診斷學(xué)第一頁，共五十五頁。2臨床(línchuánɡ)病原學(xué)檢查山東大學(xué)(shāndōnɡdàxué)劉金玲第二頁，共五十五頁。臨床(línchuánɡ)病原體檢查目的臨床病原體檢查目的:是確定感染的發(fā)生和性質(zhì)(xìngzhì)，在疾病早期提供恰當(dāng)?shù)闹委煼桨?，并采取有效的預(yù)防措施，防止感染傳播造成的危害。第三頁，共五十五頁。各種不同病原體的實驗診斷方法遵循(zūnxún)以下基本原則1.正確、規(guī)范采集和運送標(biāo)本。2.直接顯微鏡查見病原體或檢出病原體抗原，借助分子生物學(xué)的方法檢測病原體核酸，結(jié)合病人的病史、癥狀或體征，快速作出初步診斷。3.初步診斷同時，對病原體進行分離與鑒定。4.檢測機體對病原體的免疫產(chǎn)物。5.參與臨床(línchuánɡ)選擇抗菌藥物，指導(dǎo)和監(jiān)控微生物的治療方案，避免

耐藥菌株的產(chǎn)生。第四頁，共五十五頁。5病原學(xué)診斷(zhěnduàn)細菌學(xué)診斷(zhěnduàn)病毒學(xué)診斷真菌學(xué)診斷

第五頁，共五十五頁。致病菌的檢驗(jiǎnyàn)程序和常用項目標(biāo)本(biāoběn)直接涂片(túpiàn)染色鏡檢分離培養(yǎng)形態(tài)特征生化試驗血清學(xué)試驗動物實驗明確診斷初步診斷血清學(xué)診斷細菌的快速鑒定形態(tài)學(xué)檢查（常規(guī)培養(yǎng)或特殊培養(yǎng)）（凝集試驗、沉淀反應(yīng)、免疫標(biāo)記技術(shù)等）(微生物數(shù)字編碼分類鑒定法、血培養(yǎng)自動化檢測系統(tǒng)、核酸雜交技術(shù)、PCR技術(shù)、DNA芯片技術(shù)等）藥物敏感試驗第六頁，共五十五頁。7細菌感染檢查(jiǎnchá)檢驗特點通過對標(biāo)本直接顯微鏡檢，病原菌的分離培養(yǎng)鑒定，病原菌的抗原檢測，核酸檢測和細菌感染后機體免疫應(yīng)答產(chǎn)物的測定(cèdìng)及藥物的測定(cèdìng)及藥物敏感性試驗，對細菌感染性疾病可作出及時、準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷。第七頁，共五十五頁。DiagnosisStrategyforBacterialInfection第八頁，共五十五頁。9

革蘭陽性菌(Grampositivebacteria)

革蘭陰性菌(Gramnegativebacteria)涂片結(jié)晶紫

染色碘液媒染酒精脫色復(fù)紅復(fù)染革蘭染色法（GramStain）由丹麥(dānmài)醫(yī)生HansChristianGram于1884年創(chuàng)立。1.步驟(bùzhòu)第九頁，共五十五頁。①直接涂片(túpiàn)染色鏡檢適用于具有特征性形態(tài)和染色性的病原菌,如葡萄球菌、腦膜炎奈瑟菌、抗酸染色(rǎnsè)陽性的結(jié)核分枝桿菌等。第十頁，共五十五頁。大多數(shù)細菌的形態(tài)與染色并無顯著特異性，因此需要(xūyào)分離培養(yǎng)。如腸道桿菌均為G-桿菌，菌落形態(tài)亦相同。培養(yǎng)特征：化膿性鏈球菌---小而透明、溶血環(huán)。②分離(fēnlí)培養(yǎng)第十一頁，共五十五頁。生化試驗：如腸道桿菌進行乳糖發(fā)酵試驗。血清(xuèqīng)學(xué)試驗：已知抗體測抗原或已知抗原測病人血清(xuèqīng)中相應(yīng)的抗體。如玻片凝集，鑒定菌種和型。動物試驗：測定細菌的毒力、病原菌的分離和鑒定。②分離(fēnlí)培養(yǎng)第十二頁，共五十五頁。③血清學(xué)診斷(zhěnduàn)原理：已知抗體測未知抗原進行病原菌的鑒定或用已知抗原檢測患者體液中有無相應(yīng)(xiāngyīng)特異性抗體和其效價的動態(tài)變化，可作為某些傳染病的輔助診斷。標(biāo)本：雙份血清標(biāo)本，恢復(fù)期血清抗體效價比急性期升高≥4倍者方有意義。單份血清效價超過一定標(biāo)準(zhǔn)才有診斷意義。種類：凝集試驗、沉淀試驗、中和試驗、補體結(jié)合試驗。第十三頁，共五十五頁。常用的血清學(xué)診斷(zhěnduàn)方法類型診斷應(yīng)用舉例直接凝集試驗傷寒和副傷寒（肥達試驗）、立克次體（外斐試驗）、鉤端螺旋體（顯微凝集試驗）乳膠凝集試驗檢測腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌等抗體沉淀試驗梅毒（VDRL、RPR試驗）補體結(jié)合試驗檢測Q熱柯克斯體等抗體中和試驗風(fēng)濕熱（抗O試驗）ELISA廣泛用于病原體的診斷和流行病學(xué)調(diào)查第十四頁，共五十五頁。玻片凝集(níngjí)試驗試管凝集(níngjí)試驗第十五頁，共五十五頁。酶聯(lián)免疫吸附試驗(shìyàn)第十六頁，共五十五頁。④細菌(xìjūn)的快速鑒定API細菌數(shù)值鑒定(jiàndìng)系統(tǒng)第十七頁，共五十五頁。PCR技術(shù)(jìshù)第十八頁，共五十五頁。19姬姆薩染色(rǎnsè)衣原體包涵體HSV病毒(bìngdú)被支原體感染(gǎnrǎn)的精子梅毒螺旋體第十九頁，共五十五頁。20

檢測(jiǎncè)程序第二十頁，共五十五頁。病毒感染的微生物學(xué)(wēishēnɡwùxué)檢查法

第二十一頁，共五十五頁。DiagnosisStrategyforViralInfection第二十二頁，共五十五頁。23病毒感染的微生物學(xué)(wēishēnɡwùxué)檢查法

第二十三頁，共五十五頁。ELISAforHIVantibody

MicroplateELISAforHIVantibody:colouredwellsindicatereactivity第二十四頁，共五十五頁。病毒(bìngdú)的數(shù)量與感染性測定蝕斑測定(cèdìng)：準(zhǔn)確滴定病毒感染性的方法蝕斑（Plaque）每個蝕斑是由一個有感染性病毒顆粒形成，稱為蝕斑形成單位（Plaqueformingunit，PFU）。病毒的感染量用PFU/ml表示50%感染量（ID50）或50%組織細胞感染量（TCID50）不能準(zhǔn)確地測定感染性病毒顆粒的數(shù)量第二十五頁，共五十五頁。乙型肝炎的病原學(xué)診斷(zhěnduàn)

第二十六頁，共五十五頁。A病毒性肝炎(ɡānyán)HepatitisVirus腸道傳播(chuánbō)腸道外傳播(chuánbō)F,TTV?其他ENANBBDC病毒性肝炎-背景第二十七頁，共五十五頁。

傳染源糞便(fènbiàn)血液(xuèyè)/血源性物質(zhì)(wùzhì)/體液血液/血源性物質(zhì)/體液血液/血源性物質(zhì)/體液糞便傳播途徑糞-口經(jīng)皮膚/經(jīng)粘膜經(jīng)皮膚/經(jīng)粘膜經(jīng)皮膚/經(jīng)粘膜糞-口慢性感染否是是是否病毒性肝炎類型ABCDE基因組類型ssRNAdsDNA

ssRNA

ssRNA

ssRNA第二十八頁，共五十五頁。HepatitisBVirus乙型肝炎的病原體在全世界廣泛流行，估計全球(quánqiú)半數(shù)以上人口已被HBV感染過，5%的人口為HBV慢性感染中國：乙肝高發(fā)區(qū)，人群HBsAg的檢出率達9.8%第二十九頁，共五十五頁。HBVvirionTheinfectiousvirioniscalledtheDANEparticle.第三十頁，共五十五頁。HBVViralGenomeOrganizationHBsAgHBcAgHBeAg3200BasePairGenomeHepatocytereceptorbindngsiteHBVDNAPolymeraseProteinthattransactivatestranscriptionalpromotors第三十一頁，共五十五頁。BothcomprisedofHBsAg第三十二頁，共五十五頁。HBVnomenclatureHBV:hepatitisB

virusHBsAg:hepatitisBvirussurfaceantigenHBsAb:hepatitisBvirussurfaceantibodyHBcAg:hepatitisBviruscoreantigenHBcAb:hepatitisBviruscoreantibodyHBeAg:hepatitisBviruse

antigenHBeAb:hepatitisBviruse

antibody第三十三頁，共五十五頁?？乖?kàngyuán)組成--HBsAg位于病毒表面，是一種糖蛋白4種亞型(adr,adw,ayr,ayw)歐美國家:adw我國漢族:adr我國少數(shù)民族:ayw判斷HBV感染的指標(biāo)(zhǐbiāo)之一刺激機體產(chǎn)生保護性抗體即抗-HBs第三十四頁，共五十五頁?？乖?kàngyuán)組成--HBcAg位于Dane顆粒核心部分和肝細胞核內(nèi)，在血清中不易檢出游離的HBcAg主要成分是蛋白質(zhì)刺激機體產(chǎn)生抗-HBc(非保護性抗體(kàngtǐ))在乙肝急性期、恢復(fù)期和HBsAg攜帶者中?？蓹z出抗-HBc抗-HBcIgM常提示病毒處于復(fù)制狀態(tài)第三十五頁，共五十五頁。抗原(kàngyuán)組成--HBeAg位于HBV的核心,是一種可溶性蛋白抗原HBeAg和Dane顆粒出現(xiàn)相平行，且與DNA多聚酶在血中的消長(xiāozhǎng)動態(tài)相符合血中HBeAg的出現(xiàn)可作為HBV復(fù)制及血清有感染性的指標(biāo)刺激機體產(chǎn)生抗-HBe抗-HBe能與受染肝細胞表面的e抗原結(jié)合,通過補體介導(dǎo)破壞受染的肝細胞,抗-HBe的出現(xiàn)是預(yù)后良好的征象第三十六頁，共五十五頁。抗原(kàngyuán)組成--Pre-S抗原位于HBV的外衣殼上，有兩種刺激機體產(chǎn)生抗Pre-S1和抗Pre-S2，能阻斷HBV與肝細胞受體結(jié)合，從而起到抵抗病毒的作用抗Pre-S1和抗Pre-S2的出現(xiàn)，表示病情好轉(zhuǎn)，趨向(qūxiàng)痊愈第三十七頁，共五十五頁。傳染源患者(huànzhě)潛伏期急性期慢性期無癥狀HBsAg攜帶者第三十八頁，共五十五頁。

各種體液(tǐyè)中HBV的濃度高中等低/不能檢出血液精液尿血清陰道分泌物糞便傷口滲出物唾液汗液淚液乳汁第三十九頁，共五十五頁。血源性傳播輸血、注射、外科和牙科手術(shù)、針刺等剃刀(tìdāo)、牙刷和蚊蟲叮咬等母嬰垂直傳播宮內(nèi)傳播分娩時微小皮損處傳播產(chǎn)后母嬰密切接觸性傳播HBV傳播(chuánbō)途徑第四十頁，共五十五頁。高(>8%):占45%一生感染的危險>60%嬰幼兒感染常見(chánɡjiàn)中等(2%～7%):占43%一生感染的危險是20%～60%感染存在于所有年齡組低(<2%):占12%一生感染的危險<20%許多感染發(fā)生在成人危險組GlobalPatternsofChronicHBVInfection第四十一頁，共五十五頁。第四十二頁，共五十五頁。病原學(xué)診斷(zhěnduàn)---抗原抗體檢測項目：HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc以及抗-HBcIgM方法ELISA(enzyme-linkedimmunosorbentassay，最常用，定性)發(fā)光(fāɡuānɡ)免疫分析(定量)反相間接血凝試驗(少用)第四十三頁，共五十五頁。ELISA的基本原理利用抗原和抗體特異性結(jié)合主要的試劑(shìjì)固相抗原或抗體酶標(biāo)記的抗原或抗體酶的底物第四十四頁，共五十五頁。ELISA的主要(zhǔyào)方法間接(jiànjiē)法:測定抗-HBs夾心法：測定HBsAg和HBeAg競爭法：測定抗-HBc中和法：測定抗-HBe捕捉法：測定抗-HBcIgM第四十五頁，共五十五頁。病原學(xué)診斷(二)---核酸(hésuān)檢測核酸(hésuān)雜交探針PCR引物第四十六頁，共五十五頁。HBsAg–感染的標(biāo)志Anti-HBs–既往感染/接種疫苗Anti-HBcIgM–急性感染標(biāo)志Anti-HBcIgG–既往或慢性感染HBeAg–急性病毒(bìngdú)復(fù)制，有傳染性

Anti-HBe–病毒不再復(fù)制HBV-DNA–急性病毒復(fù)制，比HBeAg更準(zhǔn)確；主要用于監(jiān)測治療反應(yīng)第四十七頁，共五十五頁。血清學(xué)檢測(jiǎncè)的臨床意義HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc臨床意義急性(jíxìng)或慢性感染(大三陽)+-+-++++乙肝后期(hòuqī)或慢性感染(小三陽)--++---潛伏期或急性乙肝早期--+++痊愈或恢復(fù)期,有免疫力-----+++--痊愈,有免疫力疫苗接種或曾經(jīng)感染過,有免疫力第四十八頁，共五十五頁。SymptomsHBeAganti-HBeTotalanti-HBcIgManti-HBcanti-HBsHBsAg0481216202428323652100AcuteHBVInfectionwithRecoveryTypicalSerologicCourseWeeksafterExposureTitre第四十九頁，共五十五頁。第五十頁，共五十五頁。IgManti-HBcTotalanti-HBcHBsAgAcute(6months)HBeAgChronic(Years)anti-HBe04812