食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定方法蛋白質(zhì)的測(cè)定方法分為兩大類： 一類是利用蛋白質(zhì)的共性， 即含氮量，肽鏈和折射率測(cè)定蛋白質(zhì) 含量，另一類是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸、堿性基團(tuán)和芳香基團(tuán)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。 但是食品種類很多，食品中蛋白質(zhì)含量又不同， 特別是其他成分，如碳水化合物， 脂肪和維生素的干 擾成分很多，因此蛋白質(zhì)的測(cè)定通常利用經(jīng)典的剴氏定氮法是由樣品消化成銨鹽蒸餾， 用標(biāo)準(zhǔn)酸液吸收，用標(biāo)準(zhǔn)酸或堿液滴定，由樣品中含氮量計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。由于食品中蛋白質(zhì)含量不同又分為凱氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它們的基本原理都是一樣的。一凱氏定氮法我們?cè)跈z驗(yàn)食品中蛋白質(zhì)時(shí)， 往往只限于測(cè)定總氮量， 然后乘以蛋白質(zhì)核算系數(shù)， 得到蛋白質(zhì)含 量，實(shí)際上包括核酸、生物堿、含氮類脂、葉啉和含氮色素等非蛋白質(zhì)氮化合物，故稱為粗蛋白 質(zhì)。(一)、常量凱氏定氮法衡量食品的營(yíng)養(yǎng)成分時(shí)，要測(cè)定蛋白質(zhì)含量，但由于蛋白質(zhì)組成及其性質(zhì)的復(fù)雜性，在食品分析中，通常用食品的總氮量表示，蛋白質(zhì)是食品含氮物質(zhì)的主要形式，每一蛋白質(zhì)都有其恒定的含氮量，用實(shí)驗(yàn)方法求得某樣品中的含氮量后，通過(guò)一定的換算系數(shù)。即可計(jì)算該樣品的蛋白質(zhì)含量。一般食品蛋白質(zhì)含氮量為l6％，即1份氮素相當(dāng)于6.25分蛋白質(zhì),以此為換算系數(shù)6.25，不同類的食物其蛋白質(zhì)的換算系數(shù)不同.如玉米、高梁、蕎麥,肉與肉制品取6.25，大米取5.95、小麥粉取5.7,乳制品取6.38、大豆及其制品取 5.17，動(dòng)物膠 5.55。測(cè)定原理：食品經(jīng)加硫酸消化使蛋白質(zhì)分解，其中氮素以氨的形式與硫酸化合成硫酸銨。然后加堿蒸餾使氨游離，用硼酸液吸收形成硼酸銨，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液或硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)鹽酸消耗量計(jì)算出總氮量，再乘以一定的數(shù)值即為蛋白質(zhì)含量，其化學(xué)反應(yīng)式如下。⑴消化反應(yīng)：有機(jī)物(含C、N、H、0、P、S等元素)+H2S04-T(NH4)2SO4+CO0+S02f+S03+H3PO4+C02蒸餾反應(yīng)：(NH4)2SO4+2NAOH—2NH3T+2H2O+NA2SO42NH3+4H3B04(NH4)2B4O7+5H2O滴定反應(yīng)：(NH4)2B4O7+2HCH+5H2OT2NH4CH+4H3BC或(NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2試劑與儀器：1、硫酸鉀；2、硫酸銅；叮叮小文庫(kù)3、濃硫酸；4、4%硼酸溶液（飽和溶液）;5、40%氫氧化鈉溶液；6、混合指示劑：臨用時(shí)把（溶解于95%乙醇的）0」％甲基紅溶液10毫升和（溶于95%乙醇的0）」％甲基藍(lán)溶液5毫升混合而成；7、0.1N鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液或0.1N硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；8、凱氏定氮儀一套。9、定氮瓶500ml二只。10、三角瓶250ml3只。11、量筒50ml、10ml、100ml。12、吸管10ml。13、酸式滴定管1支,規(guī)格25ml。14、小漏斗1只。操作方法：1、樣品消化：精密稱取 0.200-2.00g固體樣品或2-5g半固體樣品或吸取 10-20ml液體樣品（約 相當(dāng)?shù)?0-40mg），移入干燥的 500ml定氮瓶中，加入 0.5g硫酸銅，10g硫酸鉀及20毫升硫酸， 稍搖勻后于瓶口放一小漏斗，將定氮瓶以 45度角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上，小火加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強(qiáng)火力，并保持瓶?jī)?nèi)液體微沸，至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5小時(shí)。取下放冷，小心加100ml水，放冷。取與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀、硫酸，用同一方法做試劑空白試驗(yàn)。2、蒸餾、吸收：按圖裝好定氮裝置。接收瓶?jī)?nèi)加入 50ml4%硼酸溶液及混合指示劑 5滴，并使冷凝管的下端插入液面下；將 70ml40%氫氧化鈉溶液慢慢通過(guò)安全漏斗進(jìn)入蒸餾燒瓶中，用直火加熱蒸餾30分鐘，移動(dòng)接收瓶，使冷凝管下端離開(kāi)液面，再蒸餾 1min，然后用少量水沖洗冷凝管下端外部，取下接收瓶。 （接收瓶?jī)?nèi)的溶液呈藍(lán)色 ）。3、滴定：以0.1N鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液定至溶液灰色或淡紫色為終點(diǎn)。 同時(shí)作一試劑空白測(cè)定除不加樣 品外，叢消化開(kāi)始操作完全相同。計(jì)算：蛋白質(zhì)（％）=（（V1-V2）XNX0.014XF）X100/m2叮叮小文庫(kù)V1:樣品消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積， ml;V2:試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積， ml；N:硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的當(dāng)量濃度；0.014: 1N硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 1ml相當(dāng)于氮克數(shù)；m樣品的質(zhì)量（體積）， g（ml）；氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。注：（1）樣品應(yīng)是均勻的，固體樣品應(yīng)預(yù)先研細(xì)混勻，液體樣品應(yīng)振搖或攪拌均勻。（2）樣品放入定氮瓶?jī)?nèi)時(shí)，不要沾附頸上， 萬(wàn)一沾附可用少量水沖下， 以免被檢樣消化不完全，結(jié)果偏低。3）消化時(shí)如不容易呈透明溶液，可將定氮瓶放冷后，慢慢加入30%過(guò)氧化氫2-3ml，促使氧化。4）在整個(gè)消化過(guò)程中，不要用強(qiáng)火，保持和緩的沸騰，使火力集中在凱氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白質(zhì)在無(wú)硫酸存在的情況下 ，使氮有損失。（5） 如硫酸缺少，過(guò)多的硫酸鉀會(huì)引起氨的損失，這樣會(huì)形成硫酸氫鉀，而不與氨作用，因此 當(dāng)硫酸過(guò)多的被消耗或樣品中脂肪含量過(guò)高時(shí)，要增加硫酸的量。（6）加入硫酸鉀的作用為增加溶液的沸點(diǎn)，硫酸銅為催化劑，硫酸銅在蒸餾時(shí)作堿性反應(yīng)的指 示劑。（7） 混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。（8）氨是否完全蒸餾岀來(lái)，可用精密 PH試紙?jiān)囸s岀液是否為堿性。（9） 以硼酸為氨的吸收液，可省去標(biāo)定堿液的操作，且硼酸的體積要求并不嚴(yán)格，亦可免去用 移液管，操作比較簡(jiǎn)便。（10）吸收液也可以用 0.01當(dāng)量的酸代表硼酸，過(guò)剩的酸液用 0.01N堿液滴定，計(jì)算時(shí)， A為試劑空白消耗堿液數(shù)， B為樣品消耗堿液數(shù)， N為堿液濃度，其余均相同。（11）向蒸餾瓶中加入濃堿時(shí)， 往往岀現(xiàn)褐色沉淀物， 這是由于分解促進(jìn)堿與加入的硫酸銅反應(yīng)，生成氫氧化銅，經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀。 有時(shí)銅離子與氨作用，生成深蘭色的結(jié)合物[Cu（NH3）4]++下面我就針對(duì)幾點(diǎn)來(lái)說(shuō)明為何影響氨化完全和速度快的因素 ：3叮叮小文庫(kù)（1） K氏燒瓶和取樣量如果稱1g以上的樣品，就需要 K氏燒瓶最小500ml，800?1000ml的更好，這樣的 K氏燒瓶對(duì)于 縮短氨化時(shí)間，加熱的均勻性和完全氨化效果最好。（2） 分解劑AH2SO4和K2SO4的添加量有機(jī)無(wú)分解需要 H2SO4量，H2SO4應(yīng)根據(jù)有機(jī)物種類不同而加的量就不同，如果試樣含脂類高， 則加H2SO4多，為了提高分解溫度，要大量添加 K2SO4,但不能太多，也不能太少，太少則氨化不充分。K2SO4和H2SO4的添加比例是：1g樣品K2SO4：H2SO4=7g：12ml這種比例在國(guó)內(nèi)外都使用，是公認(rèn)的還有一種比例： K2SO4：H2SO4=1Q20ml催化劑用作催化劑的有 Hg、HgOSe，硒化合物，CuSO4TiO2，對(duì)Hg,HgO有毒但結(jié)果好，Se與CuSO4得到結(jié)果是一種，TiO2，的結(jié)果偏低，采用不同的催化劑則消化時(shí)間不同， HgO消化麥子為38,Se與CuSO4消化麥子55，TiO2消化麥子70,所以在給岀測(cè)定結(jié)果時(shí)要注明催化劑的類型。（3） 熱源的強(qiáng)度消化時(shí)熱源的強(qiáng)度同迅速消化和完全氨化關(guān)系很大， 即便鹽類K2SO4加得多，如果熱源弱，也是沒(méi)有意義的，熱源過(guò)強(qiáng)導(dǎo)致 H2SO4損失，使氨回收率低，另外 K氏瓶的容量大小，頸部的粗細(xì)和長(zhǎng)短等，也與熱源的強(qiáng)度有關(guān)。4）氨的蒸餾和吸收及滴定蒸餾有兩種：直接蒸餾（裝置簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性好）水蒸汽蒸餾蒸餾加NaOH是50%加的量為 H2SO4量的4倍，硫酸量為 12ml，貝UNaOH為12X4=48ml，而且 一般高于這個(gè)理論值，即加到 50?55ml，如果NaOH量加的不夠就變成 H2S,H2S是強(qiáng)酸，使顏 色變紅。吸收液有：1標(biāo)準(zhǔn)H2SO4用標(biāo)準(zhǔn)堿返滴定，甲醛紅指示劑4叮叮小文庫(kù)2硼酸用HCI進(jìn)行滴定，混合指示劑目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替 H2SO4這樣可省略了反滴定， H2SO4是強(qiáng)酸，要求較嚴(yán)，而 硼酸是弱酸，在滴定時(shí)，不影響指示劑變色范圍，另外硼酸為吸收液濃度在 3%以上可將氨完全吸收，為保險(xiǎn)期間一般用 4%6〉注意事項(xiàng)a.樣品應(yīng)時(shí)均勻的，若是固體樣品應(yīng)事先研細(xì)，液體樣要混合均勻。b.樣品放入K氏燒瓶時(shí)，不要黏附瓶頸上， 萬(wàn)一黏附可用少量水緩慢沖下， 以免被檢樣消化不完全，使結(jié)果偏低。c.消化時(shí)，如不容易呈透明溶液，可將 K氏燒瓶放冷后，加入 30%過(guò)氧化氫催化劑 2~3ml，促使氧化。d.在整個(gè)消化過(guò)程中，不要用強(qiáng)火，保持和緩的沸騰，使火力集中在 K氏燒瓶底部，以免附在壁上的蛋白質(zhì)在無(wú)硫酸存在的情況下，使氮有損失。e.如硫酸缺少，過(guò)多的硫酸鉀會(huì)引起氨的損失，這時(shí)會(huì)形成硫酸氫鉀， 而不與氨作用，因此當(dāng)硫酸過(guò)多底物被消耗掉或樣品中脂肪含量過(guò)高時(shí)，要添加硫酸量。f. 混合指示劑在堿性溶液中呈綠色， 在中性溶液中呈灰色， 在酸性溶液中呈紅色， 如果沒(méi)有溴甲酚綠，可單獨(dú)使用 0.1%甲基紅乙醇溶液。g.氨是否完全蒸餾岀來(lái)， PH試紙檢查餾岀液是否為堿性。h.向蒸餾瓶中加入濃堿時(shí)，往往岀現(xiàn)褐色沉淀無(wú)。這時(shí)由于分解促進(jìn)劑與加入的硫酸銅反應(yīng)， 生成氫氧化銅，經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀，有時(shí) Cu離子與氨作用生成深蘭色的絡(luò)合物。i. 消化劑綠色后繼續(xù)消化 30分鐘即可。K氏微量定氮儀法3K氏半微量定氮儀法 (2 、3原理一樣)操作方法大同小異，半微量法消化后，定容 100ml，然后吸25ml蒸餾吸收液吸收。計(jì)算總氮 ％=(N(V2-V1)X0.014)/(WX10/100)X100對(duì)于微量定氮儀法，儀器有了改進(jìn)，樣液稱樣少，蒸餾消化液也少，其它基本一樣。K氏自動(dòng)定氮法原理與上面一樣，儀器，采用 K氏自動(dòng)定氮儀：其裝置內(nèi)具有自動(dòng)加堿蒸餾裝置，自動(dòng)吸收和滴定裝置以及自動(dòng)數(shù)字顯示裝置， 消化裝置：由優(yōu)質(zhì)玻璃制成的 K氏消化瓶以及紅外線裝置的消化5叮叮小文庫(kù)爐。二水揚(yáng)酸比色法1原理： 樣品中的pro經(jīng)H2SO4消化轉(zhuǎn)化為銨鹽溶液后，在一定的酸度和溫度下與水揚(yáng)酸鈉和次氯酸鈉作用生成有顏色的化合物， 可以在波長(zhǎng)660nm處比色測(cè)定，求岀樣品含氮量，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。方法(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取6個(gè)25ml容量瓶編號(hào)0123456分別加空白酸液 2ml分別加磷酸鹽緩沖液 5ml稀釋至總體體積至 15ml分別加水揚(yáng)酸鈉 5ml37C水浴15分鐘加入次氯酸鈉2.5ml37C水浴15分鐘取岀試液于660nm下進(jìn)行比色，繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品處理：準(zhǔn)確稱樣0.20~1.00gT于K氏瓶中T加15mlH2SO4和5g催化劑電爐上加熱到沸騰后加大火力消化 T直到岀現(xiàn)暗綠色時(shí) T搖動(dòng)瓶子 TK 氏瓶全部消化后 T冷卻 T加水至 250ml容量瓶。樣品測(cè)定：準(zhǔn)確吸取上述消化溶液 10mlT于100ml容量瓶中T定容T準(zhǔn)確吸 2mlT于25ml容量瓶中T加5ml磷酸緩沖液T以下操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的步驟相同并以試劑空白微對(duì)照，測(cè)得樣液的光密度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出其含氮量。6叮叮小文庫(kù)計(jì)算CxF含氮%=..................................................... X 100WX1000X1000C---從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查岀測(cè)定樣液的含氮量 ( Ug)F---樣品溶液的稀釋倍數(shù)W---樣品重量(g)蛋白質(zhì)％=總氮%XK(K可為6.25，也可查)注意事項(xiàng)：當(dāng)天消化液最好當(dāng)天測(cè)定，結(jié)果重現(xiàn)性好，如果樣液改至第二天比色就有變化。當(dāng)在PH和試劑適當(dāng)范圍內(nèi)加入氯源后，顏色的顯色和溫度有關(guān)，應(yīng)嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度。這種方法測(cè)定結(jié)果基本與K氏法一致。試劑(1) 氯標(biāo)液：稱經(jīng) 110C干燥2h的硫酸銨0.4719g于燒瓶中定容 10m|f此液1ml相當(dāng)于1.0mg氮標(biāo)液T使用時(shí)配制成 1ml相當(dāng)于2.50Ug氮標(biāo)液。(2) 空白酸液：稱0.50g蔗糖T加15mlH2SO4和5g催化劑T與樣品一樣消化 T定容 250mT使用時(shí)吸收此液10m|T加水至100ml為工作液備用。磷酸鹽緩沖液：稱7.1g磷酸氫二鈉T加38g磷酸三鈉T加20g三九石酸鉀鈉T加400ml水溶解T過(guò)濾T另稱 35gNaOH溶于100ml水中T冷至室溫T緩緩地?cái)嚢杓尤肓姿猁}溶液中 T加7叮叮小文庫(kù)入水稀釋至1000ml備用。(4) 水揚(yáng)酸鈉溶液：稱 25g水楊酸鈉和0.15g亞硝基鐵氰化鈉溶于 200ml水中過(guò)濾，加水稀釋至500ml(5) 次氯酸鈉溶液：吸 4ml安替富民液，用水稀釋至 100ml5儀器(1) 分光光度計(jì)(2)恒溫水浴三紫外分光光度法1原理：pro及其降解產(chǎn)物的芳香環(huán)基 ，在紫外區(qū)內(nèi)對(duì)某一波長(zhǎng)具有一定的光選擇吸收，在 280nm下，光吸收與pro濃度(3?8mg/ml)成直線關(guān)系，因此，通過(guò)測(cè)定 pro溶液的吸光度，并參照事先用氏定氮法分析的標(biāo)準(zhǔn)樣品，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查岀蛋白質(zhì)的含量。試劑：(1) 0.1mol/l 檸檬酸水溶液。(2) 8mol/l脲［(NH2) 2C0］的2NNaOH溶液。 脲的2N氫氧化鈉液95%乙醇無(wú)水乙醚儀器751型的紫外分光光度計(jì)離心機(jī)操作方法(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取樣品 .2.00g，置于50ml燒瓶中，加入 0.1mol/l檸檬酸水溶液8叮叮小文庫(kù)30ml，攪拌30分鐘使其充分溶解，用四層紗布過(guò)濾于玻璃離心管中，以每秒鐘3000~5000轉(zhuǎn)的速度離心10分鐘，分別吸岀上清夜0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml于6個(gè)10ml容量瓶鐘，每個(gè)容量瓶，8mol/l脲的氫氧化鈉溶液充分搖2分鐘(如果離心再次離心)，取透明液于比色皿中，在280nm下測(cè)定其吸光度。(做參比值)以事先用K氏定氮法測(cè)定的樣品中蛋白質(zhì)的含量微橫坐標(biāo)上面的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）樣品測(cè)定準(zhǔn)確稱取試樣I.OOgT于50ml燒杯中加0.1mol/l檸檬酸溶液30ml^攪拌10分鐘四層紗布 過(guò)濾到離心管中-用8mol/L脲的NaOH溶液定容，搖勻后于 280nm下測(cè)吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查 岀pro的含量。計(jì)算：蛋白質(zhì)=C/WX100C----從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的 pro含量（mgW----測(cè)定樣品溶液相當(dāng)于樣品量（ mg說(shuō)明：a.此法運(yùn)用于糕點(diǎn)，牛乳和可溶性 pro樣品，測(cè)定糕點(diǎn)時(shí)，應(yīng)把表皮顏色去掉。b.溫度對(duì)pro水解有影響，操作溫度應(yīng)控制在20~30C。四雙縮脲法-皮尼克法原理：雙縮脲在堿性條件中，能與 CuSO4吉合成紅紫色的絡(luò)合物。 pro分子中含有肽鏈與雙縮脲結(jié)構(gòu)相