(duì)每張照片進(jìn)行各自不同的白平衡校正。這會(huì)嚴(yán)重影響分析測量的準(zhǔn)確性。顯微鏡照片用一兩種染料染色，照片的色彩就應(yīng)該是不平衡的，不能校正。由于免疫組化照片上黃色染色多,自動(dòng)白平衡會(huì)將圖片色調(diào)向藍(lán)色調(diào)整,導(dǎo)致色彩的失真.最好使用專業(yè)CCD拍攝民用數(shù)碼相機(jī)適用于拍攝日常生活中的照片，其自動(dòng)曝光、自動(dòng)白平衡功能會(huì)有效改善照片的直觀效果。但對(duì)于顯微鏡照片，這些功能卻會(huì)改變照片的原始面貌，嚴(yán)重影響照片的分析測量結(jié)果。要想關(guān)閉這些功能，往往要進(jìn)行很復(fù)雜的設(shè)置。不使用自動(dòng)白平衡校正，但可以使用手動(dòng)的白平衡校正背景色彩。對(duì)所有照片進(jìn)行統(tǒng)一的背景色彩校正。使得照片中空白的背景呈白色。應(yīng)當(dāng)把照片存為無損壓縮格式TIFF特別是對(duì)于染色較淺的圖片，保存為jpeg格式后會(huì)損失亮度細(xì)節(jié)，導(dǎo)致測量誤差增大。要注意相機(jī)上直接保存為jpeg的圖片就沒必要轉(zhuǎn)成TIFF了.注意那些馬賽克總結(jié)拍攝注意事項(xiàng)：調(diào)整顯微鏡光源亮度，足夠白，足夠亮。調(diào)整相機(jī)曝光時(shí)間，使背景呈現(xiàn)白色。灰度值最好能達(dá)到230以上。確認(rèn)相機(jī)未使用自動(dòng)白平衡功能。但可以使用手動(dòng)校正白平衡功能校正背景色彩為純白色。使用同樣的顯微鏡工作條件與相機(jī)工作條件一次拍攝完所有照片。保存照片為TIFF格式。3.2用Image-proplus分析免疫組化圖片與photoshop不同，image-proplus是一個(gè)圖片分析測量軟件。IPP的功能不是用來美化圖片，如果照片效果不好或分析結(jié)果不理想，要從切片處理與拍攝過程上找原因，而不應(yīng)試圖通過對(duì)圖片的修飾與處理來解決問題。通過IPP的分析測量只應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)確地反映圖片本身的真實(shí)測量數(shù)據(jù)。3.2.1開始使用IPPIPP的程序界面是典型的windows風(fēng)格。它包含了最常用的一些windows程序的一些通用工具。進(jìn)入IPP后的第一件事就是打開一幅待分析的圖片。將分析圖片信息保存到數(shù)據(jù)庫中在程序中保存分析圖片過程信息是保存實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)的基本原則，必須遵守。將圖片信息及圖片分析過程及分析的信息存入IPP程序數(shù)據(jù)庫是一種保存實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)的操作。要注意對(duì)同一張圖片進(jìn)行同樣的操作，由于一些手動(dòng)的操作無法準(zhǔn)確地重復(fù)，所以會(huì)出現(xiàn)兩次同樣的測量得到有差異的結(jié)果的情況。這也是保存測量結(jié)果的理由之一。3.2.2.設(shè)置并保存測量條件設(shè)置光密度校正設(shè)置測量項(xiàng)目.設(shè)置分色選擇參數(shù)3.2.2.1光密度校正方法校正光密度步驟小結(jié).1.調(diào)出intensitycarliberation窗口,點(diǎn)New按紐建立一個(gè)新的校正.2.選擇stdoptiondensity,此時(shí)可見到反向的校正曲線.3.選擇背景空白值對(duì)應(yīng)的灰度.相當(dāng)于分光光度計(jì)中的調(diào)整100%透射.4.選擇此校正為systemcarliberation,使之能應(yīng)用于所有照片.3.2.2.2選擇測量參數(shù)需要測量選擇區(qū)域的面積(area)與累積光密度(IOD).在測量選項(xiàng)中也有平均光密度這一項(xiàng),但它不適用于當(dāng)前的測量,不能選用.選擇面積時(shí)一般要設(shè)置一個(gè)過濾值,忽略掉面積過小的點(diǎn),一般可設(shè)置為最小20象素.還要設(shè)置一下測量的顯示選項(xiàng)(option),一般是選擇顯示選擇區(qū)域填充紅色.還有一些其他的設(shè)置.選擇測量參數(shù)在分析免疫組化圖象時(shí),一般是測量選定的具有特定顏色的區(qū)域的面積與累積光密度(IOD)對(duì)免疫組化的顯微照片,一般應(yīng)分析它的平均光密度.即時(shí)IOD/area.根據(jù)圖象的特點(diǎn),要分別測量選擇區(qū)域的IOD及area.對(duì)不同的組織照片，要使用不同的測量指標(biāo)來進(jìn)行比較。在count/size里進(jìn)行這些設(shè)置調(diào)出的selectMeasurements,Option設(shè)置窗口保存設(shè)置:file–savesettings3.2.2.3選取特定顏色所在的區(qū)域一般免疫組化樣品中黃色的地方為陽性染色區(qū)域。在測量時(shí)應(yīng)當(dāng)測量這些黃色（棕黃色）區(qū)域的光密度值。不測量其他顏色部分的。因此首要的任務(wù)就是把這些黃色的區(qū)域挑選出來。IPP是利用圖片上象素點(diǎn)的顏色分類來選取測量區(qū)域的。其選擇工具irregularAOI與segmentation是IPP最有特色，最有效的工具。用IPP選取特定顏色區(qū)域的工具選擇特定顏色的區(qū)域是IPP最有特色的功能，按照特定的顏色特征選取圖象中的特定區(qū)域，并計(jì)算這些區(qū)域的面積等幾何尺寸與光密度數(shù)據(jù)，就是IPP分析圖像工作的中心任務(wù)。IrregularAOI:適用于選擇有明顯顏色邊界的單個(gè)顏色區(qū)域。Segmentation：適用于選取整張圖片中具有特定顏色的所有區(qū)域。測量免疫組化圖片一般使用這個(gè)工具。在count/size窗口中點(diǎn)selectcolor,就調(diào)出了這個(gè)segmentation工具.點(diǎn)HistogramBased,還要選HIS.在彈出的警告上點(diǎn)“是”。H：0-30，S：0-255，I：0-230設(shè)置好的選色條件也要保存的。測量光密度時(shí)，要測量灰度圖片彩色圖象上象點(diǎn)的強(qiáng)度是由紅藍(lán)綠三色混合而成，如果直接在彩色圖上測量光密度，會(huì)有一個(gè)系統(tǒng)誤差。所以正規(guī)的測量需要把圖象中選取的區(qū)域外部分涂白，然后轉(zhuǎn)換圖象為灰度圖片，再測量光密度。選擇TransparentonWhite，只顯示選擇到的區(qū)域。再點(diǎn)createpreviewimage復(fù)制出一張。將復(fù)制的圖片轉(zhuǎn)換成灰度圖片。對(duì)此圖片再作一次選色，這次只需選擇一個(gè)強(qiáng)度了。I：0-230還要保存一次灰度選色設(shè)置。3.2.2.4好啦，點(diǎn)count進(jìn)行測量?？纯礈y量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)?？梢园褦?shù)據(jù)存入excel表格里。3.2.2.5別急，還沒完事呢。以上測量的是選擇區(qū)域內(nèi)的累積光密度值IOD，但同時(shí)測量的面積卻未必是正確的面積。測量數(shù)據(jù)表里的area是圖片上選擇的染色區(qū)域的面積，這不一定就是我們需要的面積。我們最終要得到的數(shù)據(jù)應(yīng)該是一個(gè)平均光密度值，是IOD/area。IOD就是前面測量的IODSUM.但面積是什么則需要認(rèn)真選擇的。在需要測量整張照片染色的時(shí)候，面積就是照片面積。如果切片只拍攝了一部分，空白處的面積則需扣除。很多情況下，是要測量某一組織區(qū)域內(nèi)的光密度。可以使用irregularAOI工具來選擇測量區(qū)域。選擇一個(gè)區(qū)域后，點(diǎn)NewAOI再選擇下一個(gè)區(qū)域。最后按下圖點(diǎn)就行了。點(diǎn)了conver