兔脂肪干細(xì)胞體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)及成骨活性鑒定的實(shí)驗(yàn)研究

張開剛1張?jiān)聳|1王玫2(1.泰安市中心醫(yī)院骨科，山東泰安2710002.泰山醫(yī)學(xué)院，山東泰安271016)【摘要】目的體外分離培養(yǎng)兔脂肪干細(xì)胞，在成骨誘導(dǎo)條件下，鑒定其成骨活性。方法取4月齡新西蘭大白兔腹股溝區(qū)脂肪，I型膠原酶消化，分離、培養(yǎng)及傳代原細(xì)胞，將第3代ADSCs消化后，加入成骨培養(yǎng)液中誘導(dǎo)分化，分別行堿性磷酸酶染色、茜素紅染色、VonKossa(鈣結(jié)節(jié))染色鑒定分化結(jié)果.結(jié)果體外分離培養(yǎng)的細(xì)胞增殖活躍，成骨誘導(dǎo)后檢測(cè)堿性磷酸酶染色、茜素紅染色、VonKossa(鈣結(jié)節(jié))染色均呈陽性表達(dá)。結(jié)論脂肪干細(xì)胞具有成骨分化能力，是一種理想的骨組織工程種子細(xì)胞?！娟P(guān)鍵詞】脂肪干細(xì)胞；成骨誘導(dǎo)；種子細(xì)胞Anexperimentalstudyofosteogeniccultureinvitroandidentificatingtheosteogenicactivityofrabbitadipose-derivedstemcellsZHANGKaigang1,ZHANGYiiedong1,WangMei2(1.DepartmentofOrthopedicSuigeiyTaianCenterHospital,ShandongTaian,2710002.TaishanMedicalCollege,ShandongTaian271016)(Abstract]ObjectiveSeparatmgandCultunngrabbitadipose-derivedstemcells,identificatingtheosteogenicactivitymosteogenicconditioiis.MethodsExtractingmguinalfatofNewZealandwluterabbitsaged4months.UsingIcollagenasedigestiong,separating,culturmgandpassagmgoftheoriginalcells,addingosteogemcmediumtoinduceosteogenicdiffeientiationafterdigestingthe3rdgenerationADSCs,thenidentificatingthediffeientiationresultsbyalkalinephosphatasestaining、alizannredstaining、VbnKossa(calciumnodules)staiimig.ResultsThecellsofSeparatingandCultuimgmvitiowereactive,thealkalinephosphatasestaining>alizarmredstainingandVbnKossa(calciumnodules)stauuiigwerebothpositiveexpressionafterosteogenic.ConclusionAdiposederivedstemcellshavetheabilityofOsteogemcdiffeientiationjheyareanidealseedcellsforbonetissueengmeermg.[Keywords)Adipose-DerivedStemCells;Osteogemc;SeedCells脂肪干細(xì)胞(adipose-deiivedstemcells,ADSCs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種成體干細(xì)胞，2001年，Zuk⑴等首次從人的脂肪組織懸液中分離出了具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞類似，可以在體外穩(wěn)定增殖、具有多向分化潛能的脂肪干細(xì)胞。因具有來源豐富、取材方便、對(duì)機(jī)體的損傷小、增殖快、能多向分化等優(yōu)點(diǎn),迅速成為組織工程學(xué)、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過分離培養(yǎng)兔脂肪干細(xì)胞,研究其成骨分化能力，探討其作為骨組織工程種子細(xì)胞的可行性。材料和方法1.1材料1.1.1主要試劑和儀器I型膠原酶（sigma美國(guó)）；胰蛋白酶（sigma美國(guó)）；地塞米松（sigma美國(guó)）；維生素C（sigma美國(guó)）；日一甘油磷酸鈉（sigma美國(guó)）；高糖DMEM（Gibco美國(guó)）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；堿性磷酸酶染色試劑盒（華美生物工程公司）；四環(huán)素（華美生物工程公司）；茜素紅（Aineisco美國(guó)）;EDTAC華美生物工程公司）；恒溫CO2培養(yǎng)箱（QueueSystemsCompany美國(guó)）；病理切片機(jī)（leica德國(guó)）。1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4月齡健康新西蘭大白兔（體重2.0—2.5kg,雌雄不拘，泰山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK（魯）2005—0005）1.2方法ADSCs的分離、培養(yǎng)及傳代4月齡健康新西蘭大白兔，經(jīng)耳緣靜脈注射空氣栓塞致死，取兔雙側(cè)腹股溝脂肪，PBS液沖洗剪碎，用I型膠原酶法進(jìn)行消化，加入高糖DMEM培養(yǎng)液重懸浮，放入恒溫CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔日換液，融合達(dá)90—95%后，傾倒原培養(yǎng)液，用PBS液輕緩漂洗貼壁細(xì)胞2次，盡量洗去殘余血清，棄PBS液。在培養(yǎng)瓶中加入適量消化液（0.20%胰蛋白酶+0.02%EDTA）進(jìn)行消化，吸管吸取培養(yǎng)液，反復(fù)輕柔吹打培養(yǎng)瓶底壁，使己經(jīng)消化的細(xì)胞脫離瓶壁，吹打液120017mm離心10min,棄上清。用培養(yǎng)液將沉積的細(xì)胞重新懸浮，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，傳代比例為1：2,倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征及傳代情況。1.2.2脂肪干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液的配制:DMEM培養(yǎng)液+10%胎牛血清+0.1umol/L地塞米松+50mg/L維生素C+10mmol/LB-甘油磷酸鈉+1%雙抗PH7.2-7.4,參照Zuk⑵等文獻(xiàn)所述方法。普通培養(yǎng)液：高糖DMEM培養(yǎng)液十10%胎牛血清+1%雙抗（青霉素、鏈霉素）取第3代ADSCs,以lxl05/cm密度接種于24塊蓋玻片，置于370、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，其中12片作為成骨誘導(dǎo)組，加入成骨誘導(dǎo)液復(fù)合培養(yǎng)，行成骨誘導(dǎo)分化。12塊作為對(duì)照組，加入普通培養(yǎng)液培養(yǎng)，共4周，每72h換液1次。1.2.2.1堿性磷酸酶（ALP）染色在培養(yǎng)皿底部預(yù)置蓋玻片，接種第三代細(xì)胞，以成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)，于37°C、5%C02飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。1周后取出蓋玻片，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定15分鐘，PBS洗滌3次，滴加堿性磷酸酶染色液，蒸儒水反復(fù)沖洗3遍，晾干后，甘油明膠封片，鏡檢。1.2.2.2茜素紅染色在培養(yǎng)皿底部預(yù)置蓋玻片，接種第三代細(xì)胞，以成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)，于37°C、5%C02飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。4周后取出蓋玻片，洗滌3次，4%多聚甲醛固定15分鐘，PBS洗滌3次，加入1%茜素紅溶液（PH值為8.3,Tris—Hcl配制），37°C染色30分鐘，蒸僧水反復(fù)沖洗3遍，晾干后，甘油明膠封片，鏡檢1.2.2.3VonKossa（鈣結(jié)節(jié)）染色在培養(yǎng)皿底部預(yù)置蓋玻片，接種第三代細(xì)胞，以成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)，于37°C、5%C02飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。4周后取出蓋玻片，洗滌3次，4%多聚甲醛固定15分鐘，PBS洗滌3次，加入5%硝酸銀溶液，避光孵育30分鐘，紫外燈下染色1小時(shí)，蒸儒水沖洗3遍，加入5%硫代硫酸鈉作用5分鐘，蒸儒水沖洗3遍，1%中性紅復(fù)染5分鐘，蒸禪水反復(fù)沖洗3遍，晾干后，甘油明膠封片，鏡檢。結(jié)果ADSCs體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性原代脂肪干細(xì)胞8小時(shí)開始貼壁，24小時(shí)完成貼壁，接種后可見部分懸浮呈圓形的血細(xì)胞混雜其中，輪廓清晰，細(xì)胞呈短梭形和多角形（圖1）,5—7天融合達(dá)90-95%,約兩周內(nèi)可傳代到第三代，細(xì)胞數(shù)量可擴(kuò)增200-300倍，絕大多數(shù)細(xì)胞呈扁平的長(zhǎng)梭形，局部排列有一定方向性，呈魚群狀（圖2）。ADSCs體外成骨誘導(dǎo)及鑒定2.2.1堿性磷酸酶（ALP）染色：培養(yǎng)第3代的ADSCs細(xì)胞，成骨誘導(dǎo)1周后，行ALP染色,ALP檢測(cè)胞漿內(nèi)可見藍(lán)色顆粒（圖3）,而對(duì)照組無明顯ALP表達(dá)（圖4）。2.2.2茜素紅染色：培養(yǎng)第3代的ADSCs細(xì)胞，成骨誘導(dǎo)4周后，行茜素紅染色。細(xì)胞結(jié)節(jié)中央染色為紅色團(tuán)塊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)為紫紅色（圖5）,對(duì)照僅見紫色細(xì)胞結(jié)構(gòu)，結(jié)節(jié)中央未見紅色團(tuán)塊染色（圖6）;2.2.3VbnKossa（鈣結(jié)節(jié)）染色：培養(yǎng)第3代的ADSCs細(xì)胞，成骨誘導(dǎo)4周后，進(jìn)行VbnKossa染色。細(xì)胞集落中央?yún)^(qū)形成明顯的鈣化結(jié)節(jié)，細(xì)胞結(jié)節(jié)中央為黑色團(tuán)塊（圖7）,對(duì)照組無黑色團(tuán)塊（圖8）。討論當(dāng)前研究的骨組織工程種子細(xì)胞主要有以下兒個(gè)來源:骨膜成骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和骨外組織如成纖維細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞。干細(xì)胞是結(jié)構(gòu)和功能未特化的原始細(xì)胞，它的自我更新與分化能力強(qiáng)，己經(jīng)成為構(gòu)建組織工程骨重要的種子細(xì)胞來源，日益成為組織工程首選的種子細(xì)胞。干細(xì)胞根據(jù)來源不同，可分為胚胎干細(xì)胞（embiyonicstemcell,ESC）和成體干細(xì)胞（adultstemcell,ASOo成體干細(xì)胞存在于人體各種組織中，具有自我更新和分化成多種組織的能力，如向骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)組織的分化，正常生理情況下干細(xì)胞多處于GO期或緩慢向G1期轉(zhuǎn)化⑶。在研究領(lǐng)域，人和動(dòng)物的許多不同部位來源的成體干細(xì)胞己經(jīng)得到分離和鑒定，4-6'o其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是近年來主要的研究對(duì)象，但人體骨髓總量有限，BMSCs所占比例低，并且隨著年齡增長(zhǎng)，BMSC所占的比例逐漸下降，故獲取的干細(xì)胞數(shù)量少，因而限制了BMSCs的廣泛應(yīng)用。脂肪干細(xì)胞（ADSCs）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種成體干細(xì)胞，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞類似，可以在體外穩(wěn)定增殖、具有多向分化潛能），因其具有安全性高⑺、獲得率高等優(yōu)點(diǎn)，迅速成為目前組織工程學(xué)的研究熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道指出，脂肪干細(xì)胞的體外分離及培養(yǎng)所應(yīng)用的消化酶、消化方法并不完全相同，由于成熟脂肪基質(zhì)中含有大量I型膠原，本實(shí)驗(yàn)分離ADSCs采用I型膠原酶消化法，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，接種到培養(yǎng)瓶中，通過細(xì)胞貼壁而得到ADSCso文獻(xiàn)指出，ADSCs接種12-2411后細(xì)胞可達(dá)到完全貼壁，細(xì)胞

形態(tài)為圓形、短梭形和多角形，經(jīng)傳代培養(yǎng)后，增殖迅速，平均倍增時(shí)間為60小時(shí)，衰老緩慢，能穩(wěn)定傳代10代左右，說明脂肪干細(xì)胞的生物學(xué)特征穩(wěn)定，可為組織修復(fù)提供充足的種子細(xì)胞⑻。有研究推測(cè)，脂肪組織中含有成骨分化潛能細(xì)胞％ADSCs成骨培養(yǎng)后，細(xì)胞外基質(zhì)中出現(xiàn)成骨基因表達(dá)產(chǎn)物，如1型膠原蛋白、BMP-2、BMP受體等如），具有成骨細(xì)胞分化潛能。關(guān)于脂肪干細(xì)胞的鑒定，目前還沒有發(fā)現(xiàn)ADSCs特異性表面分子標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)通過觀察細(xì)胞的形態(tài)、繪制生長(zhǎng)曲線，得到此細(xì)胞具有穩(wěn)定、迅速的增殖能力，符合干細(xì)胞的特點(diǎn)。而且在脂肪干細(xì)胞分離、純化過程中，一些混雜細(xì)胞,如紅細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，很難一次徹底清除，但其所含數(shù)量很少，約占細(xì)胞群的5%?20%,這些細(xì)胞大部分不能貼壁生長(zhǎng)，其增殖能力有限，隨傳代培養(yǎng)，其數(shù)量逐漸減少。在傳代培養(yǎng)過程中，用消化液消化原代脂肪干細(xì)胞,關(guān)于消化程度，本實(shí)驗(yàn)選擇在倒置相差顯微鏡下觀察判斷：一般以細(xì)胞突起回縮,細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞近乎縮成圓形為度。這時(shí)應(yīng)立即吸出消化液，加入含有血清的培養(yǎng)液，終止消化，以保證消化的純度。本研究通過反復(fù)3次試驗(yàn)證實(shí)，在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)下,1周時(shí)通過ALP檢測(cè)胞漿內(nèi)可見藍(lán)色顆粒；4周時(shí)檢測(cè)茜素紅染色，細(xì)胞結(jié)節(jié)中央染色為紅色團(tuán)塊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)為紫紅色；4周時(shí)鈣結(jié)節(jié)染色，細(xì)胞集落中央?yún)^(qū)形成明顯的鈣化結(jié)節(jié)，檢測(cè)到大量鈣鹽沉積。鈣結(jié)節(jié)染色原理是將礦化基質(zhì)中硫酸鈣、碳酸鈣轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿徙y、碳酸銀，然后用日光、紫外線或強(qiáng)還原劑使其還原為黑色的金屬銀，染色陽性表明細(xì)胞己進(jìn)入基質(zhì)礦化期，而對(duì)照組培養(yǎng)的細(xì)胞無鈣化結(jié)節(jié)形成。本實(shí)驗(yàn)成功分離培養(yǎng)及傳代脂肪干細(xì)胞，經(jīng)成骨誘導(dǎo)可向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，為脂肪干細(xì)胞作為骨組織工程的種子細(xì)胞來源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為將其應(yīng)用于組織工程，實(shí)現(xiàn)多種組織損傷的修復(fù)提供了理論依據(jù)。附圖：

圖1原代ADSCs呈短梭形圖2第3代ADSCs呈扁平長(zhǎng)梭形，形成魚群狀(X100)(X100)圖3ALP檢測(cè)胞漿內(nèi)可見藍(lán)色顆粒(X200)圖4對(duì)照組無明顯ALP表達(dá)(X200)圖5細(xì)胞結(jié)節(jié)中央染色為紅色團(tuán)塊(X40)圖6對(duì)照組細(xì)胞結(jié)節(jié)中央未見紅色團(tuán)塊圖7細(xì)胞結(jié)節(jié)中央為黑色團(tuán)塊(X40)圖8對(duì)照組細(xì)胞結(jié)節(jié)中央無黑色團(tuán)塊(X40)圖1原代ADSCs呈短梭形圖2第3代ADSCs呈扁平長(zhǎng)梭形，形成魚群狀(X100)(X100)圖3ALP檢測(cè)胞漿內(nèi)可見藍(lán)色顆粒(X200)圖4對(duì)照組無明顯ALP表達(dá)(X200)圖5細(xì)胞結(jié)節(jié)中央染色為紅色團(tuán)塊(X40)圖6對(duì)照組細(xì)胞結(jié)節(jié)中央未見紅色團(tuán)塊圖7細(xì)胞結(jié)節(jié)中央為黑色團(tuán)塊(X40)圖8對(duì)照組細(xì)胞結(jié)節(jié)中央無黑色團(tuán)塊(X40)ZukPA,ZhuM,AslyianP,Humanadiposetissueisasourceofmultipotentstemcells[J].MolBiolCel,12002,13:4279?4295YaimakiE.Thepapayaimopoulou.Stemcellshaveanidentitycrisis.Haema.2001;4:158-166.MoiassoMLTomic-CamcM.Epidermalstemcells:thecradleofepidennaldetemiination^differentiationandwoundhealmg.BiolCell.2005;97:173-1