RNABiology–PartIIIP2Theaccuracyoftranslation1、mRNA的錯誤翻譯<10-62、Twotypesoferrorsfromtheribosome:Frameshift移碼突變:~10-5Incorrectaminoacid:~5x10-43、Twotypesoferrorsfroman氨酰-tRNA合成酶:Wrongaminoacid、WrongtRNAP3SmallnuclearRNA(snRNA)小核RNA——eukaryoticcellnucleus?100-300nucleotidesinsize?許多snRNA是剪接體的組分：Majorspliceosome:U1,U2,U4,U5,U6Minorspliceosome:U11,U12P42種snRNA?Sm-classsnRNA?Lsm-classsnRNAP6SmallnucleolarRNA(snoRNA)小核仁RNA指導其他RNAs的初級化學修飾(rRNA,tRNA,snRNA)兩種snoRNA?C/DboxsnoRNAs?H/ACAboxsnoRNAsP7RNApairingwithboxC/DsnoRNAstoguidemethylationreactions甲基化.P8RNApairingwithboxH/ACAsnoRNAstoguidepseudouridylylations假尿苷化.P9Non-codingRNAs非編碼RNAsHousekeepingncRNAs：tRNA,rRNA,snRNA…RegulatoryncRNAs：miRNA、lncRNA…P10microRNAs(miRNAs)微RNA真核生物基因組編碼（內源的）的(~22-ntlong)RNAmolecules.Thehumangenomehas>1000genescodeformiRNAs(~5%ofthegenome).Atleast30%ofourgenesareregulatedbymiRNAs,miRNAs參與RNAinterference(RNAi).RNAinterference(RNAi):Aprocessbywhichshort(21to23)nucleotideantisenseRNAs,derivedfromlongerdouble-strandedRNAs,canmodulateexpressionofmRNAbytranslationinhibitionordegradation.RNA干擾指由雙鏈RNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的技術。P13miRNA-mRNA相互作用的模型1.The“seed”region:nucleatesthemiRNA-mRNAassociation.2.Bulgeormismatchesinthecentralregion:precluding排除thecleavageofmRNA.3.Reasonablecomplementarityonthe3’endtostabilizethisinteraction.P14ShortinterferingRNA(siRNAs)干擾小RNA外源合成或病毒產生的RNAiP17miRNApathwayPrimarymiRNAtranscripts(pri-miRNA)areatleast1000ntlong,containsingleorclustereddouble-strandedhairpinswithsingle-stranded5’and3’-terminaloverhangs.DNARNApol=2\*ROMANIIpri-miRNADroshaandDGCR8pre-miRNADicermiRNAduplexcleavageP20Precursor先驅miRNA(pre-miRNA)Pre-miRNAisexportedtothecytoplasmbyExportin-5andRanGTP.P21Dicer:anendoribonuclease內切核糖核酸酶responsibleforcleavinglongdsRNAsand/orpre-miRNAstodsRNAduplexesofaspecificlengthdsRBP:double-strandedRNA-bindingprotein.siRNA介導沉默的機理：轉錄后水平的mRNA的降解以及染色體水平上形成異染色質。siRNA介導mRNA的降解需要核酸酶的催化以及鎂離子的幫助。miRNA的功能：裝載成RISC后使互補配對的mRNA降解；miRNA也可抑制mRNA的翻譯，降低靶基因的蛋白水平但不影響其mRNA的水平。P25RISC:RNA-inducedsilencingcomplexRISCloadingcomplex(RLC):acomposedofatleastArgonaute(Ago),Dicer,andadsRBP.RLCgeneratediceddsRNAandloaditontoArgonaute.RISC裝載與鏈選擇一致。Argonaute(Ago)為一種蛋白，具體名字未查到。siRNAmiRNAsiRNAmiRNAP29Post-initiationtranslationrepression后起始翻譯抑制A、Blockingtranslationelongationorpromotepre-maturedissociationofribosomes.阻斷翻譯延長或促進成熟核糖體解離。B、Translationisnotinhibitedbutthenascentpeptidechainisdegradedco-translationally.翻譯不抑制，但新生肽鏈邊合成邊降解。AgocancompetewitheIF4Eforbindingtothe5’capstructure.Ago與eIF4E競爭結合到5’cap結構。B、AgocanrecruiteIF6,whichpreventsthelargeribosomalsubunitfromjoiningthesmallsubunit.阻止核糖體大小亞基結合。P31Deadenylation脫腺苷化degradationA、AgocanpreventmRNAcircularization環(huán)化B、miRNAtriggersdeadenylationandsubsequentlydecapping脫蓋P33ApplicationsofRNAi?Usedinavarietyoforganisms用于各種生物?High-throughputscreens高通量篩選?ThedevelopmentofRNAiasatherapeuticstrategy治療策略?miRNAasbiomarkersanddiagnosticsmiRNA作為生物標志物和診斷P34Agenome-wideRNAiscreenforinfluenzavirus流感病毒hostcellularfactors.P35miRNAsasbiomarkers.一、C值(C-Value)：在每一種生物中其單倍體基因組的DNA總量是特異的，被稱為C值。C值悖論：物種的C值和它進化的復雜性之間沒有嚴格的對應關系，這種現象稱為C值悖論。注：高等生物具有比低等生物更復雜的生命活動，所以理論上應該是它們的C值也應該更高。但是事實上C值沒有體現出與物種進化程度相關的趨勢。高等生物的C值不一定就意味著它的C值高于比它低等的生物。這種生物學上的DNA總量的比較和矛盾，稱為C值悖論。二、長鏈非編碼RNA(longnoncodingRNA,lncRNA)：lncRNA是一類轉錄本長度超過200nt、不編碼蛋白的RNA。（1stidentifiedintheearly1990’s:Xist&H19）注：LncRNAXist(Xchromosomeinactivespecifictranscript)就是通過調節(jié)目的基因使CpG島發(fā)生甲基化，抑制X染色體基因的表達來介導X染色體失活;基因組印記是指來自親本的等位基因傳遞給子代時發(fā)生了修飾，使帶有親本印記的等位基因表達與親本不同的性狀。而H19LncRNA對維持人類11號染色體近端的IGF2受體-H19基因組印跡具有非常重要的作用lncRNA特點：lncRNA的表達受調控，呈現組織和細胞特異性。物種之間保守性差它們包含許多類型的轉錄本，在結構上類似mRNA，有時也轉錄成編碼基因的反義轉錄本。相當一部分lncRNA只位于細胞核內。lncRNA被認為執(zhí)行了重要的調控功能，也與疾病發(fā)展息息相關lncRNA的分類AntisenselncRNA(反義長非編碼RNA)Intronictranscript(內含子非編碼RNA)BidirectionallncRNAs（雙向lncRNA）IntergeniclncRNAs（基因間lncRNA）注：劉默芳老師課件中的分類：對lncRNA的研究方法染色質標記：啟動子區(qū)：組蛋白H3賴氨酸4三甲基化（H3K5me3）轉錄單位：組蛋白H3賴氨酸36三甲基化（H3K36me3）CAGE-seq：加帽的RNA片段的測序轉錄物的精確開始3P-seq：多聚腺苷酸化的末端測序轉錄物的精確末端注：如何排除IncRNA編碼蛋白的潛力TranslatelncRNAsinall3frames，并對蛋白質家族和結構域數據庫進行同源性檢索CSF：密碼子替代頻率RibosomeProfiling（源自劉默芳老師PPT）RNA分子功能鑒定：基因表達分析：High‐throughputRNAseqRNA合成動態(tài)分析：Bromouridelabel+RNAseq翻譯水平檢測：RibosomeProfilinglncRNA的作用機制Decoy(誘餌)：lncRNA可以阻止調節(jié)蛋白進入DNA，結合其它調控RNA或蛋白并屏蔽其功能eg.Gas5糖皮質激素受體（GR）的DNA結構域與糖皮質激素反應元件（GRE）相結合代謝轉錄基因饑餓條件下Gas5被誘導，Gas5結構類似于GR的DNA結合位點，即Gas5-GRinteractionsGR-GREinteractionsScaffold（支架）：lncRNA可以作為銜接子使兩種或多種蛋白質空間上更接近，作為相關分子元件組裝的平臺eg.HOTAIR（HOXtranscriptantisenseintergenicRNA）2148-nt，能形式獨立的結構域。其5'結構域結合PRC2復合物，其3'結構域結合LSD1-CoREST復合物，協(xié)調H3K27甲基化和H3K4me2去甲基化，導致基因沉默Guide（向導）：lncRNA可以指導DNA招募蛋白質，即指導核糖核蛋白復合物定位eg.Xist（X-inactivespecifictranscript）：在人中為17kbX染色體失活過程的主要原因有兩個功能：定位到DNA和沉默基因表達lncRNA的功能X染色體失活，基因組印記及染色質修飾，轉錄激活/沉默，核內運輸等三、核酶ribozyme：主要指一類具有催化功能的RNA，亦稱RNA催化劑1.核酶的歷史：核酶的發(fā)現從根本上改變了以往只有蛋白質才具有催化功能的概念，為此Cech和Altman獲得了1989年的諾貝爾獎。T.Cech的重要發(fā)現開始于1981年。研究目的：細胞中DNA轉錄成rRNA后，rRNA中一些“內含子”（intron），如何從RNA分子中剪切下來的。根據過去傳統(tǒng)的概念，這一過程必須要有蛋白質酶來完成。研究對象：原生動物四膜蟲，其含有一種RNA，組成中除了核糖體RNA外還有一個由413個核苷酸組成的插入序列（interveningsequenc，IVS）。研究發(fā)現：轉錄產物rRNA前體很不穩(wěn)定，在鳥苷和Mg2+存在下切除自身的413個核苷酸的內含子（IVS），使兩個外顯子拼接起來，變成成熟的rRNA分子。催化反應是在沒有任何蛋白質酶的存在下發(fā)生的，稱為自我剪接。首次發(fā)現rRNA基因轉錄產物的I型內含子剪切和外顯子拼接過程可在無任何蛋白質存在的情況下發(fā)生，證明了RNA具有催化功能。為區(qū)別于傳統(tǒng)的蛋白質催化劑，Cech給這種具有催化活性的RNA定名為核酶。1983年Altman等人在研究細菌RNaseP時發(fā)現研究目的：t-RNA分子的剪接過程。核糖核酸酶P是一種核糖核蛋白,含有一個單鏈RNA分子,長度為375個堿基，結合一個相對分子質量為20kDa的多肽(119個氨基酸殘基)。過去都認為核酸酶P的催化作用由RNA和蛋白質共同完成的。而該實驗證明，核酸酶P的催化作用是由RNA完成的，而其中的蛋白質在細胞內僅僅起穩(wěn)定構象的作用。研究發(fā)現：在較高濃度的鎂離子和適量精氨酸參與下，核酸酶P（ribonucleaseP，RNaseP）中的RNA能夠切割tRNA前體的5端。隨著研究的深入，Cech發(fā)現L-19RNA在一定條件下，能以高度專一性的方式去催化寡聚核苷酸底物的切割與連接。核酶可以識別底物RNA的特定序列，并在專一性位點上進行切割，其特異性接近DNA限制性內切酶，高于RNase，具有很大的潛在的應用價值。2.核酶的特點?具有催化活性的RNA?可以表征酶活性?催化活性可以是分子間或分子內（一輪）?核糖體是核酶！3.核酶的分類：剪接型核酶：指RNA分子被磷酸二酯酶水解切割后，伴隨著形成新的磷酸二酯鍵，即磷酸二酯鍵的轉移反應或稱轉酯反應。其作用機制是通過既剪有接的方式除去內含子I類內含子：一類具有酶催化功能的內含子,轉錄成RNA后可以自我剪接。此類內含子轉錄后可以形成9個由堿基配對形成的特定二級結構，分別命名為P1至P9,P1和P7是保守的。P3，P4，P6和P7的核心區(qū)域具有催化性在剪接反應中,要有一種鳥嘌呤核苷(含有游離的3'-OH)G-OH。G首先結合到內含子的5'端,當線性的內含子成為環(huán)狀時,其3'端可以距離5'端15個核苷酸以外,從而將原來的5'端和15個堿基(或以上)的節(jié)段(包括G)切除出去。這種自我剪接,是由RNA的特定序列的核酸內切酶的活性所催化。剪切型核酶：這類RNA進行自身催化的反應是只切不接。特點是在Mg2+或其他二價金屬離子存在下，在特定的位點，自我剪切，產生5‘-OH和2’，3‘-環(huán)磷酸二酯末端。eg.RNaseP可剪切前體5‘端41nt,5’端成熟。不同tRNA的5’端沒有順序共同性，剪切的準確性與剪切部位周圍的核苷酸順序無關，表明在RNaseP的組分內沒有引導序列，RNaseP所識別的是底物的高級結構。錘頭型核酶對切割位點的識別位點遵守NUH規(guī)則（N代表任意核苷酸，H代表A,U或C）。催化過程需要二價金屬離子參與。有三個雙螺旋區(qū)，13個核苷酸殘基保守序列，剪切反應在右上方GUX序列的3‘端自動發(fā)生四、SELEX即指數富集的配基系統(tǒng)進化技術(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX)。利用該技術可以從隨機單鏈核酸序列庫中篩選出特異性與靶物質高度親和的核酸適體(Aptamer)。自Tuerk等首先運用此技術篩選到特異性吸附噬菌體T4DNA聚合酶和有機染料分子的特異寡核苷酸配基后，經過十幾年的發(fā)展，SELEX技術已經成為一種重要的研究手段和工具。1.原理：基本思想是體外化學合成一個單鏈寡核苷酸庫，用它與靶物質混合，混合液中存在靶物質與核酸的復合物，洗掉未與靶物質結合的核酸，分離與靶物質結合的核酸分子，以此核酸分子為模板進行PCR擴增，進行下一輪的篩選過程。通過重復的篩選與擴增，一些與靶物質不結合或與靶物質有低親和力、中親和力的DNA或RNA分子被洗去，而"適配子"(Aptamer)即與靶物質有高親和力的DNA或RNA從非常大的隨機文庫中分離出來，且純度隨SELEX過程的進行而增高，從P摩爾到n摩爾，最后占據庫的大多數(>90%左右)。注：SELEX首先根椐分子生物學技術，人工合成單鏈隨機寡核苷酸文庫。通常文庫容量為10"一10個單鏈寡核苷序列。文庫包括DNA文庫、RNA文庫、修飾化的RNA文庫。文庫的中間為隨機序列，序列長度往往在20~40bp之間。隨機序列兩端是帶有限制性內切酶位點的固定序列，此固定序列是多聚酶鏈反應及其他酶學反應相關引物的結合位點。在隨機文庫中，單鏈隨機寡核苷酸分子