1.2基因工程基本操作程序第1頁(yè)①目標(biāo)基因獲?、诨虮硎据d體構(gòu)建（關(guān)鍵）③將目基因?qū)胧荏w細(xì)胞④目標(biāo)基因檢測(cè)與判定四個(gè)步驟第2頁(yè)一、目標(biāo)基因獲取(一)、目基因主要是___________________編碼蛋白質(zhì)基因（二）、獲取目標(biāo)基因慣用方法從基因文庫(kù)中獲取利用PCR技術(shù)擴(kuò)增人工合成第3頁(yè)1)基因文庫(kù)？1.從基因文庫(kù)中獲取目基因?qū)⒑心撤N生物不一樣基因許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物不一樣基因，稱為基因文庫(kù)2)基因文庫(kù)種類:種類基因組DNA文庫(kù)：含有一個(gè)生物全部基因部分基因文庫(kù)：只包含了一個(gè)生物部分基因，如：cDNA文庫(kù)第4頁(yè)受體菌整個(gè)群體包含了這種生物全部基因基因組文庫(kù)構(gòu)建模式圖第5頁(yè)cDNA文庫(kù)構(gòu)建模式圖雜交雙鏈(單鏈RNA/單鏈DNA)單鏈DNA反轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA(cDNA)某種生物mRNA某種酶DNA聚合酶與載體連接后導(dǎo)入受體菌貯存，組成cDNA文庫(kù)第6頁(yè)思索：怎樣從基因文庫(kù)中得到我們所需目標(biāo)基因呢？基因核苷酸序列基因功效基因在染色體上位置基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因表示產(chǎn)物蛋白質(zhì)依據(jù)基因相關(guān)信息第7頁(yè)①概念：PCR全稱為_(kāi)______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制________________核酸合成技術(shù)。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目基因②過(guò)程第8頁(yè)變性復(fù)性延伸第9頁(yè)1.變性（90℃-95℃）雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成________氫鍵單鏈DNA2.復(fù)性

(55℃-65℃)溫度降低，

與DNA模板結(jié)合，形成局部______。雙鏈引物3.延伸（70℃-75℃）在

作用下，從引物

連接

，合成與模板互補(bǔ)DNA鏈。3′端脫氧核苷酸Taq酶第10頁(yè)2、詳細(xì)過(guò)程第11頁(yè)③原理：.DNA復(fù)制原理已知基因核苷酸序列四種脫氧核苷酸1對(duì)引物DNA聚合酶(Taq酶)④條件模板原料酶引物能量第12頁(yè)P(yáng)CR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原理原料條件不一樣點(diǎn)解旋方式場(chǎng)所酶結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)四種脫氧核苷酸模板、能量、酶高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制(PCR擴(kuò)增儀內(nèi))主要在細(xì)胞核內(nèi)熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）大量DNA片段形成整個(gè)DNA分子解旋酶、普通DNA聚合酶等第13頁(yè)3.人工合成1)反轉(zhuǎn)錄法：

雜交雙鏈(單鏈RNA/單鏈DNA)單鏈DNA雙鏈DNA(cDNA)目標(biāo)基因mRNA某種酶DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶第14頁(yè)2)依據(jù)已知氨基酸序列合成DNA法：蛋白質(zhì)氨基酸序列mRNA核苷酸序列基因脫氧核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目基因化學(xué)合成第15頁(yè)二、基因表示載體構(gòu)建（關(guān)鍵）①使目基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代②使目基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用1、基因表示載體構(gòu)建目標(biāo)？（P11）第16頁(yè)2、基因表示載體組成？開(kāi)啟子目基因終止子標(biāo)識(shí)基因思考1、開(kāi)啟子？終止子？標(biāo)識(shí)基因？它們作用是？2、作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目基因就可以完成任務(wù)嗎？3、基因表示載體構(gòu)建是千篇一律嗎？第17頁(yè)三、將目基因?qū)胧荏w細(xì)胞目標(biāo)基因進(jìn)入_____

____內(nèi)，而且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_

___和___

__過(guò)程轉(zhuǎn)化:受體細(xì)胞穩(wěn)定表示第18頁(yè)1、將目標(biāo)基因?qū)胫参锛?xì)胞方法：易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力②原理：Ti質(zhì)粒上T---DNA（可轉(zhuǎn)移DNA)能夠轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，而且整合到受體細(xì)胞染色體DNA上。①農(nóng)桿菌特點(diǎn)：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(

采取最多）

第19頁(yè)兩次拼接？?jī)纱螌?dǎo)入？組織培養(yǎng)技術(shù)第20頁(yè)（2）基因槍法（3）花粉管通道法第21頁(yè)顯微注射技術(shù)（最慣用，最有效）（3）將目基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法——受體細(xì)胞——慣用受精卵思考：為什么要用受精卵而不用體細(xì)胞？動(dòng)物細(xì)胞受精卵全能性大目標(biāo)基因表示載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵發(fā)育新性狀動(dòng)物過(guò)程：第22頁(yè)（2）將目基因?qū)胛⑸锛?xì)胞過(guò)程：Ca2+處理受體細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞重組表示載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子思索：早期基因工程用什么作受體細(xì)胞？為何？慣用原核生物，因?yàn)樵松锓敝晨?、多為單?xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少等。方法——Ca2+處理法用Ca2＋處理，增加細(xì)菌細(xì)胞壁通透性思索：為何要用Ca2+處理受體細(xì)胞？第23頁(yè)受體生物植物動(dòng)物微生物受體細(xì)胞導(dǎo)入方法受精卵體細(xì)胞受精卵細(xì)胞/個(gè)體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術(shù)用Ca2+處理成感受態(tài)細(xì)胞采取基因工程方法培育抗蟲(chóng)棉，以下導(dǎo)入目標(biāo)基因作法正確是（）

A.將毒素蛋白注射到受精卵中

B.將編碼毒素蛋白DNA序列，與質(zhì)粒重組，導(dǎo)入細(xì)菌，用該細(xì)菌感染棉體細(xì)胞，再進(jìn)行組織培養(yǎng)

C.將編碼毒素蛋白DNA序列，與質(zhì)粒重組，注射到棉子房并進(jìn)入受精卵

D.將編碼毒素蛋白DNA序列，注射到棉受精卵中BC第24頁(yè)四、目標(biāo)基因檢測(cè)與判定檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目標(biāo)基因1、導(dǎo)入檢測(cè)目：方法：DNA分子雜交技術(shù)第25頁(yè)從轉(zhuǎn)基因生物中提取基因組DNA探針？雜交對(duì)象？用放射性同位素標(biāo)識(shí)含目標(biāo)基因DNA片段15N15N14N探針轉(zhuǎn)基因生物DNA變性變性14N過(guò)程①.首先取出轉(zhuǎn)基因生物基因組DNA②.用含目標(biāo)基因DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)識(shí),以此做探針。③使探針和轉(zhuǎn)基因生物基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明目標(biāo)基因已插入染色體DNA中第26頁(yè)2、轉(zhuǎn)錄檢測(cè)目：檢測(cè)目基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA方法：分子雜交技術(shù)用放射性同位素標(biāo)識(shí)含目標(biāo)基因DNA片段探針？雜交對(duì)象？從轉(zhuǎn)基因生物中提取mRNA.3、翻譯檢測(cè)目：檢測(cè)目基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法:抗原抗體雜交技術(shù)從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)抗原？抗體？將目標(biāo)基因編碼蛋白質(zhì)注射進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行免疫產(chǎn)生對(duì)應(yīng)抗體4、個(gè)體生物學(xué)水平判定抗蟲(chóng)判定、抗病判定、活性判定等第27頁(yè)DNA分子雜交示意圖采取一定技術(shù)伎倆，將兩種生物DNA分子單鏈放在一起，假如這兩個(gè)單鏈含有互補(bǔ)堿基序列，那么，互補(bǔ)堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒(méi)有互補(bǔ)堿基序列部位，依然是兩條游離單鏈。第28頁(yè)歸納:基因工程基本操作程序獲取目標(biāo)基因從基因文庫(kù)利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表示載體目標(biāo)基因、開(kāi)啟子、終止子、標(biāo)識(shí)基因?qū)⒛繕?biāo)基因?qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法、Ca2+處理法目標(biāo)基因檢測(cè)與判定檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯判定：個(gè)體生物學(xué)水平判定第29頁(yè)第30頁(yè)1.原核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)開(kāi)啟子終止子開(kāi)啟子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成序列。沒(méi)有開(kāi)啟子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。終止子：位于基因尾端一段特殊DNA片斷，它能妨礙RNA聚合酶移動(dòng)，并使其從DNA模板鏈上脫離下來(lái)，使轉(zhuǎn)錄終止。RNA聚合酶:能夠識(shí)別開(kāi)啟子上結(jié)合位點(diǎn)并與其結(jié)合一個(gè)蛋白質(zhì).(以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落)第31頁(yè)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)序列叫做內(nèi)含子開(kāi)啟子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子：外顯子：2.真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)第32頁(yè)原核細(xì)胞真核細(xì)胞不一樣點(diǎn)編碼區(qū)是_____編碼區(qū)是間隔、_____相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)______和含有調(diào)控作用組成原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因