【關(guān)鍵詞】

同種異體骨移植的基礎(chǔ)研究與臨床

各種原因造成大段骨、關(guān)節(jié)缺損的修復(fù)是修復(fù)重建外科領(lǐng)域較為普遍而又棘手的問題。同種異體骨來源豐富，不受形態(tài)、大小限制，且具有生物活性，臨床廣泛應(yīng)用日益增多，已取得了較成熟的經(jīng)驗(yàn)。筆者就同種異體骨移植的研究進(jìn)展作綜述如下：

1

同種異體骨采集來源

臨床異體骨常取自：(1)截肢的骨組織；(2)胸部手術(shù)中切除的肋骨；(3)新鮮尸體骨骼，包括死嬰(多采用軟骨)。禁忌采集來源于腫瘤、傳染病、細(xì)菌性感染、骨病、血液病患者的骨組織。對(duì)于新鮮尸體，應(yīng)爭(zhēng)取在死后6～12h內(nèi)的無菌狀態(tài)下取骨，并經(jīng)相應(yīng)的處理后存入骨庫。

2

同種異體骨的保存

同種異體骨的保存方法很多，但臨床應(yīng)用效果肯定、國內(nèi)外骨庫應(yīng)用最多的是深凍法和凍干法。

2.1

深凍法

將獲得的同種異體骨表面軟組織、骨膜和骨端軟骨徹底剔除，根據(jù)需要制成不同形狀、大小的移植骨材料，使用無菌鹽水或抗生素鹽水進(jìn)行加壓沖洗盡量去除骨髓組織，然后進(jìn)行無菌包裝，采用逐漸降溫法，先將移植骨放人-4℃的冷庫中，12h后再逐漸降至-80℃保存。Friedlaender和Bumhardt等研究發(fā)現(xiàn)異體冷凍骨移植后僅能引起強(qiáng)度很弱的慢性免疫排斥反應(yīng)，通過冷凍使異體骨的免疫原性大大降低。Poitout［1］認(rèn)為，深凍骨抗原性和移植后的生物學(xué)特性明顯優(yōu)于新鮮異體骨組織，取得較為滿意修復(fù)效果。深低溫(-80℃)狀態(tài)下，酶的活性基本消失，酶對(duì)骨的破壞最小，膠原酶處于靜止?fàn)顟B(tài)保存期可長(zhǎng)達(dá)數(shù)年［2］。深凍法適用于各種骨移植材料保存，是要求保留軟骨活性的同種異體骨、關(guān)節(jié)保存的首選方法。

2.2

凍干法

將新制成的深凍骨放入干燥機(jī)內(nèi)，使骨組織內(nèi)剩余水分降低到5％以下，然后進(jìn)行無菌包裝，置于無菌真空容器中常溫保存。凍干法有常溫保存、便于運(yùn)輸?shù)奶攸c(diǎn)，常用于制備松質(zhì)骨條、骨塊、骨釘和需要常溫運(yùn)送保存的大段骨，但它對(duì)骨強(qiáng)度有明顯影響，對(duì)大段的和需要承重的移植骨，應(yīng)該盡量避免應(yīng)用凍干法保存。

3

同種異體骨的滅菌

滅菌是制備同種異體骨的重要環(huán)節(jié)，目前國內(nèi)外骨庫大多用環(huán)氧乙烷和γ射線滅菌。

3.1

環(huán)氧乙烷(EO)滅菌

EO通過使微生物中的核酸烷基化和酶的滅活而發(fā)揮滅菌作用。一般用于同種異體骨滅菌的EO濃度為450～1500ms／L，溫度為20～60℃，有效濕度為30％～60％，經(jīng)過2～5h時(shí)薰蒸可殺滅各種細(xì)菌、芽胞、病毒。EO消毒對(duì)移植骨的生物學(xué)性能有一定損害作用。Thoren等認(rèn)為，大劑量EO氣體會(huì)影響未脫鈣骨的骨傳導(dǎo)，使骨傳導(dǎo)小室中的骨生長(zhǎng)速度降低大約一半。Aspenberg等發(fā)現(xiàn)EO對(duì)骨誘導(dǎo)的影響存在劑量依賴關(guān)系，大劑量影響骨誘導(dǎo)活性。另外，EO對(duì)致密的皮質(zhì)骨僅能穿透6mm，目前僅推薦用于顆粒狀骨材料的消毒。

3.2

照射滅菌

60Coγ射線輻照通過激發(fā)電子的直接作用和促進(jìn)·H和·OH自由基生成的間接作用，使微生物中的蛋白、酶、核酸及DNA滅活而起到滅菌作用。推薦使用的輻照有效劑量為15～25kGy。25kGy的γ射線輻照不影響移植骨力學(xué)強(qiáng)度，并保留部分骨誘導(dǎo)能力，無明顯的臨床危害作用［3］。γ射線輻照適用于各種骨移植材料消毒、滅菌，大多數(shù)組織庫常使用該滅菌方法。

4

同種異體骨移植后的愈合

4.1

同種異體骨移植后的愈合機(jī)制

4.1.1

自身成骨作用

新鮮同種異體骨移植，存活的細(xì)胞具有早期成骨能力，但因免疫反應(yīng)，供體來源的細(xì)胞被殺死，早期成骨亦被吸收，所以這種成骨作用是無效的。庫存骨的細(xì)胞成分多已死亡，不具備自身成骨能力。

4.1.2

骨傳導(dǎo)作用

骨傳導(dǎo)作用也就是支架作用，是移植骨周圍組織床的血管、骨祖細(xì)胞沿植入物的機(jī)械引導(dǎo)侵入其內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)爬行替代的過程。骨傳導(dǎo)作用僅見于移植物植入骨骼系統(tǒng)內(nèi)，無活性的植入物植入骨骼系統(tǒng)以外僅能引起纖維組織替代，形成疤痕組織［4］。同種異體移植骨的愈合、替代過程主要依靠骨的傳導(dǎo)作用。

4.1.3

骨誘導(dǎo)作用

骨誘導(dǎo)作用是指來自植床周邊宿主結(jié)締組織中的可誘導(dǎo)成骨前體細(xì)胞即間充質(zhì)細(xì)胞，在誘導(dǎo)因子的作用下可被誘導(dǎo)成骨原細(xì)胞，經(jīng)成骨細(xì)胞形成新骨，這種成骨方式是間接的，稱為骨誘導(dǎo)，骨誘導(dǎo)在異體骨愈合早期發(fā)揮重要作用［5］。Urist等自骨基質(zhì)中提取出骨誘導(dǎo)物質(zhì)，稱為骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogeneticprotein，BMP)，BMP能誘導(dǎo)結(jié)締組織中的間質(zhì)細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)為軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞表型，即誘導(dǎo)上述細(xì)胞在骨骼或骨骼以外的部位產(chǎn)生軟骨和骨組織，這就是骨誘導(dǎo)成骨理論的核心。

4.2

同種異體骨移植后的愈合方式

同種異體骨移植愈合過程是移植骨再血管化、新骨形成、宿主骨床與移植物連結(jié)而實(shí)現(xiàn)骨摻入的過程。Burchardt［6］將同種異體移植骨與宿主的愈合方式分為3型。I型：愈合過程與自體骨移植相似，沒有疲勞骨折。移植16周后同種異體移植骨與宿主骨連接，移植骨的成骨量、塑形均與自體移植骨接近。Ⅱ型：愈合過程緩慢，表現(xiàn)為：(1)較多發(fā)生骨不連接或延遲連接；(2)移植骨周邊被吸收或移植骨體積變小；(3)移植骨內(nèi)部被吸收范圍擴(kuò)大，延伸至間質(zhì)板層；(4)移植骨機(jī)械強(qiáng)度明顯下降。Ⅲ型：沒有修復(fù)征象，移植骨迅速地被吸收，骨不連接。在低溫保存的骨庫異體骨愈合過程中，各型愈合方式所占的比例約為：Ⅰ型占20％，Ⅱ型占60％，Ⅲ型占20％。同種異體骨移植的愈合過程與自體骨移植的不同之處主要表現(xiàn)為同種異體移植骨的成骨與血管長(zhǎng)入的速度和程度都不及自體骨，且同種異體移植骨相對(duì)自體移植骨更易被宿主吸收。

5

異體骨的免疫原性及處理方法

5.1

同種異體骨移植免疫排斥基礎(chǔ)

異體組織排斥反應(yīng)是由供體主要組織相容性復(fù)合體(MHC)抗原引起的宿主對(duì)異體基因供體組織的免疫攻擊。同種異體骨抗原物質(zhì)主要存在于骨髓的造血細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和骨細(xì)胞［7］。細(xì)胞膜表面糖蛋白是其抗原的主要成分，它們受MHC基因的控制，在人類為人白細(xì)胞抗原(HLA)基因。同種異體骨移植引起的免疫反應(yīng)是通過T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫。孫磊等試驗(yàn)表明，免疫反應(yīng)可抑制BMP的誘導(dǎo)成骨作用［8］。庫存的同種異體骨幾乎無活性細(xì)胞，其細(xì)胞的MHC抗原片段由宿主抗原呈遞細(xì)胞(antigenpresentingcell，APC)攝取、加工、處理，通過間接途徑呈遞給宿主T細(xì)胞，激起免疫應(yīng)答，導(dǎo)致慢性排斥反應(yīng)或免疫耐受狀態(tài)［9］。另外，庫存同種異體骨移植后必須通過再生血管宿主APC才能深入到堅(jiān)實(shí)的供體骨基質(zhì)內(nèi)部，與供體MHC抗原相接觸［10］，因此，免疫排斥反應(yīng)出現(xiàn)較晚且程度較輕。

5.2

降低同種異體骨移植免疫排斥的方法

5.2.1

對(duì)移植骨抗原的處理

盡量去除或殺死移植骨內(nèi)的細(xì)胞成分，以減弱其抗原性。徹底刮除移植骨的骨髓、骨膜，反復(fù)洗滌，是簡(jiǎn)單有效的去除抗原方法，但機(jī)械方法不可能完全去除移植骨的細(xì)胞成分。目前常采用低溫冷凍、凍干和脫鈣脫脂、電離輻射等技術(shù)對(duì)異體骨進(jìn)行處理以進(jìn)一步減弱其免疫性。

5.2.2

植骨供體和受體的組織配型

為了減弱異體骨的免疫排斥，人們?cè)噲D如器官移植樣進(jìn)行MHC組織配型。Stevenson等［11］對(duì)組織相容和不相容組小獵犬進(jìn)行橈骨移植，結(jié)果顯示組織不相容的異體深凍骨的活骨面積和新骨在沉積優(yōu)于新鮮骨，但都低于相容供體同種骨與自體骨。Leunig等［10］在小鼠同種異體骨移植中，量化測(cè)定移植骨的血管生長(zhǎng)和新骨形成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植骨的整合和排斥反應(yīng)是受微血管系統(tǒng)調(diào)節(jié)的，MHC不匹配加速同種異體骨的排斥反應(yīng)。

人類同種骨移植組織配型的效果與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是否相同受到關(guān)注。目前一般認(rèn)為組織配型會(huì)改善MHC不匹配新鮮移植物愈合行為，但是對(duì)冷凍移植物則效果不確定［12］，因此，臨床上常規(guī)尚不對(duì)同種異體骨移植進(jìn)行組織配型。5.2.3

免疫抑制劑的應(yīng)用

Shigetomi等［13］觀察到長(zhǎng)期應(yīng)用環(huán)孢菌素A(CsA)的帶血管的大鼠同種異體骨移植的愈合與不用CsA的帶血管自體骨的愈合相同。Shigetomi等也證實(shí)，應(yīng)用免疫抑制劑環(huán)孢菌素(CsA)能明顯改善移植骨的生物學(xué)行為，獲得較好效果。也有研究指出，移植后免疫抑制劑的應(yīng)用能導(dǎo)致移植骨的吸收增加，同時(shí)可產(chǎn)生諸多并發(fā)癥，如傷口愈合差、感染、體重減輕、白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少等。因此，臨床行低溫骨庫保存的同種異體骨移植時(shí)，一般不使用免疫抑制劑。

6

同種異體骨移植臨床應(yīng)用

同種異體骨移植材料及手術(shù)方式的選擇應(yīng)根據(jù)移植目的決定。單純的骨腔填塞可選用皮松質(zhì)骨粒。涉及負(fù)重及其他力學(xué)性能的植骨應(yīng)選用相對(duì)應(yīng)的異體骨段行嵌入植骨，同時(shí)給予堅(jiān)強(qiáng)的內(nèi)固定。若植骨長(zhǎng)度較大，可同時(shí)復(fù)合帶紅骨髓的自體骨移植，以增加其成骨能力，促進(jìn)植骨愈合。關(guān)節(jié)融合術(shù)中植骨也應(yīng)實(shí)施復(fù)合移植，自體、異體骨同時(shí)應(yīng)用。多項(xiàng)研究證實(shí)，復(fù)合移植預(yù)后優(yōu)于單純異體植骨。

7

同種異體骨移植的并發(fā)癥及對(duì)策

7.1

感染及對(duì)策

術(shù)后晚期深部感染成為同種異體骨移植最主要的并發(fā)癥。預(yù)防措施有：移植骨嚴(yán)格消毒；嚴(yán)格無菌操作；移植骨周邊應(yīng)有良好的軟組織覆蓋，甚至可以行肌瓣轉(zhuǎn)移或移植；預(yù)防性使用抗生素；充分引流滲出物。

7.2

移植骨延遲愈合、不愈合、疲勞骨折及對(duì)策

同種異體骨移植后骨延遲愈合、不愈合，疲勞骨折較自體骨移植發(fā)生率高。為了促進(jìn)愈合，防止骨折，在不影響腫瘤切除情況下，應(yīng)盡可能保護(hù)宿主骨局部的血運(yùn)及周圍軟組織；在不影響生物力學(xué)的前提下增加移植骨與宿主骨的有效接觸面積；在不影響愈合的情況下給予堅(jiān)強(qiáng)的內(nèi)固定加適當(dāng)?shù)耐夤潭?；采用?fù)合自體骨膜或松質(zhì)骨移植等方式。還應(yīng)該注意預(yù)防疲勞骨折，在移植骨沒有被完全替代時(shí)，應(yīng)避免反復(fù)應(yīng)力作用。

7.3

創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)功能障礙及對(duì)策

異體骨關(guān)節(jié)移植后，如何盡快、盡可能大面積地建立活性有效的關(guān)節(jié)面，是骨關(guān)節(jié)移植的重要課題。利用關(guān)節(jié)軟骨移植或把BMP及各種生長(zhǎng)因子，如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)注入關(guān)節(jié)腔內(nèi)來促進(jìn)移植骨關(guān)節(jié)功能恢復(fù)的課題正在研究當(dāng)中［14］。

8

小結(jié)

隨著骨保存技術(shù)的發(fā)展，同種異體骨的處理與保存方法日趨完善，各種方法處理的同種異體骨具有免疫原性低、安全有效的特點(diǎn)，已廣泛用于臨床。復(fù)合骨髓、自體骨的同種異體骨移植方法的出現(xiàn)，提高了術(shù)后的臨床治療效果。此外，為了提高移植骨的誘導(dǎo)成骨活性，近年來人基因重組BMP(rhBMP)應(yīng)用受到重視，復(fù)合BMP的同種異體骨材料有利于新骨形成［15］，加速爬行替代，減少骨折、不愈合、植入骨的吸收及關(guān)節(jié)塌陷等并發(fā)癥，現(xiàn)己應(yīng)用于臨床［16］，取得良好療效。相信隨著對(duì)同種異體骨免疫原性及誘導(dǎo)活性的不斷深入研究，移植骨和宿主骨交界處細(xì)胞和分子水平相互作用機(jī)制研究的加強(qiáng)，同種異體骨必將會(huì)有更為廣闊的應(yīng)用前景。

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