“”熒光與熒光分析“”熒光與熒光分析概述基本原理熒光分析儀器與技術(shù)應(yīng)用與示例目錄概述目光學(xué)光譜區(qū)10nm~200nm200nm~380nm380nm~780nm780nm~2.5μm2.5μm~50μm50μm~300

μm一、概述光學(xué)光譜區(qū)10nm~200nm200nm380nm780n熒光的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展1575年，西班牙醫(yī)生N.Monardes首先發(fā)現(xiàn)熒光1852年，Stokes發(fā)現(xiàn)熒光波長(zhǎng)比照射光波長(zhǎng)要長(zhǎng)，認(rèn)定熒光是發(fā)射光。

1867年，首次用于分析測(cè)定。

1952年，商品熒光分光光度計(jì)出現(xiàn)。

2008年，日本村修、美國馬丁·沙爾菲、美籍華裔錢永健因從水母中發(fā)現(xiàn)并發(fā)展了綠色熒光蛋白質(zhì)技術(shù)而獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。熒光的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展1575年，西班牙醫(yī)生N.Monard

什么是熒光？

當(dāng)紫外或可見光照射到某些物質(zhì)上時(shí)，這些物質(zhì)就會(huì)發(fā)射出波長(zhǎng)和強(qiáng)度各不相同的光線，停止照射光照射時(shí)，這種光線馬上或逐漸消失，這就是熒光。二、基本原理什么是熒光？當(dāng)紫外或可見分子發(fā)光的類型分子發(fā)光的類型可以按兩種不同的辦法加以分類,其中一種以激發(fā)的模式加以分類,另一種是按分子激發(fā)態(tài)的類型來分類.

按分子激發(fā)態(tài)的類型：熒光:由第一電子激發(fā)單重態(tài)所產(chǎn)生的輻射躍遷而伴隨的發(fā)光現(xiàn)象.磷光:由最低的電子激發(fā)三重態(tài)所產(chǎn)生的輻射躍遷而伴隨的發(fā)光現(xiàn)象.

分子發(fā)光的類型分子發(fā)光的類型可以按兩種不同的辦法加以分類,其按激發(fā)模式分類:光致發(fā)光:分子因吸收外來輻射的光子能量被激發(fā)所產(chǎn)生的發(fā)光.化學(xué)發(fā)光:分子的激發(fā)能量是由反應(yīng)的化學(xué)能提供.生物發(fā)光:分子的激發(fā)能量是由生物體釋放出來的能量提供.熱致發(fā)光:由熱活化的離子復(fù)合激發(fā)模式所引起的發(fā)光現(xiàn)象.場(chǎng)致發(fā)光:由電荷注入激發(fā)模式所產(chǎn)生的發(fā)光.摩擦發(fā)光:由摩擦激發(fā)模式所產(chǎn)生的發(fā)光.按激發(fā)模式分類:熒光產(chǎn)生的基本原理內(nèi)轉(zhuǎn)換（InternalConversion，IC）:對(duì)于具有相同多重度的分子，若較高電子能級(jí)的低振動(dòng)能層與較低電子能級(jí)的高振動(dòng)能層相重疊時(shí)，則電子可在重疊的能層之間通過振動(dòng)耦合產(chǎn)生無輻射躍遷，如S2-S1；T2-T1。系間跨躍（IntersystemConversion，ISC）:系間跨躍是發(fā)生在兩個(gè)不同多重態(tài)之間的無輻射躍遷，如從S1到T1，該躍遷是禁阻的。然而，當(dāng)不同多重態(tài)的兩個(gè)電子能層有較大重疊時(shí)，處于這兩個(gè)能層上的受激電子的自旋方向發(fā)生變化，即可通過自旋-軌道耦合而產(chǎn)生無輻射躍遷，該過程稱為系間跨躍。熒光:分子電子從單重激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)在很短時(shí)間（10-9-10-6s）躍遷到基態(tài)各振動(dòng)能層時(shí)所產(chǎn)生的光子輻射稱為熒光。磷光:分子電子從三重態(tài)最低振動(dòng)能層，躍遷到基態(tài)的各振動(dòng)能層所產(chǎn)生的輻射。熒光產(chǎn)生的基本原理內(nèi)轉(zhuǎn)換（InternalConversi單重態(tài)和三重態(tài)

電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；

單重態(tài)：全部軌道里的電子都是自旋配對(duì)的，S=0,M=1；

三重態(tài)：分子具有自旋不配對(duì)的電子，S=1,M=3.平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低；

大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；

單重態(tài)和三重態(tài)電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1S為電子處于單線態(tài)和三線態(tài)下的分子的∏電子受激發(fā)激發(fā)單重(線)態(tài)：分子吸收能量，電子自旋仍然配對(duì)，為單重(線)態(tài)，稱為激發(fā)單重態(tài)，以S1，S2…表示激發(fā)三重(線)態(tài)：分子吸收能量，電子自旋不再配對(duì)為三重，稱為激發(fā)三重態(tài)，以T1，T2….表示?；鶓B(tài)：電子自旋配對(duì)多重度=2s+1=1，為單重(線)態(tài)，以S0表示。處于單線態(tài)和三線態(tài)下的分子的∏電子受激發(fā)激發(fā)單重(線)態(tài)：分電子躍遷

處于激發(fā)態(tài)的電子，通常以輻射躍遷方式或無輻射躍遷方式再回到基態(tài)。

輻射躍遷主要涉及到熒光、延遲熒光或磷光的輻射；無輻射躍遷則是指以熱的形式輻射其多余的能量，包括振動(dòng)弛豫（VR）、內(nèi)轉(zhuǎn)移（IR）、外轉(zhuǎn)移（EC）及系間竄越（ISC）等。

各種躍遷方式發(fā)生的可能性及程度，與熒光物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)及激發(fā)時(shí)的物理和化學(xué)環(huán)境等因素有關(guān)。電子躍遷處于激發(fā)態(tài)的電子，通常以輻射躍遷方式或無輻射躍基態(tài)單重態(tài)激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)區(qū)別：電子自旋方向不同，激發(fā)三重態(tài)的能級(jí)稍低一些。電子躍遷類型允許躍遷禁阻躍遷S0S1,S2,S3……T1,T2,T3……基態(tài)單重態(tài)激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)區(qū)別：電子自旋方向不同，激發(fā)三

在單重激發(fā)態(tài)中，兩個(gè)電子平行自旋，單重態(tài)分子具有抗磁性，其激發(fā)態(tài)的平均壽命大約為10-8s，而三重態(tài)分子具有順磁性，其激發(fā)態(tài)的平均壽命為10-4~1s以上（通常用S和T分別表示單重態(tài)和三重態(tài)）。

電子躍遷類型激發(fā)態(tài)與基態(tài)中的電子自旋方向相反，稱為激發(fā)單重態(tài)（S）抗磁性激發(fā)態(tài)與基態(tài)中的電子自旋方向相同，稱為激發(fā)三重態(tài)（T）順磁性區(qū)別：電子自旋方向不同，激發(fā)三重態(tài)的能級(jí)稍低一些。在單重激發(fā)態(tài)中，兩個(gè)電子平行自旋，單重態(tài)分子分子的去激發(fā)無輻射躍遷輻射躍遷熒光（F）磷光（P）振動(dòng)弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移體系間跨越分子的去激發(fā)分子的去激發(fā)無輻射躍遷輻射躍遷熒光（F）磷光（P）振動(dòng)弛豫內(nèi)輻射躍遷熒光：受光激發(fā)的分子從第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)所發(fā)出的輻射。壽命為10-8~10-11s。由于是相同多重態(tài)之間的躍遷，幾率較大，速度大，速率常數(shù)kf為106~109s-1。

磷光：從第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)所發(fā)出的輻射。由于磷光的產(chǎn)生伴隨自旋多重態(tài)的改變，輻射速度遠(yuǎn)小于熒光，磷光壽命為10-4~10s。在光照停止后，仍可持續(xù)一段時(shí)間。輻射躍遷熒光：受光激發(fā)的分子從第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)回?zé)o輻射躍遷振動(dòng)弛豫它是指在同一電子能級(jí)中，電子由高振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)至低振動(dòng)能級(jí)，而將多余的能量以熱的形式發(fā)出。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間為10-12s數(shù)量級(jí)。內(nèi)轉(zhuǎn)換當(dāng)兩個(gè)電子能級(jí)非?？拷灾疗湔駝?dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，常發(fā)生電子由高能級(jí)以無輻射躍遷方式轉(zhuǎn)移至低能級(jí)。無輻射躍遷振動(dòng)弛豫外轉(zhuǎn)移

指激發(fā)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用及能量轉(zhuǎn)移，使熒光或磷光強(qiáng)度減弱甚至消失。這一現(xiàn)象稱為“熄滅”或“猝滅”。熒光與磷光的根本區(qū)別：

熒光是由激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能層至基態(tài)各振動(dòng)能層間躍遷產(chǎn)生的；

磷光是由激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能層至基態(tài)各振動(dòng)能層間躍遷產(chǎn)生的。外轉(zhuǎn)移系間竄越指不同多重態(tài)間的無輻射躍遷，例如S1→T1就是一種體系間跨躍。通常，發(fā)生體系間跨躍時(shí)，電子由S1的較低振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)移至T1的較高振動(dòng)能級(jí)處。有時(shí)，通過熱激發(fā)，有可能發(fā)生T1→S1，然后由S1發(fā)生熒光。這是產(chǎn)生延遲熒光的機(jī)理。改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋—軌道耦合進(jìn)行。hvAhvFS1T1S0hvP系間竄越hvAhvFS1T1S0hvPS2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫S2S1S0T1吸發(fā)發(fā)系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能l2l1l熒光的類型發(fā)射機(jī)制考慮：瞬時(shí)熒光和遲滯熒光（1）瞬時(shí)熒光:通常在吸收激發(fā)光后大約10-8s內(nèi)發(fā)射的,是由激發(fā)過程中最初生成的S1電子態(tài)所產(chǎn)生的輻射.瞬時(shí)熒光可能由處于S1電子態(tài)的分子或S1激發(fā)態(tài)分子與基態(tài)分子所形成的激發(fā)態(tài)二聚體產(chǎn)生的。低濃度(10-6M)芘溶液,熒光是紫色的,熒光光譜有結(jié)構(gòu)特征高濃度(10-3M)芘溶液,熒光是藍(lán)色的,熒光光譜沒有結(jié)構(gòu)特征熒光的類型發(fā)射機(jī)制考慮：瞬時(shí)熒光和遲滯熒光低濃度(10-6M(2)遲滯熒光物質(zhì)分子在剛性或粘稠介質(zhì)中,除了磷光譜外,還可能觀察到另一種長(zhǎng)壽命的發(fā)射譜帶,但這個(gè)發(fā)射譜帶波長(zhǎng)比磷光譜帶波長(zhǎng)要短.往往把這種長(zhǎng)壽命發(fā)射的譜帶稱為遲滯熒光.遲滯熒光分為E-型遲滯熒光,P-型遲滯熒光和復(fù)合熒光三種類型.①E-型遲滯熒光:處于T1電子態(tài)的分子,經(jīng)熱活化提高能量后而處于S1電子能態(tài),然后自S1電子態(tài)輻射躍遷產(chǎn)生熒光.(2)遲滯熒光①E-型遲滯熒光:②P-型遲滯熒光:

這類熒光,其S1電子激發(fā)分子的布居,是由兩個(gè)處于T1電子態(tài)的分子相互作用時(shí)所引起的,此過程稱為“三重態(tài)-三重態(tài)粒子湮沒”,結(jié)果產(chǎn)生一個(gè)激發(fā)單重態(tài)分子.③復(fù)合熒光其第一電子激發(fā)單重態(tài)分子的布居，是由自由基離子和電子復(fù)合或具有相反電荷的兩個(gè)自由基離子復(fù)合引起的。②P-型遲滯熒光:③復(fù)合熒光比較熒光和激發(fā)光的波長(zhǎng)考慮：①斯托克斯（stokes)熒光②反斯托克斯熒光（antistokes)③共振熒光①斯托克斯（stokes)熒光在溶液中觀察到的熒光,其發(fā)射的熒光比激發(fā)光的波長(zhǎng)要長(zhǎng)。激發(fā)光熒光分子碰撞引起的能量損失S0S1比較熒光和激發(fā)光的波長(zhǎng)考慮：①斯托克斯（stokes)熒光激②反斯托克斯熒光（antistokes)如果在吸收光子的過程又附加熱能給予激發(fā)態(tài)分子,則發(fā)射的熒光波長(zhǎng)比激發(fā)光的波長(zhǎng)短.這種熒光可在高溫的稀薄氣體中觀察到.激發(fā)光熒光吸收熱能S0S1②反斯托克斯熒光（antistokes)激發(fā)光熒光吸收熱能S③共振熒光與激發(fā)光具有相同波長(zhǎng)的熒光,這類熒光在氣體和結(jié)晶才有可能發(fā)生.激發(fā)光熒光S0S1③共振熒光激發(fā)光熒光S0S1熒光的檢測(cè)單色器光源檢測(cè)器狹縫單色器吸收池狹縫I0It三、熒光測(cè)量熒光的檢測(cè)單色器光源檢測(cè)器狹縫單色器吸收池狹縫I0It三、熒

光譜特征任何熒（磷）光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。它們是熒（磷）光定性分析的基礎(chǔ)。1）激發(fā)光譜改變激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)量在最強(qiáng)熒（磷）光發(fā)射波長(zhǎng)處的強(qiáng)度變化，以激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)熒光強(qiáng)度作圖可得到激發(fā)光譜。激發(fā)光譜形狀與吸收光譜形狀完全相似，經(jīng)校正后二者完全相同！這是因?yàn)榉肿游展饽艿倪^程就是分子的激發(fā)過程。

激發(fā)光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)；在定量時(shí)，用于選擇最適宜的激發(fā)波長(zhǎng)。光譜特征2）發(fā)射光譜發(fā)射光譜即熒光光譜。一定波長(zhǎng)和強(qiáng)度的激發(fā)波長(zhǎng)輻照熒光物質(zhì)，產(chǎn)生不同波長(zhǎng)的強(qiáng)度的熒光，以熒光強(qiáng)度對(duì)其波長(zhǎng)作圖可得熒光發(fā)射光譜。由于不同物質(zhì)具不同的特征發(fā)射峰，因而使用熒光發(fā)射光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)。2）發(fā)射光譜1）波長(zhǎng)比較與激發(fā)（或吸收）波長(zhǎng)相比，熒光發(fā)射波長(zhǎng)更長(zhǎng)，即產(chǎn)生所謂Stokes位移。（振動(dòng)弛豫失活所致）2）形狀比較熒光光譜形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān)。盡管分子受激后可到達(dá)不同能層的激發(fā)態(tài)，但由于去活化（內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫）到第一電子激發(fā)態(tài)的速率或幾率很大，好像是分子受激只到達(dá)第一激發(fā)態(tài)一樣。換句話說，不管激發(fā)波長(zhǎng)如何，電子都是從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能層躍遷到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能層。激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系1）波長(zhǎng)比較激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系3）鏡像對(duì)稱

通常熒光光譜與吸收光譜呈鏡像對(duì)稱關(guān)系溫州大學(xué)化材學(xué)院微納結(jié)構(gòu)材料&物理化學(xué)研究所S04321S143213）鏡像對(duì)稱溫州大學(xué)化材學(xué)院微納結(jié)構(gòu)材料&物理化學(xué)研究所熒光壽命和熒光量子產(chǎn)率熒光壽命和熒光量子產(chǎn)率熒光與熒光分析課件F1和F2分別表示待測(cè)物質(zhì)和參比物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率；F1和F2分別表示待測(cè)物質(zhì)和參比物質(zhì)的積分熒光強(qiáng)度；A1和A2分別表示待測(cè)物質(zhì)和參比物質(zhì)在激發(fā)波長(zhǎng)下的吸光度。(硫酸喹啉在0.05mol/L硫酸中的熒光量子產(chǎn)率為0.55,是測(cè)量熒光量子產(chǎn)率時(shí)經(jīng)常使用的一種參照物.)熒光量子產(chǎn)率的測(cè)量方法熒光量子產(chǎn)率的測(cè)量方法分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系

產(chǎn)生并可觀察到熒光的條件：

i）分子具有與輻射頻率相應(yīng)的熒光結(jié)構(gòu)（內(nèi)因）；

ii）吸收特征頻率的光后，應(yīng)可產(chǎn)生具一定量子效率的熒光。即量子效率F足夠大：=kf/(kf+∑K)分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系產(chǎn)生并可觀察到熒光的條件：=kf/(k分子結(jié)構(gòu)與熒光1）躍遷類型：通常，具有—*及n—*躍遷結(jié)構(gòu)的分子才會(huì)產(chǎn)生熒光。而且具—*躍遷的熒光效率比n—*躍遷的要大得多。2）共軛效應(yīng)：共軛度越大，熒光越強(qiáng)。分子結(jié)構(gòu)與熒光1）躍遷類型：共軛結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移。共軛結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移。3）剛性結(jié)構(gòu)和共平面性：分子剛性（Rigidity）越強(qiáng)，分子振動(dòng)少，與其它分子碰撞失活的機(jī)率下降，熒光量子效率提高。如熒光素（大）與酚酞（=0）；3）剛性結(jié)構(gòu)和共平面性：剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系8—羥基喹啉8—羥基喹啉鎂形成絡(luò)合物后,形成剛性平面空間位阻與熒光的關(guān)系反式結(jié)構(gòu)，發(fā)光順式結(jié)構(gòu)，不發(fā)光1，2—二苯乙烯剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系8—羥基喹啉8—羥基喹4）取代基：

給電子取代基增強(qiáng)熒光（p-共軛），如-OH、-OR、-NH2、-NR2等；吸電子基降低熒光，如-COOH、-C=O、-NO2、-NO、-X等；重原子降低熒光但增強(qiáng)磷光如苯環(huán)被鹵素取代，從氟苯到碘苯，熒光逐漸減弱到消失，該現(xiàn)象也稱重原子效應(yīng)。4）取代基：取代基的影響

給電子取代基增強(qiáng)熒光—NH2,—NHR,—NR2,—OH,—OR,等EM285-365nm270-310nm310-405nm相對(duì)熒光強(qiáng)度1.81.02.0取代基的影響給電子取代基增強(qiáng)熒光—NH2,—NHR,

吸電子取代基n電子不與電子共軛羰基類1）n*躍遷禁阻，小，10-22）最低單重態(tài)為n,*型，易于ISC。熒光弱，磷光強(qiáng)非熒光強(qiáng)熒光吸電子取代基n電子不與電子共軛羰基類1）n*取代基的位置1）有利于電子離域的，則熒光增強(qiáng)。因此，一般鄰位、對(duì)位給電子基團(tuán)導(dǎo)致熒光增強(qiáng)。2）有利于形成環(huán)，導(dǎo)致分子剛性增大，熒光增強(qiáng)。熒光強(qiáng)度較弱熒光強(qiáng)度較強(qiáng)取代基的位置1）有利于電子離域的，則熒光增強(qiáng)。因此，一般鄰位熒光定量分析光吸收定律（Lambert–BeerLaw）相應(yīng)的吸光分?jǐn)?shù)為：熒光強(qiáng)度（IF）與相應(yīng)的吸光分?jǐn)?shù)成正比：按照級(jí)數(shù)展開式：熒光定量分析光吸收定律（Lambert–BeerLa對(duì)于稀溶液，當(dāng)Lc<0.05（磷光Lc<0.01）時(shí)：IF----熒光強(qiáng)度F-----熒光量子產(chǎn)率k--與儀器靈敏度有關(guān)的參數(shù)I0--入射光強(qiáng)度IP----磷光強(qiáng)度P-----磷光量子產(chǎn)率b--吸收光程--摩爾吸光系數(shù)C--熒光物質(zhì)濃度對(duì)于稀溶液，當(dāng)Lc<0.05（磷光Lc<0.01）時(shí)1．標(biāo)準(zhǔn)曲線法配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測(cè)定熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在相同條件下測(cè)量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度。2.比較法在線性范圍內(nèi)，測(cè)定標(biāo)樣和試樣的熒光強(qiáng)度，比較。3.工作曲線法用F~C作圖4.比較法

Fs－F0＝KCsFx－F0＝KCx熒光定量分析方法1．標(biāo)準(zhǔn)曲線法熒光定量分析方法熒光分析的特點(diǎn)

靈敏度高：視不同物質(zhì)，檢測(cè)下限在0.1~0.001g/mL之間。可見比UV-Vis的靈敏度高得多！選擇性好：可同時(shí)用激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜定性。結(jié)構(gòu)信息量多：包括物質(zhì)激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、光強(qiáng)、熒光量子效率、熒光壽命等。應(yīng)用不廣泛：主要是因?yàn)槟馨l(fā)熒光的物質(zhì)不具普遍性、增強(qiáng)熒光的方法有限、外界環(huán)境對(duì)熒光量子效率影響大、干擾測(cè)量的因素較多熒光分析的特點(diǎn)多組分混合物的熒光分析①各組分熒光峰相互不干擾，按單組分測(cè)定方法，分別在各自的熒光峰處測(cè)定；②如果熒光峰互相干擾，激發(fā)光譜相差大，可選擇在不同的激發(fā)光進(jìn)行測(cè)定，其它組分在此激發(fā)波長(zhǎng)不會(huì)產(chǎn)生熒光；③如果在同一激發(fā)波長(zhǎng)下熒光光譜互相干擾，可以利用熒光強(qiáng)度的加和性，解聯(lián)立方程求出。多組分混合物的熒光分析①各組分熒光峰相互不干擾，按單組分測(cè)影響熒光的外界因素（一）溶劑效應(yīng)：

溶劑極性可增加或降低熒光強(qiáng)度（改變—*及

n—*

躍遷的能量）；與溶劑作用從而改變熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)來增加或降低熒光強(qiáng)度。（二）溫度：溫度增加，熒光強(qiáng)度下降（因?yàn)閮?nèi)、外轉(zhuǎn)換增加、粘度或“剛性”降低）。因此體系降低溫度可增加熒光分析靈敏度。影響熒光的外界因素（一）溶劑效應(yīng)：（二）溫度：（三）pH值：具酸或堿性基團(tuán)的有機(jī)物質(zhì)，在不同pH值時(shí)，其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，因而熒光強(qiáng)度將發(fā)生改變；對(duì)無機(jī)熒光物質(zhì)，因pH值會(huì)影響其穩(wěn)定性，因而也可使其熒光強(qiáng)度發(fā)生改變。pH<2pH>13pH7~12（三）pH值：pH<2pH>13pH7~12（四）內(nèi)濾光和自吸：體系內(nèi)存在可以吸收熒光的物質(zhì)，或熒光物質(zhì)的熒光短波長(zhǎng)與激發(fā)光長(zhǎng)波長(zhǎng)有重疊，均可使熒光強(qiáng)度下降，稱為內(nèi)濾光；當(dāng)熒光物質(zhì)濃度較大時(shí)，可吸收自身的熒光發(fā)射稱為熒光自吸。（四）內(nèi)濾光和自吸：熒光猝滅（1）碰撞熄滅熒光猝（熄）滅：熒光分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低或消失的現(xiàn)象。熒光猝（熄）滅劑：能引起熒光猝滅的物質(zhì)稱為熒光熄滅劑。相對(duì)速率

1K1[M*]K2[M*][Q]

與分子的直徑、粘度、溫度等因素有關(guān)。激發(fā)發(fā)射熄滅熒光猝滅（1）碰撞熄滅熒光猝（熄）滅：熒光分子與溶劑分子或其（2）能量轉(zhuǎn)移熄滅再吸收過程：共振能量轉(zhuǎn)移：分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移：hv（3）氧的熄滅作用氧分子是熒光、磷光的熄滅劑沒有除氧，溶液中難以觀察到磷光（2）能量轉(zhuǎn)移熄滅再吸收過程：共振能量轉(zhuǎn)移：分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移（4）自熄滅與自吸收當(dāng)熒光物質(zhì)的濃度大于1g/L時(shí)，常發(fā)生熒光的自熄滅(濃度熄滅)自吸收：由于F<1，使熒光強(qiáng)度減弱或消失.形成二聚體：由于二聚體不發(fā)熒光，或發(fā)射熒光的能量有改變，造成自熄滅現(xiàn)象。（4）自熄滅與自吸收當(dāng)熒光物質(zhì)的濃度大于1g/L時(shí)，常發(fā)生單色器單色器光源。檢測(cè)器液槽放大和指示儀表熒光分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)示意圖I0I儀器結(jié)構(gòu)示意圖四、儀器與技術(shù)單色器單色器光源。檢測(cè)器液槽放大和指示儀表熒光分光光度

熒光計(jì)的主要部件1）光源：氙燈、高壓汞燈、激光；2）樣品池：石英（低熒光材料）；3）兩個(gè)單色器：選擇激發(fā)光單色器；分離熒光單色器；4）檢測(cè)器：光電倍增管。熒光計(jì)的主要部件基本裝置及主要構(gòu)件1、激發(fā)光源

（1）條件:①足夠的強(qiáng)度；②紫外，可見區(qū)域有連續(xù)的光譜；③強(qiáng)度與波長(zhǎng)無關(guān)；④光強(qiáng)穩(wěn)定（2）激發(fā)光源:①氙燈（高壓）:250～1000nm光譜區(qū)呈連續(xù)光譜，使用壽命大約為2000h。②汞燈（高壓）:在紫外區(qū)激發(fā)，365nm，使用壽命1500～3000小時(shí)?；狙b置及主要構(gòu)件1、激發(fā)光源2、單色器①光柵單色器有較高的靈敏度，較寬的波長(zhǎng)范圍，能掃描光譜，主要缺點(diǎn)是雜散光較大，有不同級(jí)次的譜線干擾，可用前置濾光片加以消除。②濾光片濾光片便宜簡(jiǎn)便，在熒光計(jì)和熒光分光光度計(jì)中有廣泛的應(yīng)用。3、樣品池

石英方形池，四面都透光。4、狹縫

狹縫越小，單色性越好，但光強(qiáng)和靈敏度降低。

2、單色器①光柵單色器3、樣品池5、檢測(cè)器①光電倍增管：靈敏度高，線路簡(jiǎn)單。②光電攝像管：具有檢測(cè)效率高，動(dòng)態(tài)范圍寬，線性響應(yīng)好，堅(jiān)固耐用和壽命長(zhǎng)特點(diǎn)。6、讀出裝置

記錄儀、陰極示波器和顯示器。5、檢測(cè)器五、熒光分析法的應(yīng)用1無機(jī)化合物的分析與有機(jī)試劑配合物后測(cè)量；可測(cè)量約60多種元素。鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測(cè)定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測(cè)定；鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y(cè)定；鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測(cè)定2生物與有機(jī)化合物的分析見表五、熒光分析法的應(yīng)用1無機(jī)化合物的分析熒光與熒光分析課件熒光與熒光分析課件3食品檢測(cè)方面的應(yīng)用（1）食品中礦物質(zhì)及金屬元素的分析（2）食品中氨基酸、維生素等的分析（3）食品霉變物質(zhì)、菌類污染熒光分析（4）食品添加劑、防腐劑、食品包裝有害物質(zhì)分析（5）食品農(nóng)藥殘留、藥物殘留分析3食品檢測(cè)方面的應(yīng)用熒光物質(zhì)及其應(yīng)用實(shí)例熒光物質(zhì)及其應(yīng)用實(shí)例常見用于標(biāo)記抗體的熒光染料1.熒光素類包括異硫氰酸熒光素（FITC）、羥基熒光素（FAM）、四氯熒光素（TET）等及其類似物。是一類具有較多苯環(huán)的化合物。應(yīng)用最廣泛的FITC在488nm處激發(fā)，525nm處發(fā)射，能夠結(jié)合各種抗體蛋白，并在堿性溶液中穩(wěn)定呈現(xiàn)藍(lán)綠色熒光。2.羅丹明類包括紅色羅丹明（RBITC）、四甲基羅丹明（TAMRA）、羅丹明B（TRITC）等。TRITC在550nm處激發(fā)，570nm處發(fā)射黃色熒光。3.Cy系列花氰類通常有兩個(gè)雜環(huán)體系組成，包括Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7及其類似物。常見用于標(biāo)記抗體的熒光染料1.熒光素類4.Alexa系列是由MolecularProbes開發(fā)的系列熒光染料。其激發(fā)和發(fā)射光光譜覆蓋大部分可見光和部分紅外線光譜區(qū)域。以高亮度、穩(wěn)定性、儀器兼容性、多種顏色、pH值不敏感及水溶性為主要特點(diǎn)。5.蛋白類藻紅蛋白（PE）、藻藍(lán)蛋白（PC）、別藻藍(lán)蛋白（APC）、多甲藻黃素-葉綠素蛋白（preCP）等，他們大多在藍(lán)藻中發(fā)現(xiàn)。這些熒光染料可與Cy系列菁染料偶聯(lián)形成復(fù)合染料用于抗體標(biāo)記。如市面上常用的有PE-Cy3/Cy5/Cy7、APC-Cy7等熒光與熒光分析課件CyaninedyeCyaninedyeAlexaFluorDAPIFITCAlexaFluorDAPIFITC老鼠成纖維細(xì)胞綠色:肌動(dòng)蛋白,FITC紅色:微管蛋白,Cy5藍(lán)色:細(xì)胞核,DAPI老鼠成纖維細(xì)胞牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞

線粒體：紅色，MitoTracker?RedCMXRos過氧化物酶體:綠色，AlexaFluor?488goatanti–rabbitIgG細(xì)胞核：藍(lán)色，DAPI牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞上轉(zhuǎn)化納米材料Illustrationofconventionalandupconversionluminescence.上轉(zhuǎn)化納米材料IllustrationofconventPrincipalUCprocessofLn‐dopedUCNP,a)excitedstateabsorption(ESA),b)energytransferupconversion(ETU),c)cooperativesensitizationupconversion(CSU),d)crossrelaxation(CR),ande)photonavalanche(PA)Schematicillustrationofenergymigration‐mediatedupconversion(EMU)mechanism.PrincipalUCprocessofLn‐dop量子點(diǎn)Coloroflightdependsonsizeofquantumdot量子點(diǎn)Coloroflightdependsons活體熒光成像抗癌藥物的臨床前研究活體熒光成像抗癌藥物的臨床前研究活體熒光對(duì)納米材料用于腫瘤療效的監(jiān)測(cè)Nanoletters

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18,ArticleID

8b03568活體熒光對(duì)納米材料用于腫瘤療效的監(jiān)測(cè)Nanoletters熒光素眼底血管造影成像JournalofDiabetesResearch

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2014,ArticleID

745419A～F為熒光素眼底血管造影結(jié)果，熒光素眼底血管造影顯示與正常組(圖A)比較，糖尿病小鼠組(圖B)眼底布滿散在的微小血管瘤(病理性新生血管瘤)，糖寧通絡(luò)(圖D，3.6g/kg劑量組;E，1.8g/kg劑量組;F，0.9g/kg劑量組)干預(yù)12周能顯著減少微血管瘤的密度，二甲雙胍組(C圖)在這方面沒有明細(xì)改善。熒光素眼底血管造影成像JournalofDiabetesThankyou!Thankyou!“”熒光與熒光分析“”熒光與熒光分析概述基本原理熒光分析儀器與技術(shù)應(yīng)用與示例目錄概述目光學(xué)光譜區(qū)10nm~200nm200nm~380nm380nm~780nm780nm~2.5μm2.5μm~50μm50μm~300

μm一、概述光學(xué)光譜區(qū)10nm~200nm200nm380nm780n熒光的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展1575年，西班牙醫(yī)生N.Monardes首先發(fā)現(xiàn)熒光1852年，Stokes發(fā)現(xiàn)熒光波長(zhǎng)比照射光波長(zhǎng)要長(zhǎng)，認(rèn)定熒光是發(fā)射光。

1867年，首次用于分析測(cè)定。

1952年，商品熒光分光光度計(jì)出現(xiàn)。

2008年，日本村修、美國馬丁·沙爾菲、美籍華裔錢永健因從水母中發(fā)現(xiàn)并發(fā)展了綠色熒光蛋白質(zhì)技術(shù)而獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。熒光的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展1575年，西班牙醫(yī)生N.Monard

什么是熒光？

當(dāng)紫外或可見光照射到某些物質(zhì)上時(shí)，這些物質(zhì)就會(huì)發(fā)射出波長(zhǎng)和強(qiáng)度各不相同的光線，停止照射光照射時(shí)，這種光線馬上或逐漸消失，這就是熒光。二、基本原理什么是熒光？當(dāng)紫外或可見分子發(fā)光的類型分子發(fā)光的類型可以按兩種不同的辦法加以分類,其中一種以激發(fā)的模式加以分類,另一種是按分子激發(fā)態(tài)的類型來分類.

按分子激發(fā)態(tài)的類型：熒光:由第一電子激發(fā)單重態(tài)所產(chǎn)生的輻射躍遷而伴隨的發(fā)光現(xiàn)象.磷光:由最低的電子激發(fā)三重態(tài)所產(chǎn)生的輻射躍遷而伴隨的發(fā)光現(xiàn)象.

分子發(fā)光的類型分子發(fā)光的類型可以按兩種不同的辦法加以分類,其按激發(fā)模式分類:光致發(fā)光:分子因吸收外來輻射的光子能量被激發(fā)所產(chǎn)生的發(fā)光.化學(xué)發(fā)光:分子的激發(fā)能量是由反應(yīng)的化學(xué)能提供.生物發(fā)光:分子的激發(fā)能量是由生物體釋放出來的能量提供.熱致發(fā)光:由熱活化的離子復(fù)合激發(fā)模式所引起的發(fā)光現(xiàn)象.場(chǎng)致發(fā)光:由電荷注入激發(fā)模式所產(chǎn)生的發(fā)光.摩擦發(fā)光:由摩擦激發(fā)模式所產(chǎn)生的發(fā)光.按激發(fā)模式分類:熒光產(chǎn)生的基本原理內(nèi)轉(zhuǎn)換（InternalConversion，IC）:對(duì)于具有相同多重度的分子，若較高電子能級(jí)的低振動(dòng)能層與較低電子能級(jí)的高振動(dòng)能層相重疊時(shí)，則電子可在重疊的能層之間通過振動(dòng)耦合產(chǎn)生無輻射躍遷，如S2-S1；T2-T1。系間跨躍（IntersystemConversion，ISC）:系間跨躍是發(fā)生在兩個(gè)不同多重態(tài)之間的無輻射躍遷，如從S1到T1，該躍遷是禁阻的。然而，當(dāng)不同多重態(tài)的兩個(gè)電子能層有較大重疊時(shí)，處于這兩個(gè)能層上的受激電子的自旋方向發(fā)生變化，即可通過自旋-軌道耦合而產(chǎn)生無輻射躍遷，該過程稱為系間跨躍。熒光:分子電子從單重激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)在很短時(shí)間（10-9-10-6s）躍遷到基態(tài)各振動(dòng)能層時(shí)所產(chǎn)生的光子輻射稱為熒光。磷光:分子電子從三重態(tài)最低振動(dòng)能層，躍遷到基態(tài)的各振動(dòng)能層所產(chǎn)生的輻射。熒光產(chǎn)生的基本原理內(nèi)轉(zhuǎn)換（InternalConversi單重態(tài)和三重態(tài)

電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；

單重態(tài)：全部軌道里的電子都是自旋配對(duì)的，S=0,M=1；

三重態(tài)：分子具有自旋不配對(duì)的電子，S=1,M=3.平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低；

大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；

單重態(tài)和三重態(tài)電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1S為電子處于單線態(tài)和三線態(tài)下的分子的∏電子受激發(fā)激發(fā)單重(線)態(tài)：分子吸收能量，電子自旋仍然配對(duì)，為單重(線)態(tài)，稱為激發(fā)單重態(tài)，以S1，S2…表示激發(fā)三重(線)態(tài)：分子吸收能量，電子自旋不再配對(duì)為三重，稱為激發(fā)三重態(tài)，以T1，T2….表示?；鶓B(tài)：電子自旋配對(duì)多重度=2s+1=1，為單重(線)態(tài)，以S0表示。處于單線態(tài)和三線態(tài)下的分子的∏電子受激發(fā)激發(fā)單重(線)態(tài)：分電子躍遷

處于激發(fā)態(tài)的電子，通常以輻射躍遷方式或無輻射躍遷方式再回到基態(tài)。

輻射躍遷主要涉及到熒光、延遲熒光或磷光的輻射；無輻射躍遷則是指以熱的形式輻射其多余的能量，包括振動(dòng)弛豫（VR）、內(nèi)轉(zhuǎn)移（IR）、外轉(zhuǎn)移（EC）及系間竄越（ISC）等。

各種躍遷方式發(fā)生的可能性及程度，與熒光物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)及激發(fā)時(shí)的物理和化學(xué)環(huán)境等因素有關(guān)。電子躍遷處于激發(fā)態(tài)的電子，通常以輻射躍遷方式或無輻射躍基態(tài)單重態(tài)激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)區(qū)別：電子自旋方向不同，激發(fā)三重態(tài)的能級(jí)稍低一些。電子躍遷類型允許躍遷禁阻躍遷S0S1,S2,S3……T1,T2,T3……基態(tài)單重態(tài)激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)區(qū)別：電子自旋方向不同，激發(fā)三

在單重激發(fā)態(tài)中，兩個(gè)電子平行自旋，單重態(tài)分子具有抗磁性，其激發(fā)態(tài)的平均壽命大約為10-8s，而三重態(tài)分子具有順磁性，其激發(fā)態(tài)的平均壽命為10-4~1s以上（通常用S和T分別表示單重態(tài)和三重態(tài)）。

電子躍遷類型激發(fā)態(tài)與基態(tài)中的電子自旋方向相反，稱為激發(fā)單重態(tài)（S）抗磁性激發(fā)態(tài)與基態(tài)中的電子自旋方向相同，稱為激發(fā)三重態(tài)（T）順磁性區(qū)別：電子自旋方向不同，激發(fā)三重態(tài)的能級(jí)稍低一些。在單重激發(fā)態(tài)中，兩個(gè)電子平行自旋，單重態(tài)分子分子的去激發(fā)無輻射躍遷輻射躍遷熒光（F）磷光（P）振動(dòng)弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移體系間跨越分子的去激發(fā)分子的去激發(fā)無輻射躍遷輻射躍遷熒光（F）磷光（P）振動(dòng)弛豫內(nèi)輻射躍遷熒光：受光激發(fā)的分子從第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)所發(fā)出的輻射。壽命為10-8~10-11s。由于是相同多重態(tài)之間的躍遷，幾率較大，速度大，速率常數(shù)kf為106~109s-1。

磷光：從第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)所發(fā)出的輻射。由于磷光的產(chǎn)生伴隨自旋多重態(tài)的改變，輻射速度遠(yuǎn)小于熒光，磷光壽命為10-4~10s。在光照停止后，仍可持續(xù)一段時(shí)間。輻射躍遷熒光：受光激發(fā)的分子從第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)回?zé)o輻射躍遷振動(dòng)弛豫它是指在同一電子能級(jí)中，電子由高振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)至低振動(dòng)能級(jí)，而將多余的能量以熱的形式發(fā)出。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間為10-12s數(shù)量級(jí)。內(nèi)轉(zhuǎn)換當(dāng)兩個(gè)電子能級(jí)非?？拷灾疗湔駝?dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，常發(fā)生電子由高能級(jí)以無輻射躍遷方式轉(zhuǎn)移至低能級(jí)。無輻射躍遷振動(dòng)弛豫外轉(zhuǎn)移

指激發(fā)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用及能量轉(zhuǎn)移，使熒光或磷光強(qiáng)度減弱甚至消失。這一現(xiàn)象稱為“熄滅”或“猝滅”。熒光與磷光的根本區(qū)別：

熒光是由激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能層至基態(tài)各振動(dòng)能層間躍遷產(chǎn)生的；

磷光是由激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能層至基態(tài)各振動(dòng)能層間躍遷產(chǎn)生的。外轉(zhuǎn)移系間竄越指不同多重態(tài)間的無輻射躍遷，例如S1→T1就是一種體系間跨躍。通常，發(fā)生體系間跨躍時(shí)，電子由S1的較低振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)移至T1的較高振動(dòng)能級(jí)處。有時(shí)，通過熱激發(fā)，有可能發(fā)生T1→S1，然后由S1發(fā)生熒光。這是產(chǎn)生延遲熒光的機(jī)理。改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋—軌道耦合進(jìn)行。hvAhvFS1T1S0hvP系間竄越hvAhvFS1T1S0hvPS2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫S2S1S0T1吸發(fā)發(fā)系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能l2l1l熒光的類型發(fā)射機(jī)制考慮：瞬時(shí)熒光和遲滯熒光（1）瞬時(shí)熒光:通常在吸收激發(fā)光后大約10-8s內(nèi)發(fā)射的,是由激發(fā)過程中最初生成的S1電子態(tài)所產(chǎn)生的輻射.瞬時(shí)熒光可能由處于S1電子態(tài)的分子或S1激發(fā)態(tài)分子與基態(tài)分子所形成的激發(fā)態(tài)二聚體產(chǎn)生的。低濃度(10-6M)芘溶液,熒光是紫色的,熒光光譜有結(jié)構(gòu)特征高濃度(10-3M)芘溶液,熒光是藍(lán)色的,熒光光譜沒有結(jié)構(gòu)特征熒光的類型發(fā)射機(jī)制考慮：瞬時(shí)熒光和遲滯熒光低濃度(10-6M(2)遲滯熒光物質(zhì)分子在剛性或粘稠介質(zhì)中,除了磷光譜外,還可能觀察到另一種長(zhǎng)壽命的發(fā)射譜帶,但這個(gè)發(fā)射譜帶波長(zhǎng)比磷光譜帶波長(zhǎng)要短.往往把這種長(zhǎng)壽命發(fā)射的譜帶稱為遲滯熒光.遲滯熒光分為E-型遲滯熒光,P-型遲滯熒光和復(fù)合熒光三種類型.①E-型遲滯熒光:處于T1電子態(tài)的分子,經(jīng)熱活化提高能量后而處于S1電子能態(tài),然后自S1電子態(tài)輻射躍遷產(chǎn)生熒光.(2)遲滯熒光①E-型遲滯熒光:②P-型遲滯熒光:

這類熒光,其S1電子激發(fā)分子的布居,是由兩個(gè)處于T1電子態(tài)的分子相互作用時(shí)所引起的,此過程稱為“三重態(tài)-三重態(tài)粒子湮沒”,結(jié)果產(chǎn)生一個(gè)激發(fā)單重態(tài)分子.③復(fù)合熒光其第一電子激發(fā)單重態(tài)分子的布居，是由自由基離子和電子復(fù)合或具有相反電荷的兩個(gè)自由基離子復(fù)合引起的。②P-型遲滯熒光:③復(fù)合熒光比較熒光和激發(fā)光的波長(zhǎng)考慮：①斯托克斯（stokes)熒光②反斯托克斯熒光（antistokes)③共振熒光①斯托克斯（stokes)熒光在溶液中觀察到的熒光,其發(fā)射的熒光比激發(fā)光的波長(zhǎng)要長(zhǎng)。激發(fā)光熒光分子碰撞引起的能量損失S0S1比較熒光和激發(fā)光的波長(zhǎng)考慮：①斯托克斯（stokes)熒光激②反斯托克斯熒光（antistokes)如果在吸收光子的過程又附加熱能給予激發(fā)態(tài)分子,則發(fā)射的熒光波長(zhǎng)比激發(fā)光的波長(zhǎng)短.這種熒光可在高溫的稀薄氣體中觀察到.激發(fā)光熒光吸收熱能S0S1②反斯托克斯熒光（antistokes)激發(fā)光熒光吸收熱能S③共振熒光與激發(fā)光具有相同波長(zhǎng)的熒光,這類熒光在氣體和結(jié)晶才有可能發(fā)生.激發(fā)光熒光S0S1③共振熒光激發(fā)光熒光S0S1熒光的檢測(cè)單色器光源檢測(cè)器狹縫單色器吸收池狹縫I0It三、熒光測(cè)量熒光的檢測(cè)單色器光源檢測(cè)器狹縫單色器吸收池狹縫I0It三、熒

光譜特征任何熒（磷）光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。它們是熒（磷）光定性分析的基礎(chǔ)。1）激發(fā)光譜改變激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)量在最強(qiáng)熒（磷）光發(fā)射波長(zhǎng)處的強(qiáng)度變化，以激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)熒光強(qiáng)度作圖可得到激發(fā)光譜。激發(fā)光譜形狀與吸收光譜形狀完全相似，經(jīng)校正后二者完全相同！這是因?yàn)榉肿游展饽艿倪^程就是分子的激發(fā)過程。

激發(fā)光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)；在定量時(shí)，用于選擇最適宜的激發(fā)波長(zhǎng)。光譜特征2）發(fā)射光譜發(fā)射光譜即熒光光譜。一定波長(zhǎng)和強(qiáng)度的激發(fā)波長(zhǎng)輻照熒光物質(zhì)，產(chǎn)生不同波長(zhǎng)的強(qiáng)度的熒光，以熒光強(qiáng)度對(duì)其波長(zhǎng)作圖可得熒光發(fā)射光譜。由于不同物質(zhì)具不同的特征發(fā)射峰，因而使用熒光發(fā)射光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)。2）發(fā)射光譜1）波長(zhǎng)比較與激發(fā)（或吸收）波長(zhǎng)相比，熒光發(fā)射波長(zhǎng)更長(zhǎng)，即產(chǎn)生所謂Stokes位移。（振動(dòng)弛豫失活所致）2）形狀比較熒光光譜形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān)。盡管分子受激后可到達(dá)不同能層的激發(fā)態(tài)，但由于去活化（內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫）到第一電子激發(fā)態(tài)的速率或幾率很大，好像是分子受激只到達(dá)第一激發(fā)態(tài)一樣。換句話說，不管激發(fā)波長(zhǎng)如何，電子都是從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能層躍遷到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能層。激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系1）波長(zhǎng)比較激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系3）鏡像對(duì)稱

通常熒光光譜與吸收光譜呈鏡像對(duì)稱關(guān)系溫州大學(xué)化材學(xué)院微納結(jié)構(gòu)材料&物理化學(xué)研究所S04321S143213）鏡像對(duì)稱溫州大學(xué)化材學(xué)院微納結(jié)構(gòu)材料&物理化學(xué)研究所熒光壽命和熒光量子產(chǎn)率熒光壽命和熒光量子產(chǎn)率熒光與熒光分析課件F1和F2分別表示待測(cè)物質(zhì)和參比物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率；F1和F2分別表示待測(cè)物質(zhì)和參比物質(zhì)的積分熒光強(qiáng)度；A1和A2分別表示待測(cè)物質(zhì)和參比物質(zhì)在激發(fā)波長(zhǎng)下的吸光度。(硫酸喹啉在0.05mol/L硫酸中的熒光量子產(chǎn)率為0.55,是測(cè)量熒光量子產(chǎn)率時(shí)經(jīng)常使用的一種參照物.)熒光量子產(chǎn)率的測(cè)量方法熒光量子產(chǎn)率的測(cè)量方法分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系

產(chǎn)生并可觀察到熒光的條件：

i）分子具有與輻射頻率相應(yīng)的熒光結(jié)構(gòu)（內(nèi)因）；

ii）吸收特征頻率的光后，應(yīng)可產(chǎn)生具一定量子效率的熒光。即量子效率F足夠大：=kf/(kf+∑K)分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系產(chǎn)生并可觀察到熒光的條件：=kf/(k分子結(jié)構(gòu)與熒光1）躍遷類型：通常，具有—*及n—*躍遷結(jié)構(gòu)的分子才會(huì)產(chǎn)生熒光。而且具—*躍遷的熒光效率比n—*躍遷的要大得多。2）共軛效應(yīng)：共軛度越大，熒光越強(qiáng)。分子結(jié)構(gòu)與熒光1）躍遷類型：共軛結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移。共軛結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移。3）剛性結(jié)構(gòu)和共平面性：分子剛性（Rigidity）越強(qiáng)，分子振動(dòng)少，與其它分子碰撞失活的機(jī)率下降，熒光量子效率提高。如熒光素（大）與酚酞（=0）；3）剛性結(jié)構(gòu)和共平面性：剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系8—羥基喹啉8—羥基喹啉鎂形成絡(luò)合物后,形成剛性平面空間位阻與熒光的關(guān)系反式結(jié)構(gòu)，發(fā)光順式結(jié)構(gòu)，不發(fā)光1，2—二苯乙烯剛性結(jié)構(gòu)和共平面性與熒光的關(guān)系8—羥基喹啉8—羥基喹4）取代基：

給電子取代基增強(qiáng)熒光（p-共軛），如-OH、-OR、-NH2、-NR2等；吸電子基降低熒光，如-COOH、-C=O、-NO2、-NO、-X等；重原子降低熒光但增強(qiáng)磷光如苯環(huán)被鹵素取代，從氟苯到碘苯，熒光逐漸減弱到消失，該現(xiàn)象也稱重原子效應(yīng)。4）取代基：取代基的影響

給電子取代基增強(qiáng)熒光—NH2,—NHR,—NR2,—OH,—OR,等EM285-365nm270-310nm310-405nm相對(duì)熒光強(qiáng)度1.81.02.0取代基的影響給電子取代基增強(qiáng)熒光—NH2,—NHR,

吸電子取代基n電子不與電子共軛羰基類1）n*躍遷禁阻，小，10-22）最低單重態(tài)為n,*型，易于ISC。熒光弱，磷光強(qiáng)非熒光強(qiáng)熒光吸電子取代基n電子不與電子共軛羰基類1）n*取代基的位置1）有利于電子離域的，則熒光增強(qiáng)。因此，一般鄰位、對(duì)位給電子基團(tuán)導(dǎo)致熒光增強(qiáng)。2）有利于形成環(huán)，導(dǎo)致分子剛性增大，熒光增強(qiáng)。熒光強(qiáng)度較弱熒光強(qiáng)度較強(qiáng)取代基的位置1）有利于電子離域的，則熒光增強(qiáng)。因此，一般鄰位熒光定量分析光吸收定律（Lambert–BeerLaw）相應(yīng)的吸光分?jǐn)?shù)為：熒光強(qiáng)度（IF）與相應(yīng)的吸光分?jǐn)?shù)成正比：按照級(jí)數(shù)展開式：熒光定量分析光吸收定律（Lambert–BeerLa對(duì)于稀溶液，當(dāng)Lc<0.05（磷光Lc<0.01）時(shí)：IF----熒光強(qiáng)度F-----熒光量子產(chǎn)率k--與儀器靈敏度有關(guān)的參數(shù)I0--入射光強(qiáng)度IP----磷光強(qiáng)度P-----磷光量子產(chǎn)率b--吸收光程--摩爾吸光系數(shù)C--熒光物質(zhì)濃度對(duì)于稀溶液，當(dāng)Lc<0.05（磷光Lc<0.01）時(shí)1．標(biāo)準(zhǔn)曲線法配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測(cè)定熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在相同條件下測(cè)量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度。2.比較法在線性范圍內(nèi)，測(cè)定標(biāo)樣和試樣的熒光強(qiáng)度，比較。3.工作曲線法用F~C作圖4.比較法

Fs－F0＝KCsFx－F0＝KCx熒光定量分析方法1．標(biāo)準(zhǔn)曲線法熒光定量分析方法熒光分析的特點(diǎn)

靈敏度高：視不同物質(zhì)，檢測(cè)下限在0.1~0.001g/mL之間?？梢姳萓V-Vis的靈敏度高得多！選擇性好：可同時(shí)用激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜定性。結(jié)構(gòu)信息量多：包括物質(zhì)激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、光強(qiáng)、熒光量子效率、熒光壽命等。應(yīng)用不廣泛：主要是因?yàn)槟馨l(fā)熒光的物質(zhì)不具普遍性、增強(qiáng)熒光的方法有限、外界環(huán)境對(duì)熒光量子效率影響大、干擾測(cè)量的因素較多熒光分析的特點(diǎn)多組分混合物的熒光分析①各組分熒光峰相互不干擾，按單組分測(cè)定方法，分別在各自的熒光峰處測(cè)定；②如果熒光峰互相干擾，激發(fā)光譜相差大，可選擇在不同的激發(fā)光進(jìn)行測(cè)定，其它組分在此激發(fā)波長(zhǎng)不會(huì)產(chǎn)生熒光；③如果在同一激發(fā)波長(zhǎng)下熒光光譜互相干擾，可以利用熒光強(qiáng)度的加和性，解聯(lián)立方程求出。多組分混合物的熒光分析①各組分熒光峰相互不干擾，按單組分測(cè)影響熒光的外界因素（一）溶劑效應(yīng)：

溶劑極性可增加或降低熒光強(qiáng)度（改變—*及

n—*

躍遷的能量）；與溶劑作用從而改變熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)來增加或降低熒光強(qiáng)度。（二）溫度：溫度增加，熒光強(qiáng)度下降（因?yàn)閮?nèi)、外轉(zhuǎn)換增加、粘度或“剛性”降低）。因此體系降低溫度可增加熒光分析靈敏度。影響熒光的外界因素（一）溶劑效應(yīng)：（二）溫度：（三）pH值：具酸或堿性基團(tuán)的有機(jī)物質(zhì)，在不同pH值時(shí)，其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，因而熒光強(qiáng)度將發(fā)生改變；對(duì)無機(jī)熒光物質(zhì)，因pH值會(huì)影響其穩(wěn)定性，因而也可使其熒光強(qiáng)度發(fā)生改變。pH<2pH>13pH7~12（三）pH值：pH<2pH>13pH7~12（四）內(nèi)濾光和自吸：體系內(nèi)存在可以吸收熒光的物質(zhì)，或熒光物質(zhì)的熒光短波長(zhǎng)與激發(fā)光長(zhǎng)波長(zhǎng)有重疊，均可使熒光強(qiáng)度下降，稱為內(nèi)濾光；當(dāng)熒光物質(zhì)濃度較大時(shí)，可吸收自身的熒光發(fā)射稱為熒光自吸。（四）內(nèi)濾光和自吸：熒光猝滅（1）碰撞熄滅熒光猝（熄）滅：熒光分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低或消失的現(xiàn)象。熒光猝（熄）滅劑：能引起熒光猝滅的物質(zhì)稱為熒光熄滅劑。相對(duì)速率

1K1[M*]K2[M*][Q]

與分子的直徑、粘度、溫度等因素有關(guān)。激發(fā)發(fā)射熄滅熒光猝滅（1）碰撞熄滅熒光猝（熄）滅：熒光分子與溶劑分子或其（2）能量轉(zhuǎn)移熄滅再吸收過程：共振能量轉(zhuǎn)移：分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移：hv（3）氧的熄滅作用氧分子是熒光、磷光的熄滅劑沒有除氧，溶液中難以觀察到磷光（2）能量轉(zhuǎn)移熄滅再吸收過程：共振能量轉(zhuǎn)移：分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移（4）自熄滅與自吸收當(dāng)熒光物質(zhì)的濃度大于1g/L時(shí)，常發(fā)生熒光的自熄滅(濃度熄滅)自吸收：由于F<1，使熒光強(qiáng)度減弱或消失.形成二聚體：由于二聚體不發(fā)熒光，或發(fā)射熒光的能量有改變，造成自熄滅現(xiàn)象。（4）自熄滅與自吸收當(dāng)熒光物質(zhì)的濃度大于1g/L時(shí)，常發(fā)生單色器單色器光源。檢測(cè)器液槽放大和指示儀表熒光分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)示意圖I0I儀器結(jié)構(gòu)示意圖四、儀器與技術(shù)單色器單色器光源。檢測(cè)器液槽放大和指示儀表熒光分光光度

熒光計(jì)的主要部件1）光源：氙燈、高壓汞燈、激光；2）樣品池：石英（低熒光材料）；3）兩個(gè)單色器：選擇激發(fā)光單色器；分離熒光單色器；4）檢測(cè)器：光電倍增管。熒光計(jì)的主要部件基本裝置及主要構(gòu)件1、激發(fā)光源

（1）條件:①足夠的強(qiáng)度；②紫外，可見區(qū)域有連續(xù)的光譜；③強(qiáng)度與波長(zhǎng)無關(guān)；④光強(qiáng)穩(wěn)定（2）激發(fā)光源:①氙燈（高壓）:250～1000nm光譜區(qū)呈連續(xù)光譜，使用壽命大約為2000h。②汞燈（高壓）:在紫外區(qū)激發(fā)，365nm，使用壽命1500～3000小時(shí)?；狙b置及主要構(gòu)件1、激發(fā)光源2、單色器①光柵單色器有較高的靈敏度，較寬的波長(zhǎng)范圍，能掃描光譜，主要缺點(diǎn)是雜散光較大，有不同級(jí)次的譜線干擾，可用前置濾光片加以消除。②濾光片濾光片便宜簡(jiǎn)便，在熒光計(jì)和熒光分光光度計(jì)中有廣泛的應(yīng)用。3、樣品池

石英方形池，四面都透光。4、狹縫

狹縫越小，單色性越好，但光強(qiáng)和靈敏度降低。

2、單色器①