本課內(nèi)容蛋白質(zhì)的產(chǎn)率問(wèn)題蛋白質(zhì)工程概要蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用實(shí)例本課內(nèi)容蛋白質(zhì)的產(chǎn)率問(wèn)題1蛋白質(zhì)的產(chǎn)率問(wèn)題在基因工程菌株中，影響外源蛋白質(zhì)產(chǎn)率的因素包括載體相關(guān)因素和宿主相關(guān)的因素。與載體有關(guān)的因素主要有：表達(dá)載體拷貝數(shù)的調(diào)控啟動(dòng)子的強(qiáng)弱與轉(zhuǎn)錄調(diào)控轉(zhuǎn)錄終止子的效應(yīng)密碼子的使用頻率信號(hào)肽的特征與分泌調(diào)控影響產(chǎn)率的宿主因素主要有二：①mRNA的穩(wěn)定性；②宿主的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)。蛋白質(zhì)的產(chǎn)率問(wèn)題在基因工程菌株中，影響外源蛋白質(zhì)產(chǎn)率的因素包2載體拷貝數(shù)通過(guò)調(diào)控基因拷貝數(shù)來(lái)提高外源基因表達(dá)產(chǎn)量被稱(chēng)作‘基因的劑量效應(yīng)’，是一個(gè)對(duì)生產(chǎn)過(guò)程產(chǎn)生較大影響的因素。在多數(shù)情況下可以理解為質(zhì)?？截悢?shù)的多少，與ori有關(guān)。在克隆實(shí)驗(yàn)中常使用拷貝數(shù)~100的多拷貝質(zhì)粒。在以E.coli為宿主的生產(chǎn)中，常使用可以根據(jù)培養(yǎng)溫度調(diào)整拷貝數(shù)的runaway質(zhì)粒（如pCP3），42℃時(shí)拷貝數(shù)最高可達(dá)幾千個(gè)。lacZ’ampr復(fù)制起點(diǎn)ori載體拷貝數(shù)通過(guò)調(diào)控基因拷貝數(shù)來(lái)提高外源基因表達(dá)產(chǎn)量被稱(chēng)作‘基3啟動(dòng)子的強(qiáng)度啟動(dòng)子的強(qiáng)度是指一個(gè)啟動(dòng)子能夠多大程度地結(jié)合RNA聚合酶并引發(fā)轉(zhuǎn)錄過(guò)程。原核基因的啟動(dòng)子主要包括-35和-10區(qū)，真核基因啟動(dòng)子則主要是TATA盒與一些上游轉(zhuǎn)錄活化序列UAS。這些序列被稱(chēng)作順式作用元件（cis序列）。一般認(rèn)為啟動(dòng)子的強(qiáng)度與cis序列的最佳配置相關(guān)，在人工構(gòu)建強(qiáng)啟動(dòng)子時(shí)主要是嘗試把不同基因的啟動(dòng)子的cis序列進(jìn)行重組。-35-10RNA聚合酶原核基因啟動(dòng)子UASTATARNA聚合酶真核基因啟動(dòng)子啟動(dòng)子的強(qiáng)度啟動(dòng)子的強(qiáng)度是指一個(gè)啟動(dòng)子能夠多大程度地結(jié)合RN4啟動(dòng)子根據(jù)表達(dá)的方式可以把啟動(dòng)子分為兩類(lèi)：構(gòu)成性表達(dá)啟動(dòng)子：持續(xù)表達(dá)誘導(dǎo)性表達(dá)啟動(dòng)子：只在誘導(dǎo)條件下表達(dá)。宿主啟動(dòng)子構(gòu)成性表達(dá)誘導(dǎo)表達(dá)大腸桿菌E.colilac,tac,arapBAD,λPL,T7枯草芽孢桿菌蛋白酶、淀粉酶基因的啟動(dòng)子釀酒酵母S.cerevisiaeADH1，TDH3GAL1，PHO5畢赤酵母P.pastorisGAPAOX啟動(dòng)子根據(jù)表達(dá)的方式可以把啟動(dòng)子分為兩類(lèi)：宿主啟動(dòng)子構(gòu)成性表5誘導(dǎo)性表達(dá)強(qiáng)力啟動(dòng)子的優(yōu)點(diǎn)是表達(dá)的蛋白質(zhì)多，但是隨著mRNA和蛋白質(zhì)的大量合成與積累，反而會(huì)阻礙細(xì)胞的生長(zhǎng)，或激活宿主的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)。這都會(huì)造成目的蛋白產(chǎn)量的下降。如果目的蛋白對(duì)宿主細(xì)胞有毒性的話(huà)就更是如此。因此在實(shí)際生產(chǎn)中，更多使用的是那些僅在需要時(shí)才進(jìn)行強(qiáng)力表達(dá)的誘導(dǎo)性啟動(dòng)子。E.coli的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)幾乎全部是利用E.coli來(lái)源的各種操縱子中的啟動(dòng)子，如lac啟動(dòng)子。誘導(dǎo)性表達(dá)強(qiáng)力啟動(dòng)子的優(yōu)點(diǎn)是表達(dá)的蛋白質(zhì)多，但是隨著mRNA6E.coli的乳糖操縱子lacoperon乳糖操縱子包含啟動(dòng)子Plac、操縱基因O和3個(gè)結(jié)構(gòu)基因lacZ：β-半乳糖苷酶lacY：β-半乳糖苷透性酶lacA：β-半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶操縱子上游的lacI編碼阻遏蛋白。lacYlacAOlacIlacZPlac乳糖操縱子調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)子操縱基因PE.coli的乳糖操縱子lacoperon乳糖操縱子包7異乳糖與阻遏蛋白結(jié)合，導(dǎo)致其構(gòu)象變化，和DNA的親和性降低，不能與操縱基因O結(jié)合，對(duì)Plac的阻遏被解除，lacZ等基因的轉(zhuǎn)錄得以進(jìn)行。IPTG：異乳糖的類(lèi)似物，可作為lac啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物，其好處是不會(huì)被降解，使啟動(dòng)子一直被誘導(dǎo)。阻遏蛋白乳糖,Lactose轉(zhuǎn)錄lacYlacAOlacIlacZPlacPIPTG異乳糖異乳糖與阻遏蛋白結(jié)合，導(dǎo)致其構(gòu)象變化，和DNA的親和性降低，8轉(zhuǎn)錄終止子從生產(chǎn)角度來(lái)說(shuō)，不必要的長(zhǎng)序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的生產(chǎn)會(huì)額外地耗費(fèi)能量。當(dāng)對(duì)特定基因進(jìn)行強(qiáng)力表達(dá)時(shí)，轉(zhuǎn)錄可能會(huì)波及該基因的下游區(qū)域，既會(huì)給宿主帶來(lái)額外負(fù)擔(dān)，也會(huì)使質(zhì)粒的穩(wěn)定性下降。因此為了提高生產(chǎn)性能，往往會(huì)在目的基因下游添加終止子序列。如E.coli中的rRNA基因rrnB的終止子、T7噬菌體的終止子等。目的基因SD啟動(dòng)子終止子轉(zhuǎn)錄終止子從生產(chǎn)角度來(lái)說(shuō)，不必要的長(zhǎng)序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的生產(chǎn)會(huì)額外9密碼子使用頻率不同物種對(duì)各種密碼子的使用頻率不同，原因之一是細(xì)胞中各種tRNA分子所占的比例不同。在工業(yè)水平的生產(chǎn)中，密碼子的選擇會(huì)明顯地影響蛋白質(zhì)的純度和產(chǎn)量?；蛑腥绻哳l率出現(xiàn)對(duì)應(yīng)于少量tRNA的密碼子，蛋白產(chǎn)量會(huì)明顯降低。因此一條重要的基因設(shè)計(jì)原則就是要選擇最適密碼子：對(duì)應(yīng)于最多tRNA分子的密碼子?！CA·GCGGCCGCU丙氨酸的同義密碼子tRNA密碼子使用頻率不同物種對(duì)各種密碼子的使用頻率不同，原因之一是10信號(hào)肽與分泌生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)在宿主菌中表達(dá)時(shí)可能會(huì)遇到細(xì)胞毒性問(wèn)題，另一些蛋白則可能因過(guò)剩表達(dá)而形成不溶性的包涵體。采用細(xì)胞外分泌的方法生產(chǎn)是避免上述情況發(fā)生的有效手段。分泌至細(xì)胞外的目的蛋白不僅可以正確折疊，而且表達(dá)量較高，并有利于分離與精制。乳酸克魯維酵母信號(hào)肽與分泌生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)在宿主菌中表達(dá)時(shí)可能會(huì)遇到細(xì)胞毒性11信號(hào)肽信號(hào)肽位于分泌蛋白質(zhì)的N-末端，由15~30aa組成，末端還存在一段可被信號(hào)肽酶切斷的序列。如：酵母蔗糖酶信號(hào)肽：信號(hào)肽的重要性就在于它是蛋白質(zhì)向細(xì)胞外分泌的充分必要條件，因此研究人員開(kāi)發(fā)了一系列利用信號(hào)肽進(jìn)行蛋白分泌表達(dá)的載體。細(xì)菌中B.subtilis是理想的蛋白質(zhì)分泌生產(chǎn)宿主，酵母S.cerevisiae、P.pastoris和曲霉屬的霉菌則是比較適合作分泌蛋白生產(chǎn)的真核生物宿主。MLLQAFLLAGFAAKISASN信號(hào)肽信號(hào)肽位于分泌蛋白質(zhì)的N-末端，由15~30aa組成，12宿主的蛋白降解系統(tǒng)影響蛋白質(zhì)表達(dá)量的一個(gè)重要的宿主因素是宿主本身的蛋白酶的作用，應(yīng)對(duì)的策略之一是尋找相應(yīng)蛋白酶缺陷的突變株。如E.coliBL21（DE3）是基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)中最常與pET系列質(zhì)粒配合使用的宿主菌，B株系天然缺失lon蛋白酶（K12有）。研究人員又向其引入了蛋白酶OmpT的缺失突變，有利于提高蛋白產(chǎn)量。另一種策略是將目的蛋白與其它已知蛋白（如GST，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶）通過(guò)基因融合的方法進(jìn)行融合表達(dá)，也能適度避免目的蛋白質(zhì)的降解。宿主的蛋白降解系統(tǒng)影響蛋白質(zhì)表達(dá)量的一個(gè)重要的宿主因素是宿主13融合蛋白表達(dá)蛋白質(zhì)的在結(jié)構(gòu)與功能上都具有模塊化的特點(diǎn)，其結(jié)構(gòu)域往往在結(jié)構(gòu)和功能上都有相當(dāng)?shù)莫?dú)立性。這就使通過(guò)DNA重組技術(shù)產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)成為可能。這種技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室中也常被用于目的蛋白的親和層析純化（例如：與GST、His標(biāo)簽、GFP等蛋白融合）。ORFORF基因融合基因A基因BORFORF轉(zhuǎn)錄mRNA翻譯融合蛋白融合蛋白表達(dá)蛋白質(zhì)的在結(jié)構(gòu)與功能上都具有模塊化的特點(diǎn)，其結(jié)構(gòu)14amproriGST目的蛋白SDpT7T7終止子placT7RNA聚合酶IPTG宿主E.coliBL21(DE3)染色體表達(dá)載體T7RNA聚合酶以融合蛋白形式進(jìn)行表達(dá)的額外的好處是可以對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行親和層析純化，能大大簡(jiǎn)化蛋白的純化過(guò)程。amproriGST目的蛋白SDpT7T7終止子placT715融合蛋白的親和層析法純化樹(shù)脂顆粒GST谷胱甘肽，GSH谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶GST目標(biāo)蛋白GSTGST結(jié)合GST洗脫蛋白酶GST融合蛋白的親和層析法純化樹(shù)脂顆粒GST谷胱甘肽，GSH谷胱甘16蛋白質(zhì)工程隨著科學(xué)家對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的認(rèn)識(shí)更加深刻，到1980年前后科學(xué)家們已經(jīng)可以根據(jù)不同的目的來(lái)設(shè)計(jì)和創(chuàng)造突變蛋白質(zhì)分子。這種能夠改變蛋白質(zhì)的功能，或者設(shè)計(jì)和創(chuàng)造具有某種功能的新蛋白的技術(shù)被稱(chēng)為‘蛋白質(zhì)工程’。蛋白質(zhì)工程的終極目標(biāo)：根據(jù)氨基酸序列正確預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能;使用天然或非天然氨基酸甚至化學(xué)合成的分子自由地創(chuàng)造具有期望結(jié)構(gòu)和功能蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程隨著科學(xué)家對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的認(rèn)識(shí)更加深17蛋白質(zhì)工程從實(shí)際應(yīng)用來(lái)看，酶、抗體、受體、運(yùn)輸?shù)鞍?、信?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等均可以成為蛋白質(zhì)工程的改造對(duì)象。在目前，從頭設(shè)計(jì)具有全新的結(jié)構(gòu)和生物功能的蛋白質(zhì)分子相當(dāng)困難，更多的工作是對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)的改造。蛋白質(zhì)改造的技術(shù)主要有：隨機(jī)突變法定點(diǎn)突變法DNAshuffling非天然氨基酸導(dǎo)入基因融合蛋白質(zhì)工程從實(shí)際應(yīng)用來(lái)看，酶、抗體、受體、運(yùn)輸?shù)鞍?、信?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)18蛋白質(zhì)改造技術(shù)隨機(jī)突變法是創(chuàng)造在基因水平上的多樣性的重要技術(shù)，包括：采用羥胺等化學(xué)試劑處理或UV照射細(xì)胞進(jìn)行人工誘變，然后選擇表現(xiàn)型；利用DNA修復(fù)酶缺陷株；利用DNA聚合酶反應(yīng)的底物特異性下降現(xiàn)象；全基因水平的人工合成將突變導(dǎo)入目的基因。易錯(cuò)PCR（Error-pronePCR）：PCR中使用的TaqDNA聚合酶本來(lái)就是一種錯(cuò)誤率較高的聚合酶，如果在體系中存在Mn2+或Mg2+濃度異常，以及A、G、C、T中有一種的濃度僅為通常的1/10，反應(yīng)就更容易出錯(cuò)。蛋白質(zhì)改造技術(shù)隨機(jī)突變法是創(chuàng)造在基因水平上的多樣性的重要技術(shù)19蛋白質(zhì)改造技術(shù)定點(diǎn)突變法：針對(duì)編碼某個(gè)蛋白質(zhì)的基因，在特定位點(diǎn)引入突變的方法。操作過(guò)程如下：人工合成帶有需引入的突變序列的寡核苷酸（突變引物，如：Val→Arg）制備目標(biāo)基因的單鏈DNA模板使突變引物與DNA模板退火使用DNA聚合酶、連接酶一起合成全長(zhǎng)基因，引入突變轉(zhuǎn)化至E.coli中，通過(guò)DNA測(cè)序確認(rèn)突變是否成功。蛋白質(zhì)改造技術(shù)定點(diǎn)突變法：針對(duì)編碼某個(gè)蛋白質(zhì)的基因，在特定位20定點(diǎn)突變法site-directedmutagenesis制作ssDNA質(zhì)粒人工合成突變引物DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈轉(zhuǎn)化E.coli，挑選克隆提取質(zhì)粒DNA，測(cè)序定點(diǎn)突變法site-directedmutagenesi21PCR定點(diǎn)突變法第一輪PCR混合兩個(gè)PCR產(chǎn)物，變性，退火聚合酶合成連接到克隆載體中，轉(zhuǎn)化E.coli，挑選克隆，提取質(zhì)粒，測(cè)序第一輪PCRPCR進(jìn)一步擴(kuò)增PCR定點(diǎn)突變法第一輪PCR混合兩個(gè)PCR產(chǎn)物，變性，退火聚22蛋白質(zhì)改造技術(shù)DNAshuffling：由Stemmer等人所建立，作為一種基因重排的方法，主要步驟：針對(duì)某個(gè)蛋白質(zhì)構(gòu)建數(shù)個(gè)經(jīng)過(guò)功能改良的突變基因用DNaseI將這些DNA隨機(jī)切斷，獲得長(zhǎng)度在20~50bp的片段將這些片段混合，進(jìn)行無(wú)引物PCR加入DNA連接酶，使DNA小片段重新連接，可能獲得有價(jià)值的新組合通過(guò)合適的表型篩選系統(tǒng)進(jìn)行選擇這種方法甚至能夠改變酶分子的底物特異性，還可以實(shí)現(xiàn)酶的穩(wěn)定性及催化活性的改良。蛋白質(zhì)改造技術(shù)DNAshuffling：由Stemmer等23DNaseI隨機(jī)切割混合這些片段，熱變性，退火（shuffle）嵌合體文庫(kù)DNA聚合酶，連接酶表型篩選一組相關(guān)的基因ReshuffleDNAshufflingDNaseI隨機(jī)切割混合這些片段，熱變性，退火（shuf24蛋白質(zhì)改造技術(shù)非天然氨基酸導(dǎo)入：將20種氨基酸之外的氨基酸（如硝基苯丙氨酸）導(dǎo)入蛋白質(zhì)分子中，可以賦予蛋白質(zhì)全新的功能。首先必須使一些遺傳密碼子對(duì)應(yīng)于非天然氨基酸，通常需要對(duì)常規(guī)的三聯(lián)體密碼子進(jìn)行擴(kuò)展，產(chǎn)生‘四聯(lián)體密碼子’，如CGGG。先將該序列導(dǎo)入目標(biāo)基因中想要導(dǎo)入該氨基酸的位置，同時(shí)用‘化學(xué)酰胺化’的方法得到該氨基酸的氨酰tRNA，使攜帶識(shí)別CGGG的反密碼子的tRNA與非天然氨基酸結(jié)合。蛋白質(zhì)改造技術(shù)非天然氨基酸導(dǎo)入：將20種氨基酸之外的氨基酸（25UCGAGC·AGC·ACCSermRNAtRNAAGC·CGGG·ACCmRNAGCCC硝基苯丙氨酸(化學(xué)酰胺化法）在體外無(wú)細(xì)胞翻譯體系中進(jìn)行蛋白質(zhì)合成UCGAGC·AGC·ACCSermRNAtRNAAG26蛋白質(zhì)改造技術(shù)將上述氨酰tRNA與目標(biāo)基因的mRNA分子共同添加到無(wú)細(xì)胞翻譯體系中，就可以獲得想要的蛋白質(zhì)。使用多種四聯(lián)體密碼子，可將2種以上的非天然氨基酸分別導(dǎo)入蛋白質(zhì)分子中特定的位點(diǎn)。這種技術(shù)存在的問(wèn)題主要有：因?yàn)槭褂脽o(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，所以蛋白產(chǎn)量低氨?；鵷RNA的制備過(guò)程復(fù)雜導(dǎo)入非天然氨基酸后的蛋白質(zhì)發(fā)生變性、失活等蛋白質(zhì)改造技術(shù)將上述氨酰tRNA與目標(biāo)基因的mRNA分子共同27洗滌劑用酶洗滌劑用酶是洗滌劑中不可或缺的成分，常添加的酶包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。其市場(chǎng)需求量在不斷增加。在各種酶制劑聯(lián)合使用以提高洗滌效果的同時(shí)，科研人員也致力于通過(guò)蛋白質(zhì)工程手段改善每種酶的功能。蛋白酶：蛋白酶是洗滌劑中最重要、使用量最大的酶制劑。洗滌劑用酶洗滌劑用酶是洗滌劑中不可或缺的成分，常添加的酶28洗滌劑用酶在長(zhǎng)期保存的過(guò)程中，洗滌劑中的漂白成分會(huì)引起酶的失活，可能是由于位于活性中心附近的Met被氧化所引起。如果把該Met替換為其他氨基酸，可以提高酶分子的抗氧化性能。例如：來(lái)源于芽孢桿菌的一種堿性蛋白酶，將其Met222替換為Ala后，經(jīng)100mMH2O2處理15min后殘余活力由野生型的30%提高到70%。（諾維信Novozymes的產(chǎn)品Esperase?。）洗滌劑用酶在長(zhǎng)期保存的過(guò)程中，洗滌劑中的漂白成分會(huì)引起酶的失29洗滌劑用酶低溫蛋白酶的開(kāi)發(fā)：對(duì)B.clausii來(lái)源的蛋白酶savinase的基因進(jìn)行定點(diǎn)或隨機(jī)突變，構(gòu)建在芽孢桿菌中的基因表達(dá)文庫(kù)。篩選：將菌體溶液移入96孔板，進(jìn)行低溫條件下的酶促反應(yīng)。獲得的突變型酶在15℃時(shí)的洗滌效果有顯著提高（Kannase?，Novozymes，1997）。淀粉酶：大量用于餐具的自動(dòng)化清洗。來(lái)源于B.licheniformis的α-淀粉酶性能優(yōu)良，但是不抗氧化劑。突變Met197Ala使其抗氧化性能顯著增強(qiáng)，在加漂白劑的洗滌劑中五星期后仍保持90%以上的活力。（Purastar?，GenencorInc）洗滌劑用酶低溫蛋白酶的開(kāi)發(fā)：對(duì)B.clausii來(lái)源的蛋30Novozyme諾維信公司諾維信是一家丹麥的生物技術(shù)公司，主要進(jìn)行酶制劑、微生物制劑和生物醫(yī)藥成分的研發(fā)與生產(chǎn)。2013年占據(jù)全球酶制劑市場(chǎng)的48%，是最大的工業(yè)用酶制劑的生產(chǎn)商。目前有700多種產(chǎn)品，遍及全球130個(gè)國(guó)家。諾維信1992年開(kāi)始進(jìn)入中國(guó)，目前投資總額超過(guò)5億美元。機(jī)構(gòu)包括4家工廠，2家分公司，1家創(chuàng)新與發(fā)展中心，員工總數(shù)超過(guò)1000名。Novozyme諾維信公司諾維信是一家丹麥的生物技術(shù)公司，主31工業(yè)生產(chǎn)用酶核酸類(lèi)化合物5’-IMP和5’-GMP是制作鮮味調(diào)味品的原料，工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)這些核苷酸的方法之一就是用酶法對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生的核苷進(jìn)行磷酸化。許多微生物可以利用無(wú)機(jī)磷酸對(duì)核苷進(jìn)行磷酸化，化學(xué)反應(yīng)如下：具有調(diào)味作用的只有5’-核苷酸，所以先篩選能以焦磷酸為磷酸供體，特異性地對(duì)核苷的5’OH進(jìn)行磷酸化的菌株，成功找到了數(shù)個(gè)屬于腸細(xì)菌科的菌株。核苷+PPi→5’-核苷酸+Pi工業(yè)生產(chǎn)用酶核酸類(lèi)化合物5’-IMP和5’-GMP是制作鮮味32工業(yè)生產(chǎn)用酶然后選擇5’-核苷酸產(chǎn)量最高的菌株Morganellamorgnii，克隆了其核苷磷酸化酶基因，并進(jìn)行了酶學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)其有兩種活性：核苷磷酸化酶活性：磷酸酶活性：要想使其適于核苷酸的工業(yè)生產(chǎn)，必須提高其磷酸化酶活性，同時(shí)抑制其磷酸酶活性。改造步驟：PCR法引入隨機(jī)突變，從表達(dá)突變酶的重組菌中篩選5’-核苷酸合成能力高的菌株次黃苷+PPi→5’-IMP+Pi5’-IMP+H2O→次黃苷+Pi工業(yè)生產(chǎn)用酶然后選擇5’-核苷酸產(chǎn)量最高的菌株Morgane33工業(yè)生產(chǎn)用酶在兩輪隨機(jī)突變后科研人員獲得了生產(chǎn)性能有大幅提高的菌株，其中的酶發(fā)生了Gly92Asp和Ile171Thr的突變；突變型酶與野生型相比，與次黃嘌呤核苷的親和性明顯加強(qiáng)，5’-IMP的生產(chǎn)性能大幅提高，而且IMP的水解也受到抑制。生成的核苷酸只有5’-核苷酸，沒(méi)有2’-、3’-核苷酸副產(chǎn)物。此外，該酶的底物特異性廣泛，適用于各種5’-核苷酸的生產(chǎn)。工業(yè)生產(chǎn)用酶在兩輪隨機(jī)突變后科研人員獲得了生產(chǎn)性能有大幅提高34工業(yè)生產(chǎn)用酶進(jìn)一步，研究人員對(duì)Escherichiablattae來(lái)源的這種酶進(jìn)行了結(jié)晶和結(jié)構(gòu)解析。根據(jù)結(jié)構(gòu)信息，對(duì)一些位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)突變，如Ser90Phe的突變，使酶對(duì)次黃苷的Km下降60%，大幅提高了酶的反應(yīng)能力。經(jīng)過(guò)一系列的研究之后，最終確立了新型的酶法核酸鮮味調(diào)味品的工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)，并于2003年開(kāi)始投入生產(chǎn)（味之素株式會(huì)社）。1D2T工業(yè)生產(chǎn)用酶進(jìn)一步，研究人員對(duì)Escherichiabla35味之素日本味之素公司是擁有百年歷史的全球十大食品企業(yè)之一，是世界上最大的氨基酸供應(yīng)商之一。產(chǎn)品涉及食品、藥品等多個(gè)領(lǐng)域。味之素不但生產(chǎn)賴(lài)氨酸，而且蘇氨酸、色氨酸的生產(chǎn)量在世界上都是最大的。在氨基酸領(lǐng)域處于領(lǐng)導(dǎo)者地位的味之素集團(tuán)，運(yùn)用最先進(jìn)的獨(dú)創(chuàng)技術(shù)，廣泛地開(kāi)發(fā)了氨基酸的用途。味之素已在中國(guó)建立18家公司，業(yè)務(wù)涉及調(diào)味品、加工食品、醫(yī)藥/工業(yè)用/飼料氨基酸等。當(dāng)前味之素在中國(guó)的核心業(yè)務(wù)圍繞調(diào)味品及加工食品展開(kāi)。味之素日本味之素公司是擁有百年歷史的全球十大食品企業(yè)之一，是36臨床診斷用酶在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，醫(yī)生要作出準(zhǔn)確的診斷，往往需要檢測(cè)病人的各種代謝物在體液中的水平（血液、尿液）。酶是一種十分理想的診斷試劑，利用酶試劑構(gòu)建的檢測(cè)系統(tǒng)能充分發(fā)揮酶促反應(yīng)特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短的優(yōu)勢(shì)，簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確?，F(xiàn)在的診斷試劑從便捷角度出發(fā)多以液體試劑盒為主，這對(duì)酶的性能要求甚為嚴(yán)格。酶的高純度精制是必須的，并且在液體試劑中長(zhǎng)期保存的穩(wěn)定性也十分重要。臨床診斷用酶在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，醫(yī)生要作出準(zhǔn)確的診斷，往往需要檢測(cè)37臨床診斷用酶膽固醇氧化酶ChoA：鏈霉菌Streptomyces來(lái)源的ChoA的底物親和性?xún)?yōu)異（Km=13μM），非常適合于膽固醇的檢測(cè)。但是該酶的穩(wěn)定性不高，且在弱堿環(huán)境下活性較低?？茖W(xué)家通過(guò)對(duì)其立體結(jié)構(gòu)的模擬，有目的地構(gòu)建了其突變體文庫(kù)，并篩選熱穩(wěn)定性提高的突變體。最終選定了一種雙突變體：V145E，S103T，其熱穩(wěn)定性和在弱堿性環(huán)境中的活性都有明顯改善。其工業(yè)生產(chǎn)已經(jīng)獲得成功，被廣泛用于各種膽固醇診斷試劑。臨床診斷用酶膽固醇氧化酶ChoA：鏈霉菌Streptomyc38踏實(shí)，奮斗，堅(jiān)持，專(zhuān)業(yè)，努力成就未來(lái)。11月-2211月-22Saturday,November5,2022弄虛作假要不得，踏實(shí)肯干第一名。21:39:4121:39:4121:3911/5/20229:39:41PM安全象只弓，不拉它就松，要想保安全，常把弓弦繃。11月-2221:39:4121:39Nov-2205-Nov-22重于泰山，輕于鴻毛。21:39:4121:39:4121:39Saturday,November5,2022不可麻痹大意，要防微杜漸。11月-2211月-2221:39:4121:39:41November5,2022加強(qiáng)自身建設(shè)，增強(qiáng)個(gè)人的休養(yǎng)。2022年11月5日9:39下午11月-2211月-22追求卓越，讓自己更好，向上而生。05十一月20229:39:41下午21:39:4111月-22嚴(yán)格把控質(zhì)量關(guān)，讓生產(chǎn)更加有保障。十一月229:39下午11月-2221:39November5,2022重規(guī)矩，嚴(yán)要求，少危險(xiǎn)。2022/11/521:39:4121:39:4105November2022好的事情馬上就會(huì)到來(lái)，一切都是最好的安排。9:39:41下午9:39下午21:39:4111月-22每天都是美好的一天，新的一天開(kāi)啟。11月-2211月-2221:3921:39:4121:39:41Nov-22務(wù)實(shí)，奮斗，成就，成功。2022/11/521:39:41Saturday,November5,2022抓住每一次機(jī)會(huì)不能輕易流失，這樣我們才能真正強(qiáng)大。11月-222022/11/521:39:4111月-22謝謝大家！踏實(shí)，奮斗，堅(jiān)持，專(zhuān)業(yè)，努力成就未來(lái)。11月-2211月-239本課內(nèi)容蛋白質(zhì)的產(chǎn)率問(wèn)題蛋白質(zhì)工程概要蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用實(shí)例本課內(nèi)容蛋白質(zhì)的產(chǎn)率問(wèn)題40蛋白質(zhì)的產(chǎn)率問(wèn)題在基因工程菌株中，影響外源蛋白質(zhì)產(chǎn)率的因素包括載體相關(guān)因素和宿主相關(guān)的因素。與載體有關(guān)的因素主要有：表達(dá)載體拷貝數(shù)的調(diào)控啟動(dòng)子的強(qiáng)弱與轉(zhuǎn)錄調(diào)控轉(zhuǎn)錄終止子的效應(yīng)密碼子的使用頻率信號(hào)肽的特征與分泌調(diào)控影響產(chǎn)率的宿主因素主要有二：①mRNA的穩(wěn)定性；②宿主的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)。蛋白質(zhì)的產(chǎn)率問(wèn)題在基因工程菌株中，影響外源蛋白質(zhì)產(chǎn)率的因素包41載體拷貝數(shù)通過(guò)調(diào)控基因拷貝數(shù)來(lái)提高外源基因表達(dá)產(chǎn)量被稱(chēng)作‘基因的劑量效應(yīng)’，是一個(gè)對(duì)生產(chǎn)過(guò)程產(chǎn)生較大影響的因素。在多數(shù)情況下可以理解為質(zhì)?？截悢?shù)的多少，與ori有關(guān)。在克隆實(shí)驗(yàn)中常使用拷貝數(shù)~100的多拷貝質(zhì)粒。在以E.coli為宿主的生產(chǎn)中，常使用可以根據(jù)培養(yǎng)溫度調(diào)整拷貝數(shù)的runaway質(zhì)粒（如pCP3），42℃時(shí)拷貝數(shù)最高可達(dá)幾千個(gè)。lacZ’ampr復(fù)制起點(diǎn)ori載體拷貝數(shù)通過(guò)調(diào)控基因拷貝數(shù)來(lái)提高外源基因表達(dá)產(chǎn)量被稱(chēng)作‘基42啟動(dòng)子的強(qiáng)度啟動(dòng)子的強(qiáng)度是指一個(gè)啟動(dòng)子能夠多大程度地結(jié)合RNA聚合酶并引發(fā)轉(zhuǎn)錄過(guò)程。原核基因的啟動(dòng)子主要包括-35和-10區(qū)，真核基因啟動(dòng)子則主要是TATA盒與一些上游轉(zhuǎn)錄活化序列UAS。這些序列被稱(chēng)作順式作用元件（cis序列）。一般認(rèn)為啟動(dòng)子的強(qiáng)度與cis序列的最佳配置相關(guān)，在人工構(gòu)建強(qiáng)啟動(dòng)子時(shí)主要是嘗試把不同基因的啟動(dòng)子的cis序列進(jìn)行重組。-35-10RNA聚合酶原核基因啟動(dòng)子UASTATARNA聚合酶真核基因啟動(dòng)子啟動(dòng)子的強(qiáng)度啟動(dòng)子的強(qiáng)度是指一個(gè)啟動(dòng)子能夠多大程度地結(jié)合RN43啟動(dòng)子根據(jù)表達(dá)的方式可以把啟動(dòng)子分為兩類(lèi)：構(gòu)成性表達(dá)啟動(dòng)子：持續(xù)表達(dá)誘導(dǎo)性表達(dá)啟動(dòng)子：只在誘導(dǎo)條件下表達(dá)。宿主啟動(dòng)子構(gòu)成性表達(dá)誘導(dǎo)表達(dá)大腸桿菌E.colilac,tac,arapBAD,λPL,T7枯草芽孢桿菌蛋白酶、淀粉酶基因的啟動(dòng)子釀酒酵母S.cerevisiaeADH1，TDH3GAL1，PHO5畢赤酵母P.pastorisGAPAOX啟動(dòng)子根據(jù)表達(dá)的方式可以把啟動(dòng)子分為兩類(lèi)：宿主啟動(dòng)子構(gòu)成性表44誘導(dǎo)性表達(dá)強(qiáng)力啟動(dòng)子的優(yōu)點(diǎn)是表達(dá)的蛋白質(zhì)多，但是隨著mRNA和蛋白質(zhì)的大量合成與積累，反而會(huì)阻礙細(xì)胞的生長(zhǎng)，或激活宿主的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)。這都會(huì)造成目的蛋白產(chǎn)量的下降。如果目的蛋白對(duì)宿主細(xì)胞有毒性的話(huà)就更是如此。因此在實(shí)際生產(chǎn)中，更多使用的是那些僅在需要時(shí)才進(jìn)行強(qiáng)力表達(dá)的誘導(dǎo)性啟動(dòng)子。E.coli的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)幾乎全部是利用E.coli來(lái)源的各種操縱子中的啟動(dòng)子，如lac啟動(dòng)子。誘導(dǎo)性表達(dá)強(qiáng)力啟動(dòng)子的優(yōu)點(diǎn)是表達(dá)的蛋白質(zhì)多，但是隨著mRNA45E.coli的乳糖操縱子lacoperon乳糖操縱子包含啟動(dòng)子Plac、操縱基因O和3個(gè)結(jié)構(gòu)基因lacZ：β-半乳糖苷酶lacY：β-半乳糖苷透性酶lacA：β-半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶操縱子上游的lacI編碼阻遏蛋白。lacYlacAOlacIlacZPlac乳糖操縱子調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)子操縱基因PE.coli的乳糖操縱子lacoperon乳糖操縱子包46異乳糖與阻遏蛋白結(jié)合，導(dǎo)致其構(gòu)象變化，和DNA的親和性降低，不能與操縱基因O結(jié)合，對(duì)Plac的阻遏被解除，lacZ等基因的轉(zhuǎn)錄得以進(jìn)行。IPTG：異乳糖的類(lèi)似物，可作為lac啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物，其好處是不會(huì)被降解，使啟動(dòng)子一直被誘導(dǎo)。阻遏蛋白乳糖,Lactose轉(zhuǎn)錄lacYlacAOlacIlacZPlacPIPTG異乳糖異乳糖與阻遏蛋白結(jié)合，導(dǎo)致其構(gòu)象變化，和DNA的親和性降低，47轉(zhuǎn)錄終止子從生產(chǎn)角度來(lái)說(shuō)，不必要的長(zhǎng)序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的生產(chǎn)會(huì)額外地耗費(fèi)能量。當(dāng)對(duì)特定基因進(jìn)行強(qiáng)力表達(dá)時(shí)，轉(zhuǎn)錄可能會(huì)波及該基因的下游區(qū)域，既會(huì)給宿主帶來(lái)額外負(fù)擔(dān)，也會(huì)使質(zhì)粒的穩(wěn)定性下降。因此為了提高生產(chǎn)性能，往往會(huì)在目的基因下游添加終止子序列。如E.coli中的rRNA基因rrnB的終止子、T7噬菌體的終止子等。目的基因SD啟動(dòng)子終止子轉(zhuǎn)錄終止子從生產(chǎn)角度來(lái)說(shuō)，不必要的長(zhǎng)序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的生產(chǎn)會(huì)額外48密碼子使用頻率不同物種對(duì)各種密碼子的使用頻率不同，原因之一是細(xì)胞中各種tRNA分子所占的比例不同。在工業(yè)水平的生產(chǎn)中，密碼子的選擇會(huì)明顯地影響蛋白質(zhì)的純度和產(chǎn)量?；蛑腥绻哳l率出現(xiàn)對(duì)應(yīng)于少量tRNA的密碼子，蛋白產(chǎn)量會(huì)明顯降低。因此一條重要的基因設(shè)計(jì)原則就是要選擇最適密碼子：對(duì)應(yīng)于最多tRNA分子的密碼子?！CA·GCGGCCGCU丙氨酸的同義密碼子tRNA密碼子使用頻率不同物種對(duì)各種密碼子的使用頻率不同，原因之一是49信號(hào)肽與分泌生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)在宿主菌中表達(dá)時(shí)可能會(huì)遇到細(xì)胞毒性問(wèn)題，另一些蛋白則可能因過(guò)剩表達(dá)而形成不溶性的包涵體。采用細(xì)胞外分泌的方法生產(chǎn)是避免上述情況發(fā)生的有效手段。分泌至細(xì)胞外的目的蛋白不僅可以正確折疊，而且表達(dá)量較高，并有利于分離與精制。乳酸克魯維酵母信號(hào)肽與分泌生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)在宿主菌中表達(dá)時(shí)可能會(huì)遇到細(xì)胞毒性50信號(hào)肽信號(hào)肽位于分泌蛋白質(zhì)的N-末端，由15~30aa組成，末端還存在一段可被信號(hào)肽酶切斷的序列。如：酵母蔗糖酶信號(hào)肽：信號(hào)肽的重要性就在于它是蛋白質(zhì)向細(xì)胞外分泌的充分必要條件，因此研究人員開(kāi)發(fā)了一系列利用信號(hào)肽進(jìn)行蛋白分泌表達(dá)的載體。細(xì)菌中B.subtilis是理想的蛋白質(zhì)分泌生產(chǎn)宿主，酵母S.cerevisiae、P.pastoris和曲霉屬的霉菌則是比較適合作分泌蛋白生產(chǎn)的真核生物宿主。MLLQAFLLAGFAAKISASN信號(hào)肽信號(hào)肽位于分泌蛋白質(zhì)的N-末端，由15~30aa組成，51宿主的蛋白降解系統(tǒng)影響蛋白質(zhì)表達(dá)量的一個(gè)重要的宿主因素是宿主本身的蛋白酶的作用，應(yīng)對(duì)的策略之一是尋找相應(yīng)蛋白酶缺陷的突變株。如E.coliBL21（DE3）是基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)中最常與pET系列質(zhì)粒配合使用的宿主菌，B株系天然缺失lon蛋白酶（K12有）。研究人員又向其引入了蛋白酶OmpT的缺失突變，有利于提高蛋白產(chǎn)量。另一種策略是將目的蛋白與其它已知蛋白（如GST，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶）通過(guò)基因融合的方法進(jìn)行融合表達(dá)，也能適度避免目的蛋白質(zhì)的降解。宿主的蛋白降解系統(tǒng)影響蛋白質(zhì)表達(dá)量的一個(gè)重要的宿主因素是宿主52融合蛋白表達(dá)蛋白質(zhì)的在結(jié)構(gòu)與功能上都具有模塊化的特點(diǎn)，其結(jié)構(gòu)域往往在結(jié)構(gòu)和功能上都有相當(dāng)?shù)莫?dú)立性。這就使通過(guò)DNA重組技術(shù)產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)成為可能。這種技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室中也常被用于目的蛋白的親和層析純化（例如：與GST、His標(biāo)簽、GFP等蛋白融合）。ORFORF基因融合基因A基因BORFORF轉(zhuǎn)錄mRNA翻譯融合蛋白融合蛋白表達(dá)蛋白質(zhì)的在結(jié)構(gòu)與功能上都具有模塊化的特點(diǎn)，其結(jié)構(gòu)53amproriGST目的蛋白SDpT7T7終止子placT7RNA聚合酶IPTG宿主E.coliBL21(DE3)染色體表達(dá)載體T7RNA聚合酶以融合蛋白形式進(jìn)行表達(dá)的額外的好處是可以對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行親和層析純化，能大大簡(jiǎn)化蛋白的純化過(guò)程。amproriGST目的蛋白SDpT7T7終止子placT754融合蛋白的親和層析法純化樹(shù)脂顆粒GST谷胱甘肽，GSH谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶GST目標(biāo)蛋白GSTGST結(jié)合GST洗脫蛋白酶GST融合蛋白的親和層析法純化樹(shù)脂顆粒GST谷胱甘肽，GSH谷胱甘55蛋白質(zhì)工程隨著科學(xué)家對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的認(rèn)識(shí)更加深刻，到1980年前后科學(xué)家們已經(jīng)可以根據(jù)不同的目的來(lái)設(shè)計(jì)和創(chuàng)造突變蛋白質(zhì)分子。這種能夠改變蛋白質(zhì)的功能，或者設(shè)計(jì)和創(chuàng)造具有某種功能的新蛋白的技術(shù)被稱(chēng)為‘蛋白質(zhì)工程’。蛋白質(zhì)工程的終極目標(biāo)：根據(jù)氨基酸序列正確預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能;使用天然或非天然氨基酸甚至化學(xué)合成的分子自由地創(chuàng)造具有期望結(jié)構(gòu)和功能蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程隨著科學(xué)家對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的認(rèn)識(shí)更加深56蛋白質(zhì)工程從實(shí)際應(yīng)用來(lái)看，酶、抗體、受體、運(yùn)輸?shù)鞍?、信?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等均可以成為蛋白質(zhì)工程的改造對(duì)象。在目前，從頭設(shè)計(jì)具有全新的結(jié)構(gòu)和生物功能的蛋白質(zhì)分子相當(dāng)困難，更多的工作是對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)的改造。蛋白質(zhì)改造的技術(shù)主要有：隨機(jī)突變法定點(diǎn)突變法DNAshuffling非天然氨基酸導(dǎo)入基因融合蛋白質(zhì)工程從實(shí)際應(yīng)用來(lái)看，酶、抗體、受體、運(yùn)輸?shù)鞍?、信?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)57蛋白質(zhì)改造技術(shù)隨機(jī)突變法是創(chuàng)造在基因水平上的多樣性的重要技術(shù)，包括：采用羥胺等化學(xué)試劑處理或UV照射細(xì)胞進(jìn)行人工誘變，然后選擇表現(xiàn)型；利用DNA修復(fù)酶缺陷株；利用DNA聚合酶反應(yīng)的底物特異性下降現(xiàn)象；全基因水平的人工合成將突變導(dǎo)入目的基因。易錯(cuò)PCR（Error-pronePCR）：PCR中使用的TaqDNA聚合酶本來(lái)就是一種錯(cuò)誤率較高的聚合酶，如果在體系中存在Mn2+或Mg2+濃度異常，以及A、G、C、T中有一種的濃度僅為通常的1/10，反應(yīng)就更容易出錯(cuò)。蛋白質(zhì)改造技術(shù)隨機(jī)突變法是創(chuàng)造在基因水平上的多樣性的重要技術(shù)58蛋白質(zhì)改造技術(shù)定點(diǎn)突變法：針對(duì)編碼某個(gè)蛋白質(zhì)的基因，在特定位點(diǎn)引入突變的方法。操作過(guò)程如下：人工合成帶有需引入的突變序列的寡核苷酸（突變引物，如：Val→Arg）制備目標(biāo)基因的單鏈DNA模板使突變引物與DNA模板退火使用DNA聚合酶、連接酶一起合成全長(zhǎng)基因，引入突變轉(zhuǎn)化至E.coli中，通過(guò)DNA測(cè)序確認(rèn)突變是否成功。蛋白質(zhì)改造技術(shù)定點(diǎn)突變法：針對(duì)編碼某個(gè)蛋白質(zhì)的基因，在特定位59定點(diǎn)突變法site-directedmutagenesis制作ssDNA質(zhì)粒人工合成突變引物DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈轉(zhuǎn)化E.coli，挑選克隆提取質(zhì)粒DNA，測(cè)序定點(diǎn)突變法site-directedmutagenesi60PCR定點(diǎn)突變法第一輪PCR混合兩個(gè)PCR產(chǎn)物，變性，退火聚合酶合成連接到克隆載體中，轉(zhuǎn)化E.coli，挑選克隆，提取質(zhì)粒，測(cè)序第一輪PCRPCR進(jìn)一步擴(kuò)增PCR定點(diǎn)突變法第一輪PCR混合兩個(gè)PCR產(chǎn)物，變性，退火聚61蛋白質(zhì)改造技術(shù)DNAshuffling：由Stemmer等人所建立，作為一種基因重排的方法，主要步驟：針對(duì)某個(gè)蛋白質(zhì)構(gòu)建數(shù)個(gè)經(jīng)過(guò)功能改良的突變基因用DNaseI將這些DNA隨機(jī)切斷，獲得長(zhǎng)度在20~50bp的片段將這些片段混合，進(jìn)行無(wú)引物PCR加入DNA連接酶，使DNA小片段重新連接，可能獲得有價(jià)值的新組合通過(guò)合適的表型篩選系統(tǒng)進(jìn)行選擇這種方法甚至能夠改變酶分子的底物特異性，還可以實(shí)現(xiàn)酶的穩(wěn)定性及催化活性的改良。蛋白質(zhì)改造技術(shù)DNAshuffling：由Stemmer等62DNaseI隨機(jī)切割混合這些片段，熱變性，退火（shuffle）嵌合體文庫(kù)DNA聚合酶，連接酶表型篩選一組相關(guān)的基因ReshuffleDNAshufflingDNaseI隨機(jī)切割混合這些片段，熱變性，退火（shuf63蛋白質(zhì)改造技術(shù)非天然氨基酸導(dǎo)入：將20種氨基酸之外的氨基酸（如硝基苯丙氨酸）導(dǎo)入蛋白質(zhì)分子中，可以賦予蛋白質(zhì)全新的功能。首先必須使一些遺傳密碼子對(duì)應(yīng)于非天然氨基酸，通常需要對(duì)常規(guī)的三聯(lián)體密碼子進(jìn)行擴(kuò)展，產(chǎn)生‘四聯(lián)體密碼子’，如CGGG。先將該序列導(dǎo)入目標(biāo)基因中想要導(dǎo)入該氨基酸的位置，同時(shí)用‘化學(xué)酰胺化’的方法得到該氨基酸的氨酰tRNA，使攜帶識(shí)別CGGG的反密碼子的tRNA與非天然氨基酸結(jié)合。蛋白質(zhì)改造技術(shù)非天然氨基酸導(dǎo)入：將20種氨基酸之外的氨基酸（64UCGAGC·AGC·ACCSermRNAtRNAAGC·CGGG·ACCmRNAGCCC硝基苯丙氨酸(化學(xué)酰胺化法）在體外無(wú)細(xì)胞翻譯體系中進(jìn)行蛋白質(zhì)合成UCGAGC·AGC·ACCSermRNAtRNAAG65蛋白質(zhì)改造技術(shù)將上述氨酰tRNA與目標(biāo)基因的mRNA分子共同添加到無(wú)細(xì)胞翻譯體系中，就可以獲得想要的蛋白質(zhì)。使用多種四聯(lián)體密碼子，可將2種以上的非天然氨基酸分別導(dǎo)入蛋白質(zhì)分子中特定的位點(diǎn)。這種技術(shù)存在的問(wèn)題主要有：因?yàn)槭褂脽o(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，所以蛋白產(chǎn)量低氨?；鵷RNA的制備過(guò)程復(fù)雜導(dǎo)入非天然氨基酸后的蛋白質(zhì)發(fā)生變性、失活等蛋白質(zhì)改造技術(shù)將上述氨酰tRNA與目標(biāo)基因的mRNA分子共同66洗滌劑用酶洗滌劑用酶是洗滌劑中不可或缺的成分，常添加的酶包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。其市場(chǎng)需求量在不斷增加。在各種酶制劑聯(lián)合使用以提高洗滌效果的同時(shí)，科研人員也致力于通過(guò)蛋白質(zhì)工程手段改善每種酶的功能。蛋白酶：蛋白酶是洗滌劑中最重要、使用量最大的酶制劑。洗滌劑用酶洗滌劑用酶是洗滌劑中不可或缺的成分，常添加的酶67洗滌劑用酶在長(zhǎng)期保存的過(guò)程中，洗滌劑中的漂白成分會(huì)引起酶的失活，可能是由于位于活性中心附近的Met被氧化所引起。如果把該Met替換為其他氨基酸，可以提高酶分子的抗氧化性能。例如：來(lái)源于芽孢桿菌的一種堿性蛋白酶，將其Met222替換為Ala后，經(jīng)100mMH2O2處理15min后殘余活力由野生型的30%提高到70%。（諾維信Novozymes的產(chǎn)品Esperase?。）洗滌劑用酶在長(zhǎng)期保存的過(guò)程中，洗滌劑中的漂白成分會(huì)引起酶的失68洗滌劑用酶低溫蛋白酶的開(kāi)發(fā)：對(duì)B.clausii來(lái)源的蛋白酶savinase的基因進(jìn)行定點(diǎn)或隨機(jī)突變，構(gòu)建在芽孢桿菌中的基因表達(dá)文庫(kù)。篩選：將菌體溶液移入96孔板，進(jìn)行低溫條件下的酶促反應(yīng)。獲得的突變型酶在15℃時(shí)的洗滌效果有顯著提高（Kannase?，Novozymes，1997）。淀粉酶：大量用于餐具的自動(dòng)化清洗。來(lái)源于B.licheniformis的α-淀粉酶性能優(yōu)良，但是不抗氧化劑。突變Met197Ala使其抗氧化性能顯著增強(qiáng)，在加漂白劑的洗滌劑中五星期后仍保持90%以上的活力。（Purastar?，GenencorInc）洗滌劑用酶低溫蛋白酶的開(kāi)發(fā)：對(duì)B.clausii來(lái)源的蛋69Novozyme諾維信公司諾維信是一家丹麥的生物技術(shù)公司，主要進(jìn)行酶制劑、微生物制劑和生物醫(yī)藥成分的研發(fā)與生產(chǎn)。2013年占據(jù)全球酶制劑市場(chǎng)的48%，是最大的工業(yè)用酶制劑的生產(chǎn)商。目前有700多種產(chǎn)品，遍及全球130個(gè)國(guó)家。諾維信1992年開(kāi)始進(jìn)入中國(guó)，目前投資總額超過(guò)5億美元。機(jī)構(gòu)包括4家工廠，2家分公司，1家創(chuàng)新與發(fā)展中心，員工總數(shù)超過(guò)1000名。Novozyme諾維信公司諾維信是一家丹麥的生物技術(shù)公司，主70工業(yè)生產(chǎn)用酶核酸類(lèi)化合物5’-IMP和5’-GMP是制作鮮味調(diào)味品的原料，工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)這些核苷酸的方法之一就是用酶法對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生的核苷進(jìn)行磷酸化。許多微生物可以利用無(wú)機(jī)磷酸對(duì)核苷進(jìn)行磷酸化，化學(xué)反應(yīng)如下：具有調(diào)味作用的只有5’-核苷酸，所以先篩選能以焦磷酸為磷酸供體，特異性地對(duì)核苷的5’OH進(jìn)行磷酸化的菌株，成功找到了數(shù)個(gè)屬于腸細(xì)菌科的菌株。核苷+PPi→5’-核苷酸+Pi工業(yè)生產(chǎn)用酶核酸類(lèi)化合物5’-IMP和5’-GMP是制作鮮味71工業(yè)生產(chǎn)用酶然后選擇5’-核苷酸產(chǎn)量最高的菌株Morganellamorgnii，克隆了其核苷磷酸化酶基因，并進(jìn)行了酶學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)其有兩種活性：核苷磷酸化酶活性：磷酸酶活性：要想使其適于核苷酸的工業(yè)生產(chǎn)，必須提高其磷酸化酶活性，同時(shí)抑制其磷酸酶活性。改造步驟：PCR法引入隨機(jī)突變，從表達(dá)突變酶的重組菌中篩選5’-核苷酸合成能力高的菌株次黃苷+PPi→5’-IMP+Pi5’-IMP+H2O→次黃苷+Pi工業(yè)生產(chǎn)用酶然后選擇5’-核苷酸產(chǎn)量最高的菌株Morgane72工業(yè)生產(chǎn)用酶在兩輪隨機(jī)突變后科研人員獲得了生產(chǎn)性能有大幅提高的菌株，其中的酶發(fā)生了Gly92Asp和Ile171Thr的突變；突變型酶與野生型相比，與次黃嘌呤核苷的親和性明顯加強(qiáng)，5’-IMP的生產(chǎn)性能大幅提高，而且IMP的水解也受到抑制。生成的核苷酸只有5’-核苷酸，沒(méi)有2’-、3’-核苷酸副產(chǎn)物。此外，該酶的底物特異性廣泛，適用于各種5’