基于發(fā)光細菌的微生物開放性實驗設(shè)計及實踐摘要：針對獨立學(xué)院微生物實驗教學(xué)中綜合性、探索性實驗較少，學(xué)生普遍缺乏主動性、參與度低等問題，利用發(fā)光細菌的顯光性與在實際毒性檢測中有廣泛應(yīng)用等特點，設(shè)計一系列微生物開放性創(chuàng)新實驗。實驗設(shè)計以發(fā)光細菌作為主要實驗菌種材料，對實驗內(nèi)容進行精心設(shè)計，教學(xué)目標涵蓋微生物學(xué)實驗基礎(chǔ)技能、創(chuàng)新能力、分析及解決問題能力的培養(yǎng)。圍繞教學(xué)目標將實驗內(nèi)容分為基礎(chǔ)、應(yīng)用和挑戰(zhàn)探索三大模塊，采用遞進式教學(xué)方式，模塊間相對獨立而又前后關(guān)聯(lián)，能夠靈活適應(yīng)實際教學(xué)。實踐表明，基于發(fā)光細菌的開放性實驗可有效提高學(xué)生的參與積極性以及課后深入學(xué)習的主動性，并對學(xué)生的實踐分析能力和創(chuàng)新能力起到良好的促進作用。關(guān)鍵詞：發(fā)光細菌；開放性實驗；微生物；實驗設(shè)計；實踐DesignandPracticeofMicrobiologyOpeningExperimentBasedonPhotobacteriaAbstract:TherearefewcomprehensiveandexploratoryexperimentsinMicrobiologyExperimentcourseinindependentcolleges,andstudentsgenerallylackinitiativeandparticipation.Tosolvethisproblem,aseriesofopeningandinnovativeexperimentsonmicrobesaredesigned.Theexperimentsbaseontheluminosityofphotobacteriaanditswideapplicationinactualtoxicitydetection.Intheexperiments,photobacteriaareusedasthemainmicrobialspecies,andtheexperimentalcontentsarewell-designed.Theteachingobjectivesincludethecultivationofbasicskillsinmicrobiologyexperiments,innovationabilityandtheabilitytoanalyzeandsolveproblems.Theexperimentalcontentsincludebasicmodules,advancedmodules,andinnovativeapplicationmodules.Themodulesarerelativelyindependentandrelated,whichcanbeflexiblyadaptedtothepracticalteachingprocess.Ourresultsshowedthattheopeninginnovativeexperimentsbasedonphotobacteriaeffectivelyimprovestudents'enthusiasmforparticipationandtheinitiativeofin-depthstudyafterclass,andpromotetheirabilityandinnovation.Keywords:photobacteria;openingexperiment;microbiology;experimentdesign;practice目前，在獨立學(xué)院生物與環(huán)境類專業(yè)的實驗教學(xué)中，大部分傳統(tǒng)實驗往往以驗證性實驗為主，學(xué)生容易缺乏主動性和積極性，為學(xué)生綜合能力和創(chuàng)新能力的培養(yǎng)帶來困難。而開放性創(chuàng)新實驗是一種新型的實驗教學(xué)環(huán)節(jié)，其實驗選題、實驗時間開放，有利于教師在實驗選題和內(nèi)容方面創(chuàng)新，有助于激發(fā)學(xué)生學(xué)習熱情，提升學(xué)生的創(chuàng)新素質(zhì)、實踐能力和工程意識［1-4］，成了課程實驗的有力補充。因此，我們在創(chuàng)新應(yīng)用型人才培養(yǎng)目標指導(dǎo)下，結(jié)合國家創(chuàng)新型人才需求，集中實驗教學(xué)資源，開設(shè)了系列開放創(chuàng)新實驗項目。其中基于發(fā)光細菌的微生物系列實驗，經(jīng)過教學(xué)實踐，教學(xué)內(nèi)容日趨完善，獲得較好的效果。發(fā)光細菌是一類在正常的生理條件下能夠發(fā)出可見熒光的細菌，其熒光波長在450~490nm之間，在黑暗處肉眼可見。由于發(fā)光細菌非常敏感，對環(huán)境中的毒素反應(yīng)迅速，可以用于生物毒性大小的檢測同。較之于傳統(tǒng)動物（小鼠、魚類）或藻類毒性實驗，發(fā)光細菌實驗不但耗時短（僅需0.25~1h），而且快速、靈敏，成本更低，在環(huán)境污染監(jiān)

測、食品衛(wèi)生快速檢測等方面已得到廣泛的關(guān)注和重視[5-9]o此外，發(fā)光細菌無毒無害，可發(fā)出美麗的藍綠熒光，容易激發(fā)學(xué)生好奇心，產(chǎn)生動手探索的意愿。本文選擇發(fā)光細菌作為微生物實驗對象，進行了微生物開放性創(chuàng)新實驗設(shè)計，可以激發(fā)學(xué)生自覺主動進行實驗實踐的同時，還拓寬學(xué)生眼界，促進了學(xué)生的創(chuàng)新能力、分析問題和解決問題的能力的培養(yǎng)。1教學(xué)目標與指導(dǎo)思想本文實驗設(shè)計以發(fā)光細菌作為主要實驗菌種材料，在滿足學(xué)生微生物學(xué)實驗基礎(chǔ)技能培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，提供更豐富、更多元化的微生物實驗項目，激發(fā)學(xué)生探索的興趣，拓展學(xué)生在水質(zhì)急性毒性評價、固定化酶、菌種保藏、微生物制劑等方面的理論知識，培養(yǎng)學(xué)生利用發(fā)光細菌進行毒性實驗、對未知細菌進行PCR鑒定、對酶進行提取和純化等應(yīng)用實驗技能。同時設(shè)置可靈活調(diào)節(jié)的研究型內(nèi)容，鼓勵學(xué)生積極分析問題，創(chuàng)造性地解決問題，培養(yǎng)其探索精神與研究能力。實驗設(shè)計采用以解決問題為導(dǎo)向的教學(xué)模式以及進階式模塊設(shè)計，從分析問題、解決問題、思辨能力等多方面培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新研究能力。2進階式模塊化教學(xué)設(shè)計2.1開放性實驗教學(xué)內(nèi)容及開展形式開放性實驗教學(xué)內(nèi)容相對靈活，圍繞教學(xué)目標將實驗內(nèi)容分為基礎(chǔ)、應(yīng)用和挑戰(zhàn)探索三大模塊。學(xué)生在基礎(chǔ)模塊中學(xué)習掌握基本的微生物常規(guī)實驗技能，然后根據(jù)個人興趣選擇后期的應(yīng)用模塊或探索創(chuàng)新模塊實驗，如毒性快速檢測實驗、發(fā)光細菌PCR鑒定、熒光素酶純化實驗等。探索創(chuàng)新模塊旨在鼓勵學(xué)生圍繞實驗?zāi)繕诉M行創(chuàng)新實驗設(shè)計，激發(fā)學(xué)生的創(chuàng)造思維。課程開展采用開放形式，在實驗周期內(nèi)實驗室和實驗時間盡量對學(xué)生進行開放，在空間、時間和教學(xué)內(nèi)容上為學(xué)生提供便利。課程教學(xué)采用分組形式進行，每組2~3人，組內(nèi)進行分工合作。組長總體負責實驗設(shè)計和任務(wù)分配，組員之間需要進行討論，完成問題分析和確定方案。教師提前準備好完善的實驗指導(dǎo)資料，在實驗操作時只是在必要時機給予學(xué)生指導(dǎo)。這種形式讓學(xué)生充分發(fā)揮個人主觀能動性，同時亦鍛煉學(xué)生的團隊合作和溝通能力。學(xué)生之間的討論、協(xié)作與互助，有助于學(xué)生研究素養(yǎng)的提高。2.2模塊化教學(xué)設(shè)計實驗采用模塊化設(shè)計，每個模塊的內(nèi)容與目標相對獨立而又前后關(guān)聯(lián)，對學(xué)生能力的培養(yǎng)要求逐步提高。整個實驗?zāi)K包含基礎(chǔ)模塊實驗、應(yīng)用模塊實驗和挑戰(zhàn)探索模塊實驗，各模塊詳細內(nèi)容如圖1所示。基礎(chǔ)模塊實驗主要側(cè)重微生物學(xué)實驗基礎(chǔ)技能訓(xùn)練；應(yīng)用模塊實驗則重點放在知識應(yīng)用層面，通過所學(xué)知識解決現(xiàn)實問題。挑戰(zhàn)與探索模塊實驗則強調(diào)創(chuàng)新應(yīng)用，注重分析問題和解決問題能力的創(chuàng)新能力培養(yǎng)。圖1進階式模塊化教學(xué)設(shè)計在實際教學(xué)中，教師可根據(jù)學(xué)生實際情況和教學(xué)需要對實驗項目進行靈活挑選與配置。例如，針對不同基礎(chǔ)的學(xué)生，教師可以選擇不同模塊進行實驗教學(xué)。以學(xué)校開設(shè)的開放性實驗課為例，對沒有微生物學(xué)基礎(chǔ)的非相關(guān)專業(yè)學(xué)生，則以跨學(xué)科學(xué)習提高學(xué)生綜合素養(yǎng)為目標，可選擇基礎(chǔ)模塊項目進行分層次教學(xué)。利用發(fā)光細菌的有趣性降低學(xué)生學(xué)習的恐懼心理，在習得微生物學(xué)基礎(chǔ)技能（包括顯微鏡的使用、培養(yǎng)基的配制和滅菌、無菌操作等）的同時，感受微生物的神奇與體驗親手繪制微生物畫的快樂。基礎(chǔ)模塊實驗項目還可用于替代部分常規(guī)微生物實驗課程項目（如微生物的分離純化、無菌操作等），以進一步提升常規(guī)課程的趣味性與吸引力。對于已經(jīng)學(xué)習過微生物實驗課程的相關(guān)專業(yè)學(xué)生（如環(huán)境工程、食品質(zhì)量與安全、生物制藥等），可以選擇應(yīng)用模塊和挑戰(zhàn)與探索模塊實驗項目。應(yīng)用模塊項目與現(xiàn)實中環(huán)境有毒有害物質(zhì)檢測或食品安全檢測等技術(shù)密切相關(guān)，適合于大部分學(xué)生，難度適中，又有很強的實用性。在拓寬學(xué)生知識面的同時，培養(yǎng)了學(xué)生的實踐能力、數(shù)據(jù)分析能力和初步解決問題的能力。挑戰(zhàn)與探索模塊項目是應(yīng)用模塊的升級，學(xué)生面臨的難點和需要思考的問題更多，難度更大，具有一定的挑戰(zhàn)性。該模塊項目需要學(xué)生有創(chuàng)新精神，能提煉科學(xué)問題，圍繞問題進行解決方案的設(shè)計，最終將設(shè)計方案實施去回答問題。可極大地鍛煉學(xué)生分析問題和解決問題的能力。3開放性實驗內(nèi)容設(shè)計3.1基礎(chǔ)模塊實驗本模塊實驗圍繞顯微鏡觀察技術(shù)、培養(yǎng)基的配制和滅菌、無菌操作、平板劃線分離等微生物實驗的基礎(chǔ)技能訓(xùn)練為目標，以發(fā)光細菌為對象精心進行實驗設(shè)計，如圖2所示。圖2基礎(chǔ)模塊實驗項目與實驗?zāi)康囊浴鞍l(fā)光細菌的分離與純化”項目為例，項目設(shè)置讓學(xué)生從新鮮海魚或海產(chǎn)品中，采用平板劃線分離的方法對發(fā)光細菌進行分離和純化。最終學(xué)生在掌握平板劃線分離純化技術(shù)的同時，體驗從環(huán)境中分離出能自發(fā)發(fā)出美麗藍綠光的純種發(fā)光細菌。本實驗分離出的未知純種發(fā)光細菌還可用作應(yīng)用模塊中“發(fā)光細菌的PCR鑒定”項目的實驗材料。實驗項目“會發(fā)光的畫”在內(nèi)容上設(shè)計可以涵蓋培養(yǎng)基的配制和滅菌以及無菌操作技術(shù)，學(xué)生以發(fā)光細菌為原料，以培養(yǎng)基為畫布,在學(xué)習無菌操作技術(shù)的同時，自行設(shè)計圖案，最終長出各具特色的會發(fā)光的微生物畫作。本項目在學(xué)校實踐教學(xué)中受到學(xué)生的歡迎。發(fā)光細菌分離和純化的實驗主要步驟有如下4個方面。1） 準備工作購買新鮮海魚、海產(chǎn)品（如八爪魚、小黃魚、獅頭魚、魷魚等），用無菌的剪刀在超凈臺直接將魚分成小塊，放在干凈的容器里，放置幾個小時，在黑暗環(huán)境中觀察魚體上星星點點的綠光。2） 培養(yǎng)基制備按照培養(yǎng)基配方，每組準備平板培養(yǎng)基10個。3） 劃線分離在黑暗中用接種針輕輕接觸發(fā)光的光點，立即在平板上劃線，然后置于20r恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18~20h。取出培養(yǎng)后的培養(yǎng)皿，在暗室中觀察是否有發(fā)光點或線。選擇發(fā)光良好，外形圓整的單個菌落，用接種環(huán)輕輕接觸到這個菌落的光點，重新劃線后，在20r培養(yǎng)18~20h；若沒有單菌落，而有發(fā)光的線，則可采用分區(qū)稀釋劃線，直至出現(xiàn)發(fā)光的單菌落。4） 菌種保藏和觀察得到純菌后，可將菌轉(zhuǎn)接至斜面中進行菌種短期保藏，同時可對發(fā)光細菌進行顯微觀察和菌落觀察。純種發(fā)光細菌培養(yǎng)物，在黑暗處可發(fā)出明亮的藍綠光，單菌落在光照下觀察，表面凸起，呈現(xiàn)水滴似的透明無色。3.2應(yīng)用模塊實驗應(yīng)用模塊實驗?zāi)康氖峭卣箤W(xué)生知識面，將發(fā)光細菌和環(huán)境有毒有害污染物急性毒性快速檢測技術(shù)中相結(jié)合，將毒理學(xué)基礎(chǔ)理論知識應(yīng)用到實際的監(jiān)測技術(shù)，培養(yǎng)學(xué)生的綜合應(yīng)用能力［10］，如圖3所示。實驗項目主要包括發(fā)光細菌法在水質(zhì)毒性檢測與評價、單一化合物毒性評價、二元混合物的聯(lián)合毒性評價中的具體應(yīng)用等［11-14］，讓學(xué)生理解并掌握細菌DNA提取方法、掌握PCR技術(shù)，并學(xué)習利用Blast數(shù)據(jù)分析，進行微生物鑒定。應(yīng)用模塊實驗實驗項目水質(zhì)急性

毒性檢測

與評價防腐劑

急性毒

性評價發(fā)光細菌

的PCR

鑒定抗生素二元混合物的急性聯(lián)合毒性分析實驗?zāi)康恼莆瞻l(fā)光細菌法檢測與評價水質(zhì)綜合毒性方法掌握利用發(fā)光細菌進行化合物EC50測定的方法3掌握細菌DNA提取PCR、Blast

數(shù)據(jù)分析

方法掌握發(fā)光細菌二元混合物聯(lián)合作用分析的方法圖3應(yīng)用模塊實驗項目與實驗?zāi)康乃|(zhì)急性毒性檢測實驗的具體流程有如下6個步驟。1） 發(fā)光細菌新鮮菌懸液的制備斜面菌種培養(yǎng)。于測定前48h取保存菌種，于新鮮斜面上接出第一代斜面；20培養(yǎng)20h立即轉(zhuǎn)接第二代斜面；20龍培養(yǎng)12~18h,再接出第三代斜面。取第三代斜面菌種近1環(huán)，接種于裝有50mL培養(yǎng)液的250mL三角瓶內(nèi)，20龍，180r/min下培養(yǎng)16~20h備用。將培養(yǎng)液稀釋至OD值為0.8~1.0，多功能酶標儀檢測初始發(fā)光亮度不低于107RLU，置于20龍水浴備用。2） 待分析水樣樣品準備用清潔干燥的容器采集廢水、池塘水等多種水樣，同時實驗室也配置一定濃度的含Zn2+的水樣作為待測樣品。3） 工作菌液準備將1mL新鮮菌液稀釋100倍，20龍恒溫搖床150r/min振蕩20min，檢測發(fā)光強度大于1.0*107RLU,即為有效工作菌液。4） 預(yù)實驗按對數(shù)系列將樣品液稀釋為5個濃度梯度：100%、10%、1%、0.1%、0.01%，以3%NaCl溶液為對照。在2mL的待測梯度樣品中加入200pL工作菌液。準確計時15min，期間充分振蕩搖勻。使用多功能酶標儀檢測發(fā)光強度，每個實驗組3個平行樣，每個平行樣200pL。⑤確定1%~100%的相對發(fā)光強度落在哪一濃度范圍。5） 毒性實驗在1%~100%相對發(fā)光度所落在的濃度范圍內(nèi)再增配6~9個濃度（例如，若落在1%~10%，應(yīng)稀釋為1%、2%、4%、6%、8%、10%）。將2mL的濃度系列溶液中加入200pL工作菌液。準確計時15min，期間充分振蕩搖勻。使用多功能酶標儀檢測發(fā)光強度，每個實驗組3個平行樣。6） 計算樣品的相對發(fā)光度，繪制樣品濃度與發(fā)光亮度的關(guān)系曲線，并對樣品急性毒性進行表達。3.3挑戰(zhàn)探索模塊實驗挑戰(zhàn)探索模塊實驗?zāi)康脑谟阱憻拰W(xué)生的科研思維、創(chuàng)新能力以及分析問題和解決問題的能力，如圖4所示。本模塊實驗項目在實驗設(shè)計中預(yù)留了可靈活調(diào)節(jié)的研究型內(nèi)容，鼓勵學(xué)生積極分析問題，創(chuàng)造性地解決問題。如鼓勵學(xué)生思考如何校正毒性檢測與評價實驗中各種影響因子,如有機助溶劑、色度等問題［15-17］，要求學(xué)生通過文獻調(diào)研，分組討論，最終提出實驗方案并實施。同時設(shè)計了自選題項目，給學(xué)生以最大的能動性空間。挑戰(zhàn)探索模塊實驗實驗"項目有機助溶

劑對發(fā)光

細菌毒性

檢測的

影響發(fā)光細菌毒性檢測中色度校正研究熒光素

酶的提

取與

純化發(fā)光細菌凍干粉保護劑配方優(yōu)化自選相關(guān)樣品，建立毒性檢測分析理解發(fā)光分析并探細菌毒性檢測的影響因子、學(xué)習設(shè)計實驗并進行影響討實驗對象的色度對檢測的影響，設(shè)

計實驗進

行校正掌握細菌破壁技術(shù),設(shè)計方案優(yōu)化熒光素酶的提取純化過程掌握微生物凍干粉制備方法,設(shè)計方案優(yōu)化凍干保護劑培養(yǎng)自主選題，提出問題和解決問題的能力圖4挑戰(zhàn)探索模塊實驗項目與實驗?zāi)康脑诒灸K實驗的基礎(chǔ)上，學(xué)生還可結(jié)合各種大學(xué)生競賽項目，進行更深入的研究和探索。以學(xué)校開設(shè)的“熒光素酶的提取和純化”實驗項目為例，學(xué)生在實驗后期以相關(guān)題目“基于發(fā)光細菌的熒光素酶提取和純化研究”參加了廣東省生化技能大賽，對學(xué)生的綜合創(chuàng)新能力鍛煉起到很好(a)明亮發(fā)光桿菌液體培養(yǎng)物與培養(yǎng)基對比圖(a)明亮發(fā)光桿菌液體培養(yǎng)物與培養(yǎng)基對比圖的促進和支持。4創(chuàng)新實驗成效目前，學(xué)校已經(jīng)成功開設(shè)了一系列的基于發(fā)光細菌的創(chuàng)新開放性實驗項目，其中學(xué)生對開放課程報名響應(yīng)情況如表1所示。表1開放性實驗報名響應(yīng)情況發(fā)光細菌發(fā)光細菌發(fā)光細菌凍水質(zhì)急性毒的DIY的分離與干粉保護劑性檢測與培養(yǎng)純化優(yōu)化研究評價課程名額/個 20202020報名人數(shù)/人 72584050由表1可見，各開放性實驗項目的報名人數(shù)均大大超出預(yù)設(shè)的班級名額，表明學(xué)生對于開放創(chuàng)新性實驗的接受度較高。少數(shù)未選上課程的學(xué)生會主動聯(lián)系老師，希望能到實驗室旁聽，尤其是發(fā)光細菌DIY培養(yǎng)項目，學(xué)生可動手設(shè)計各種微生物畫像，吸引了大量外專業(yè)學(xué)生選課。也側(cè)面反映出學(xué)生對開放創(chuàng)新性實驗的興趣程度和參與積極性。另外，對比基