一、免疫細(xì)胞的特征1、免疫細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征理化性狀生物學(xué)特性2、免疫細(xì)胞的膜分子特征

CD分子第一頁，共七十五頁。第二頁，共七十五頁。NKcells吞噬溶酶體第三頁，共七十五頁。第四頁，共七十五頁。二、免疫細(xì)胞的別離技術(shù)1、密度梯度離心法2、黏附別離法3、熒光激活別離法4、磁性別離法5、其他別離法第五頁，共七十五頁。1、密度梯度離心法聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F/H)分層液Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，親水性高，平均分子量為400,000，當(dāng)密度為1.2g/ml仍未超出正常生理性滲透壓，也不穿過生物膜。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少局部細(xì)胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細(xì)胞，就可從外周血中別離到單個(gè)核細(xì)胞。第六頁，共七十五頁。離心前離心后稀釋抗凝血淋巴細(xì)胞別離液血漿單個(gè)核細(xì)胞粒細(xì)胞紅細(xì)胞第七頁，共七十五頁。2、黏附別離法-純淋巴細(xì)胞群的別離貼壁法：將已制備的單個(gè)核細(xì)胞懸液傾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃溫箱靜置1h左右，單核細(xì)胞和粒細(xì)胞均貼于平皿壁上，而未貼壁的非粘附細(xì)胞幾乎為純淋巴細(xì)胞，繼用橡皮刮下貼壁的細(xì)胞即為純單核細(xì)胞群。因B細(xì)胞也有貼壁現(xiàn)象，用本法別離的淋巴細(xì)胞群中B細(xì)胞有所損失。第八頁，共七十五頁。2、黏附別離法：淋巴細(xì)胞亞群的別離尼龍毛法：混合單個(gè)核細(xì)胞懸液在通過尼龍毛柱時(shí)，B細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞和一些輔助細(xì)胞被選擇性粘附于尼龍毛上，而多數(shù)T細(xì)胞那么通過尼龍毛柱，這是獲得富含T細(xì)胞群的有效方法。T細(xì)胞得率為20-30%左右。親和板法：利用親和層析法別離淋巴細(xì)胞亞群，其原理是各種淋巴細(xì)胞亞群具有不同的抗原性，將相應(yīng)抗體結(jié)合于塑料平板上，繼加細(xì)胞懸液，凡抗原陽性的細(xì)胞那么與相應(yīng)抗體結(jié)合，抗原陰性的細(xì)胞可從未吸附的細(xì)胞懸液中獲取。吸附柱法：將單個(gè)核細(xì)胞懸液注入裝有玻璃纖維或葡聚糖凝膠SephadexG10的柱層中，凡有粘附能力的細(xì)胞絕大局部被吸附而粘滯在柱層中，從柱上洗脫下來的細(xì)胞主要是淋巴細(xì)胞。此法簡(jiǎn)單易行，對(duì)細(xì)胞極少損害。第九頁，共七十五頁。3、熒光激活別離法〔FACS〕第十頁，共七十五頁。流式細(xì)胞儀第十一頁，共七十五頁。4、磁性別離法〔1〕磁鐵吸引法：利用單核細(xì)胞具有吞噬的特性，在單個(gè)核細(xì)胞懸液中加直徑為3μm的羰基鐵顆粒，置37℃溫箱內(nèi)短時(shí)旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)，待單核細(xì)胞充分吞噬羰基鐵顆粒后，用磁鐵將細(xì)胞吸至管底，上層液中含較純的淋巴細(xì)胞?！?〕磁激活細(xì)胞別離術(shù)MACs：是一種特異性細(xì)胞分選技術(shù)，其高度特異性來自抗體對(duì)抗原的特異性識(shí)別。主要組成成分為MACS微珠、MACS分選柱和MACS分選器。MACS微珠是與高度特異性單克隆抗體相偶聯(lián)的超順磁化微粒。MACS分選柱置于一個(gè)永久性磁場(chǎng)—MACS分選器中，可以將磁力增強(qiáng)1000倍，足以滯留僅標(biāo)記極少量微珠的目的細(xì)胞。用緩沖液沖洗分選柱，所有未標(biāo)記的細(xì)胞被沖洗掉。分選柱離開磁場(chǎng)，即可獲得被標(biāo)記的細(xì)胞組分。第十二頁，共七十五頁。MACS(陽性選擇法〕NS第十三頁，共七十五頁。MACS(陰性選擇法〕NS第十四頁，共七十五頁。第十五頁，共七十五頁。第十六頁，共七十五頁。5、其他別離法花環(huán)沉降法：本法是將淋巴細(xì)胞與一定比例的綿羊紅細(xì)胞混合，待淋巴細(xì)胞形成E花環(huán)后，繼用淋巴細(xì)胞分層液別離細(xì)胞。浮懸在分層界面而不形成E花環(huán)的群那么富含B細(xì)胞，而沉降在管底的形成E花環(huán)的細(xì)胞用低滲法處理，使圍繞細(xì)胞周圍的綿羊紅細(xì)胞快速裂解，那么獲得純的T細(xì)胞?？扇苄訫HC-肽四聚體法：mhc-肽四聚體復(fù)合物的原理是通過增強(qiáng)t細(xì)胞受體與mhc-肽復(fù)合物親和力，到達(dá)可直接特異性檢測(cè)t細(xì)胞的目的。作為臨床診斷工具，定量檢測(cè)外周血及組織中抗原特異性CTLs的比率，并進(jìn)行表型及功能分析。

用于過繼性腫瘤免疫治療

用于疫苗療效的監(jiān)測(cè)第十七頁，共七十五頁?？乖?MHC分子四聚體技術(shù)T第十八頁，共七十五頁。MHCI類(左)和Ⅱ類(右)分子四聚體結(jié)構(gòu)示意圖第十九頁，共七十五頁。三、細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇1、細(xì)胞凍存的原理與方法：在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶，引起細(xì)胞死亡。向培養(yǎng)液參加保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在-130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。2、細(xì)胞復(fù)蘇的原理與方法：細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快，使之迅速通過細(xì)胞最易受損的－5～0℃，細(xì)胞仍能生長(zhǎng)，活力受損不大。目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜〔DMSO〕和甘油，它們對(duì)細(xì)胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞。第二十頁，共七十五頁。細(xì)胞凍存罐第二十一頁，共七十五頁。

第二節(jié)免疫細(xì)胞膜分子的檢測(cè)一、免疫細(xì)胞膜分子檢測(cè)的原理與類型二、免疫細(xì)胞膜分子的檢測(cè)方法第二十二頁，共七十五頁。一、免疫細(xì)胞膜分子檢測(cè)的原理與類型1、以抗體識(shí)別抗原2、以配體識(shí)別受體第二十三頁，共七十五頁。二、免疫細(xì)胞膜分子的主要檢測(cè)方法1、免疫標(biāo)記檢測(cè)方法熒光抗體法酶免疫檢測(cè)法免疫金銀染色法2、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒試驗(yàn)〔CDC〕3、花環(huán)形成試驗(yàn)第二十四頁，共七十五頁。SmIg的熒光抗體檢測(cè)法第二十五頁，共七十五頁。SmIg的酶免疫檢測(cè)法第二十六頁，共七十五頁。補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒試驗(yàn)〔CDC〕染料補(bǔ)體第二十七頁，共七十五頁。E-花環(huán)：利用T細(xì)胞膜上的異種動(dòng)物紅細(xì)胞受體T細(xì)胞B細(xì)胞花環(huán)形成細(xì)胞綿羊紅細(xì)胞第二十八頁，共七十五頁。第二十九頁，共七十五頁。EA-花環(huán)：B淋巴細(xì)胞外表有Fc受體，能與免疫球蛋白的Fc段結(jié)合，因此用抗體致敏的紅細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞混合，可見B淋巴細(xì)胞周圍粘附有紅細(xì)胞第三十頁，共七十五頁。EAC-花環(huán)：B淋巴細(xì)胞外表有補(bǔ)體受體，在抗體致敏的紅細(xì)胞中參加補(bǔ)體，可形成紅細(xì)胞-抗體-補(bǔ)體復(fù)合物，再與B淋巴細(xì)胞混合，那么可形成EAC玫瑰花環(huán)。第三十一頁，共七十五頁。

第三節(jié)免疫細(xì)胞功能測(cè)定一、轉(zhuǎn)化、增殖試驗(yàn)二、細(xì)胞毒試驗(yàn)三、抗體形成試驗(yàn)四、細(xì)胞吞噬與殺傷試驗(yàn)第三十二頁，共七十五頁。1、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：刺激物分為非特異性〔如植物血凝素、刀豆素A等〕和特異性刺激因子〔如抗原〕；檢測(cè)方法為形態(tài)學(xué)檢測(cè)法和3H-TdR摻入法及MTT法等。2、混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)：混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(MLC)或稱混合淋巴細(xì)胞反響(MLR)常用于器官移植前的組織配型，以測(cè)定受體和供體主要組織相容性抗原(HLA抗原)相容的程度。由于MLC中淋巴細(xì)胞接受同種異型抗原的刺激而發(fā)生活化、增殖，產(chǎn)生種類眾多的細(xì)胞因子，促進(jìn)NK、LAK和CTL等殺傷細(xì)胞的分化，因此又是免疫調(diào)節(jié)研究中常用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｒ?、轉(zhuǎn)化、增殖試驗(yàn)第三十三頁，共七十五頁。第三十四頁，共七十五頁。放射性測(cè)定3H-TdR絲裂原〔抗原〕刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)原理示意小淋巴細(xì)胞在轉(zhuǎn)化為原始母細(xì)胞過程中，合成DNA增加，能夠吸收胸腺嘧啶核苷〔3H〕第三十五頁，共七十五頁。1、T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)2、ADCC作用測(cè)定3、NK活性測(cè)定二、細(xì)胞毒檢測(cè)試驗(yàn)

第三節(jié)免疫細(xì)胞功能測(cè)定第三十六頁，共七十五頁。放射性測(cè)定細(xì)胞毒試驗(yàn)原理示意靶細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞別離上清第三十七頁，共七十五頁。2、K細(xì)胞活性測(cè)定〔ADCC活性測(cè)定〕動(dòng)物機(jī)體有些免疫細(xì)胞，通過抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用〔ADCC〕殺傷靶細(xì)胞，如NK細(xì)胞、活化的T細(xì)胞、吞噬細(xì)胞等，這類細(xì)胞統(tǒng)稱為K細(xì)胞。K細(xì)胞的活性不僅反映機(jī)體細(xì)胞免疫的能力，而且與體液免疫也有直接的關(guān)系。K細(xì)胞活性檢測(cè)的方法有同位素釋放試驗(yàn)法，溶血空斑法，細(xì)胞剝離法和靶細(xì)胞接合試驗(yàn)。僅介紹同位素釋放法。第三十八頁，共七十五頁?！?〕原理將靶細(xì)胞用51Cr標(biāo)記后，再與特異性的IgG抗體結(jié)合，參加K細(xì)胞后即可發(fā)生ADCC效應(yīng)，引起靶細(xì)胞的溶解并釋放51Cr。用計(jì)數(shù)儀分別檢測(cè)上清和細(xì)胞沉淀中的cpm，根據(jù)上清中釋放的51Cr的多少，可判斷K細(xì)胞活性的上下。第三十九頁，共七十五頁?！?〕方法1、試驗(yàn)管：效應(yīng)細(xì)胞(淋巴細(xì)胞懸液)，標(biāo)記的靶細(xì)胞(Cr51標(biāo)記的雞紅細(xì)胞)和亞凝集單位的抗體(兔抗雞紅細(xì)胞抗體)各0.1ml，加RPMI1640完全培養(yǎng)基1.7ml〔ADCC〕。2、效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照管：效應(yīng)細(xì)胞和標(biāo)記的靶細(xì)胞各0.1ml加上述完全培養(yǎng)基1.8ml〔未加抗體〕。3、抗體對(duì)照管：標(biāo)記的靶細(xì)胞和亞凝集單位的抗體各0.1ml，加完全培養(yǎng)基1.8ml〔未加效應(yīng)細(xì)胞〕。4、最大釋放對(duì)照管：標(biāo)記的靶細(xì)胞0.1ml加蒸餾水1.9ml〔靶細(xì)胞會(huì)裂解，完全釋放同位素〕。5、自然釋放管：標(biāo)記的靶細(xì)胞0.1ml，加完全培養(yǎng)基1.9ml〔靶細(xì)胞不裂解，但可自然釋放一定量的同位素〕。以上各管均置37℃5～20h后，2500g離心10min，分別取各管上清夜1.0ml置于5支試管中，用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)各管上清和沉淀中的cpm值。第四十頁，共七十五頁?！?〕結(jié)果判斷和計(jì)算51Cr實(shí)驗(yàn)釋放率〔%〕2×(上清cpm—本底cpm)×100%(上清cpm-本底cpm)＋(沉淀cpm-本底cpm)51Cr特異釋放率〔%〕試驗(yàn)釋放率—自然釋放率×100%最大釋放率－自然釋放率第四十一頁，共七十五頁。3、NK細(xì)胞活性測(cè)定NK細(xì)胞是具有天然殺傷靶細(xì)胞活性的淋巴樣細(xì)胞，其殺傷作用不需要抗體、補(bǔ)體的參加，所殺傷靶細(xì)胞通常指腫瘤細(xì)胞和病毒感染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。這樣，可以將來源于同種動(dòng)物的腫瘤細(xì)胞系或病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系，作為檢測(cè)NK細(xì)胞活性的指示細(xì)胞。NK細(xì)胞活性測(cè)定多采用51Cr釋放法試驗(yàn)，其原理同細(xì)胞毒性T細(xì)胞試驗(yàn)中所采用的51Cr釋放法試驗(yàn)。在這里以檢測(cè)小鼠脾臟NK細(xì)胞活性為例，說明本試驗(yàn)方法。用3H-TdR摻入法，靶細(xì)胞為YAC-1細(xì)胞株〔小鼠淋巴瘤細(xì)胞系〕。第四十二頁，共七十五頁?！?〕試劑小鼠脾細(xì)胞懸液:別離單個(gè)脾臟細(xì)胞---裂解紅細(xì)胞---淋巴細(xì)胞洗滌配置懸液〔1640完全培養(yǎng)基2×106/ml〕。標(biāo)記的靶細(xì)胞：活淋巴細(xì)胞〔96%以上〕參加H3-Tdr---孵育2小時(shí)/每30min振搖---洗3次---配成2×106/ml懸液。第四十三頁，共七十五頁?！?〕方法試驗(yàn)組孔：脾細(xì)胞懸液(淋巴細(xì)胞)：標(biāo)記的靶細(xì)胞懸液100:1左右；對(duì)照組：?jiǎn)渭兗訕?biāo)記的靶細(xì)胞。37℃5%CO2培養(yǎng)18小時(shí)〔NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞〕；每孔加終濃度為0.15%的胰酶和0.0125%DNA酶37℃處理30min〔消化細(xì)胞和處理掉死亡靶細(xì)胞釋放出來的放射性DNA〕。各孔細(xì)胞收集后依次通過生理鹽水，5%三氯乙酸和無水乙醇〔獲得了存活的靶細(xì)胞的標(biāo)記DNA〕。待濾膜枯燥后用γ液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)定cpm值。三、結(jié)果計(jì)算NK細(xì)胞活性以特異性殺傷率表示：特異性殺傷率〔%〕＝〔1－試驗(yàn)組cpm/對(duì)照組cpm〕×100%第四十四頁，共七十五頁。1、直接溶血空斑試驗(yàn)2、間接溶血空斑試驗(yàn)3、SPA-SRBC溶血空斑試驗(yàn)三、抗體形成試驗(yàn)第四十五頁，共七十五頁。1、直接溶血空斑試驗(yàn)第四十六頁，共七十五頁。2、間接溶血空斑試驗(yàn)第四十七頁，共七十五頁。3、SPA-SRBC溶血空斑試驗(yàn)第四十八頁，共七十五頁。1、細(xì)胞吞噬功能試驗(yàn)2、細(xì)胞殺菌功能試驗(yàn)細(xì)胞吞噬與殺傷功能試驗(yàn)第四十九頁，共七十五頁。第五十頁，共七十五頁。吞噬百分率=吞有顆粒的吞噬細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)的吞噬細(xì)胞數(shù)吞噬指數(shù)=吞噬細(xì)胞吞噬的總顆粒數(shù)計(jì)數(shù)的吞噬細(xì)胞數(shù)第五十一頁，共七十五頁。NBT復(fù)原試驗(yàn)原理：N-N-C+H+N=N-R-N-NH2CN=NH四氮唑基〔淡黃色〕甲月簪基〔紫黑色〕第五十二頁，共七十五頁。NBT復(fù)原試驗(yàn)方法：1、抗凝血+硝基藍(lán)四氮唑〔NBT〕，37。C孵育25min。2、推片染色、鏡檢。正常值：NBT陽性細(xì)胞7.5-15%第五十三頁，共七十五頁。

第四節(jié)免疫細(xì)胞凋亡測(cè)定一、細(xì)胞凋亡的概念與原理二、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法第五十四頁，共七十五頁。

一、細(xì)胞凋亡的概念與原理1、細(xì)胞凋亡的概念2、細(xì)胞凋亡的原理3、細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)第五十五頁，共七十五頁。1、細(xì)胞凋亡〔apoptosis〕

細(xì)胞在內(nèi)源性基因調(diào)控下發(fā)生的主動(dòng)死亡過程，也稱程序性死亡。第五十六頁，共七十五頁。雖然凋亡與壞死的最終結(jié)果極為相似，但它們的過程與表現(xiàn)卻有很大差異。壞死〔necrosis〕：壞死是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素作用引起細(xì)胞無序變化的死亡過程。表現(xiàn)為細(xì)胞脹大，胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴(yán)重的炎癥反響。凋亡是細(xì)胞對(duì)環(huán)境的生理性病理性刺激信號(hào)，環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應(yīng)答有序變化的死亡過程。其細(xì)胞及組織的變化與壞死有明顯的不同。第五十七頁，共七十五頁。

凋亡壞死機(jī)制基因調(diào)控的程序化細(xì)胞死亡，主動(dòng)進(jìn)行（自殺性）意外事故性細(xì)胞死亡，被動(dòng)進(jìn)行（他殺性）誘因生理性或輕微病理性刺激因子誘導(dǎo)發(fā)生，如生長(zhǎng)因子缺乏病理性刺激因子誘導(dǎo)發(fā)生，如缺氧、感染、中毒死亡范圍多為散在的單個(gè)細(xì)胞多為聚集的大片細(xì)胞形態(tài)特征細(xì)胞固縮，核染色質(zhì)邊集，細(xì)胞膜及各細(xì)胞器膜完整，膜可發(fā)泡成芽，形成凋亡小體細(xì)胞腫脹，核染色質(zhì)絮狀或邊集，細(xì)胞膜及各細(xì)胞器膜溶解破壞，溶酶體酶釋放，細(xì)胞自溶生化特征耗能的主動(dòng)過程，有新蛋白合成，DNA早期規(guī)律降解為180-200bp片段，瓊脂凝膠電泳呈特征性梯帶狀不耗能的被動(dòng)過程，無新蛋白合成，DNA降解不規(guī)律，片段大小不一，瓊脂凝膠電泳不呈梯帶狀周圍反應(yīng)不引起周圍組織炎癥反應(yīng)和修復(fù)再生，但凋亡小體可被鄰近細(xì)胞吞噬引起周圍組織炎癥反應(yīng)和修復(fù)再生第五十八頁，共七十五頁。

2、細(xì)胞凋亡的原理凋亡信號(hào)——凋亡受體——信號(hào)傳導(dǎo)——凋亡基因啟動(dòng)——編碼程序性死亡蛋白——細(xì)胞結(jié)構(gòu)解體——細(xì)胞凋亡第五十九頁，共七十五頁。細(xì)胞凋亡機(jī)制〔動(dòng)畫〕第六十頁，共七十五頁。

3、細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)〔1〕細(xì)胞皺縮〔2〕染色質(zhì)邊集〔3〕凋亡小體出現(xiàn)第六十一頁，共七十五頁。

細(xì)胞凋亡第六十二頁，共七十五頁。

二、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法1、形態(tài)觀察法：凋亡的細(xì)胞皺縮，質(zhì)膜完整，胞漿致密，細(xì)胞器密集，不同程度退變；核染色質(zhì)致密，形成形狀不一，大小不等的團(tuán)塊邊集于核膜處，進(jìn)而胞核裂解；胞漿發(fā)生芽突。胞漿芽突脫落后，形成許多凋亡小體。2、生化檢測(cè)法：①胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高。

②細(xì)胞內(nèi)活性氧增多。

③質(zhì)膜通透性增高。

④DNA內(nèi)切酶被激活，雙鏈DNA在核小體之間切斷形成180~200bp的特征性的有序片段。

⑤Ⅱ型谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶和鈣蛋白酶〔Calpain〕活性升高。3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)法第六十三頁，共七十五頁。1、形態(tài)觀察法〔1〕普通光鏡檢測(cè)HE染色甲基綠-派諾寧染色：細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞主動(dòng)死亡過程，需要有細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的激活，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)常有mRNA表達(dá)的增強(qiáng)。而細(xì)胞壞死是一種被動(dòng)的細(xì)胞死亡過程，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)常有RNA的損失。根據(jù)這一特點(diǎn)，可應(yīng)用試劑甲基綠對(duì)DNA染色的特異性和派諾寧對(duì)RNA的親和性，使甲基綠對(duì)固縮細(xì)胞核內(nèi)的脫氧核糖核酸著染，如果細(xì)胞質(zhì)內(nèi)核糖核酸呈派諾寧陽性染色者為凋亡細(xì)胞，呈陰性染色者為壞死細(xì)胞。

二、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法第六十四頁，共七十五頁。甲基綠-派諾寧染色：光學(xué)顯微鏡下凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞均表現(xiàn)為細(xì)胞固縮：其中凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈綠色或綠藍(lán)色著染，胞質(zhì)呈紅紫色著染，壞死細(xì)胞只有固縮細(xì)胞，核綠色著染，而細(xì)胞質(zhì)無染色。

第六十五頁，共七十五頁?！?〕熒光顯微鏡檢測(cè)—溴化丙錠〔PI〕染色：碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。第六十六頁，共七十五頁?！?〕透射電子顯微鏡：已經(jīng)用于凋亡細(xì)胞的檢測(cè)。鏡下可見凋亡細(xì)胞體積變小、細(xì)胞質(zhì)濃縮、細(xì)胞核變小、染色質(zhì)濃縮并凝結(jié)成塊，出現(xiàn)染色質(zhì)沿核膜內(nèi)側(cè)排列的核邊集現(xiàn)象。晚期的凋亡細(xì)胞，清晰可見細(xì)胞核裂解產(chǎn)生的凋亡小體。第六十七頁，共七十五頁。2、生化檢測(cè)法〔1〕凝膠電泳法：〔2〕原位末端標(biāo)記法〔3〕二苯胺分光光度法

二、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法第六十八頁，共七十五頁?！?〕凝膠電泳法原理：凋亡細(xì)胞的突出特征是由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活而導(dǎo)致細(xì)胞核DNA的斷裂。典型的細(xì)胞凋亡，在核內(nèi)形成大量200bp大小及其倍體的核苷酸片段，而非典型的凋亡細(xì)胞，由于核內(nèi)的DNA降解不完全，僅形成300~50kb的DNA大片。利用這一特性，可通過DNA凝膠電泳來判定凋亡的發(fā)生和開展情況。

方法：提取總DNADNA凝膠電泳觀察DNAladder現(xiàn)象第六十九頁，共七十五頁。凝膠電泳特點(diǎn)

(1)本方法不能檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞水平的凋亡。

(2)不能提供細(xì)胞發(fā)生凋亡所處的組織位置和細(xì)胞分化狀態(tài)。第七十頁，共七十五頁?！?〕原位末端標(biāo)記法〔TUNEL〕原理：利用標(biāo)記的dUTP，在TdT作用下結(jié)合DNA斷片的3’末端羥基，顯示斷鏈DNA，提示凋亡方法：制備組織切片標(biāo)記物結(jié)合標(biāo)記物顯色鏡檢第七十一頁，共七十五頁。TUNEL染色：細(xì)胞核固縮有的呈碎片狀，不規(guī)那么，大小不一致，呈棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。即凋亡的細(xì)胞第七十二頁，共七十五頁?！?〕二苯胺分光光度法原理：細(xì)胞凋亡可產(chǎn)生低分子量DNA，通過超速離心可與細(xì)胞核的高分子量DNA別離，分別測(cè)定兩種DNA，即可得出凋亡百分率。方法：裂解細(xì)胞13000g超速離心分別提取DNA使DNA顯色，測(cè)定第七十三頁，共七十五頁。凋亡百分率=上清液OD值上清液OD值+沉淀OD值第七十四頁，共七十五頁。內(nèi)容總結(jié)一、免疫細(xì)胞的特征。2、黏附別離法-純淋巴細(xì)胞群的別離。2、黏附別離法：淋巴細(xì)胞亞群的別離。主要組成成分為MACS微珠、MACS分選柱和MACS分選器。意外事故性細(xì)胞死亡，被動(dòng)進(jìn)行（他殺性）。上清液OD值。上清液OD值+沉淀OD值第七十五頁，共七十五頁。持續(xù)性肢皮炎編輯整理概述持續(xù)性肢皮炎(acrodermatitiscontinua)又稱為肢端稽留性皮炎(acrodermatitisperstans)或稱為匐行性皮炎(dermatitisrepens)是手足部位一種慢性炎癥性、復(fù)發(fā)性、無菌性膿皰性皮膚病，常在外傷后發(fā)病，病因不明。

病因病因不明，有作者認(rèn)為本病屬膿皰性銀屑病的一型。以往認(rèn)為病因可能與下列因素相關(guān)：

1.感染學(xué)說，認(rèn)為與葡萄球菌感染有關(guān)。

2.內(nèi)分泌失調(diào)學(xué)說，本病月經(jīng)期加劇，妊娠期減輕。

3.自主神經(jīng)功能紊亂學(xué)說，有的病例有明顯的自主神經(jīng)功能紊亂，如皮膚溫度降低，放射性劇疼，電擊樣抽搐，冬眠藥治療后好轉(zhuǎn)。

4.有人認(rèn)為本病是自身免疫性疾病。發(fā)病機(jī)制發(fā)病機(jī)制還不清楚，有人認(rèn)為本病是自身免疫性疾病。臨床表現(xiàn)好發(fā)于中年人。初發(fā)于指(趾)兩側(cè)，多數(shù)在外傷后發(fā)病。第1、2指最易受累，拇指極少受累。表現(xiàn)為小膿皰或甲溝炎，單側(cè)而局限，可見表皮剝脫殘留紅色的表面，有滲液(圖1)。結(jié)痂，濕疹樣和銀屑病樣損害均可見到，患者自覺瘙癢。受累部位除手足外，黏膜特別是口腔黏膜也可波及。形成痛性環(huán)形白斑，假膜形成和皸裂。甲常受累引起甲溝炎，隨疾病進(jìn)展，甲板可營(yíng)養(yǎng)不良或脫屑。皮膚損害可導(dǎo)致皮膚萎縮及其下方軟組織的硬化，以至于整個(gè)骨組織和指頭的吸收。臨床表現(xiàn)并發(fā)癥泛發(fā)型者個(gè)別病人發(fā)生紅皮病，最后因并發(fā)癥而死亡。實(shí)驗(yàn)室檢查目前沒有相關(guān)內(nèi)容描述。其他輔助檢查組織病理：原發(fā)性損害為表皮角層下腔隙充以大量中性粒細(xì)胞。鄰近膿皰的表皮細(xì)胞間白細(xì)胞聚集形成所謂Kogoj海綿狀膿皰。真皮上部有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和灶性水腫形成。陳舊性損害見真皮乳頭萎縮和表皮變薄。診斷診斷主要依據(jù)：

1.外傷后發(fā)病。

2.反復(fù)起水皰、膿皰、糜爛，有灼熱、灼痛，輕度瘙癢。

3.一般侵犯指(趾)、手背、足背，有時(shí)可波及全身。

4.可有黏膜損害。

5.慢性病程，對(duì)治療抵抗。鑒別診斷

1.本病在早期應(yīng)與真菌和細(xì)菌感染鑒別，培養(yǎng)和涂片有助于排除感染性疾病。

2.可與掌跖膿皰病和膿皰性汗皰性濕疹鑒別。后者不發(fā)生甲萎縮和脫落，接觸性皮炎繼發(fā)感染其膿皰邊界稍模糊，缺乏持久性損害。

3.皮損泛發(fā)時(shí)應(yīng)與泛發(fā)性膿皰性銀屑病，角層下膿皰病鑒別，它們有下列共同特點(diǎn)：

(1)基本損害為無菌性淺表性基底有紅暈的炎癥性膿皰。

(2)除角層下膿皰病外均有黏膜損害(溝紋舌，地圖舌)伴發(fā)熱、畏寒等全身癥狀。鑒別診斷

(3)病理上有Kogoj海綿狀膿皰。

(4)皮損反復(fù)發(fā)作，它們彼此間有一定聯(lián)系，同一病人的不同部位可出現(xiàn)不同病的損害，病人不同時(shí)期可以有不同表現(xiàn)和彼此轉(zhuǎn)化，有報(bào)道連續(xù)性肢端皮炎、銀屑病、角層下膿皰病轉(zhuǎn)化為膿皰性銀屑病，有許多作者認(rèn)為連續(xù)性肢端皮炎與膿皰性銀屑病為同一疾病，但由于各有特殊性，處理上亦有不同，應(yīng)暫時(shí)視為獨(dú)立疾病。治療四環(huán)素小劑量長(zhǎng)期口服，每天0