PAGE7設(shè)計(jì)作品名稱魚肉組織中孔雀石綠快速檢測(cè)方案設(shè)計(jì)一、前言隨著各個(gè)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，藥物使用不當(dāng)使水產(chǎn)品安全問(wèn)題日益突出，魚肉是人體優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來(lái)源的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，蛋白質(zhì)含量占百分之十五到二十，色氨酸含量較低，主要以不飽和脂肪為主?？兹甘G是一種帶有金屬光澤的綠色結(jié)晶體，既是燃料，也是殺菌劑，見(jiàn)光易分解，易溶于水，溶液呈藍(lán)綠色。但其顏色代謝很快，使用在魚身上，經(jīng)過(guò)數(shù)小時(shí)后顏色就會(huì)淡去成為無(wú)色，因此很難肉眼觀察?？兹甘G這種添加物主要用于魚類的?；畋ｕr，特別對(duì)魚體和魚卵的水霉病有特效，現(xiàn)市場(chǎng)暫無(wú)短時(shí)間解決水霉病的特效藥，這也是孔雀石綠多年來(lái)禁而不止的一個(gè)原因，孔雀石綠一旦進(jìn)入人體，其代謝產(chǎn)物有高殘留量和致癌、致畸、致突變等毒性，我國(guó)于2002年5月將孔雀石綠列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其他化合物清單》，并于2005年制定了孔雀石綠的使用標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定水產(chǎn)品中的MG(孔雀石綠）和LMG（無(wú)色孔雀石綠）的殘留總限量不得超過(guò)1μg/kg。因此引起我國(guó)對(duì)水產(chǎn)藥物殘留和非法添加物問(wèn)題的高度重視，對(duì)水產(chǎn)品中孔雀石綠規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)越來(lái)越嚴(yán)格。目前孔雀石綠的檢測(cè)方法主要有兩大塊：理化檢驗(yàn)法（薄層層析法、分光光度法、高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等）和免疫學(xué)檢疫法，理化檢驗(yàn)方法雖然更客觀、精準(zhǔn)，但費(fèi)時(shí)費(fèi)錢、對(duì)操作人員的技術(shù)要求較高。免疫學(xué)方法中的膠體金免疫層析技術(shù)具備成本低、時(shí)效性高、操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，被公認(rèn)是目前最具有應(yīng)用價(jià)值的分析技術(shù)之一，并得到廣泛運(yùn)用。二、設(shè)計(jì)依據(jù)膠體金免疫層析法試劑盒有很多，選擇的北京勤邦生物技術(shù)有限公司的孔雀石綠試劑盒有以下的特點(diǎn)。⑴時(shí)效性高：整個(gè)實(shí)驗(yàn)一個(gè)小時(shí)左右就可完成，試紙條只需反應(yīng)5min，即可得到結(jié)果；⑵操作簡(jiǎn)單：不依賴特殊儀器，前處理無(wú)需過(guò)柱，非專業(yè)人員也可操作，只需觀察顏色反應(yīng)即可得到結(jié)果；⑶靈敏度和特異性好：MG（孔雀石綠）檢測(cè)限為0.5μg/kg(ppb)。受外界影響少，高度特異的抗原抗體反應(yīng)保證檢測(cè)結(jié)果保持很高的特異性和靈敏度；⑷成本低，安全：膠體金本身化學(xué)性穩(wěn)定，需要的儀器設(shè)備要求不高，所需的試劑盒樣本量少，回收率高?；厥章使剑篫=(X-M)/Y*100%Z—回收率（%）；X—樣品中的殘留量（mg/mL）；M—空白樣品殘留量測(cè)定值（mg/mL）；Y—樣品加標(biāo)量（mg/mL）。檢測(cè)原理：本試紙條應(yīng)用了競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析的原理，樣品中的孔雀石綠在流動(dòng)的過(guò)程中與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制了抗體和NC膜檢測(cè)線（T線）上的抗原-BSA偶聯(lián)物的結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測(cè)線顏色的變化;而無(wú)論樣本中是否含有待檢測(cè)物質(zhì)，質(zhì)控線（C線）都會(huì)顯色，以示檢測(cè)有效。三、設(shè)計(jì)方案（一）儀器、設(shè)備、試劑和材料1.儀器及試劑儀器：均質(zhì)器、電子天平、各種量程的微量移液器、數(shù)顯恒溫水浴鍋、可調(diào)式漩渦混勻器、離心機(jī)、孔雀石綠殘留檢測(cè)試紙條、15ml離心管、2ml離心管；試劑：微孔試劑、孔雀石綠輔料、孔雀石綠試劑A、孔雀石綠試劑B、孔雀石綠試劑C、孔雀石綠氧化劑;2.材料某公司抽檢某市場(chǎng)水產(chǎn)品（二）檢測(cè)項(xiàng)目及方法1.檢測(cè)項(xiàng)目運(yùn)用膠體金免疫層析法來(lái)檢測(cè)水產(chǎn)中孔雀石綠殘留2.檢測(cè)方法（魚類孔雀石綠殘留快檢過(guò)程）樣品前處理：魚去鱗、去皮，取肌肉部分。切成0.5cm*0.5cm*0.5cm的小塊后混合，用均質(zhì)機(jī)制成糜狀。提?。孩俜Q取4.00±0.05g均質(zhì)后的組織樣本至15ml聚苯乙烯離心管中，加入一管孔雀石綠輔料，加入6ml孔雀石綠試劑A,渦動(dòng)3min至充分混勻，以不低于3000r/min室溫（20～25℃）離心5min。②取上層液4ml至15ml新聚苯乙烯離心管中，加入50μl孔雀石綠氧化劑，渦動(dòng)混勻后放置1min。③加入300μl孔雀石綠試劑B，上下混勻樣本2min,以不低于3000r/min室溫（20～25℃）離心1min（若下層液體乳化嚴(yán)重，80℃水浴2min后在進(jìn)行離心）。④除去上層有機(jī)相，準(zhǔn)確移取100μl至2ml聚苯乙烯離心管中，再加入400μl孔雀石綠試劑C充分混勻，即為待測(cè)樣本液。⑤用微量移液器吸取100μl待測(cè)樣本溶液于微孔中，緩慢抽吸且充分與微孔試劑混勻。⑥室溫（20～25℃）孵育3min后，吸取混勻液約100μl垂直滴于加樣孔（S孔）中。⑦液體流動(dòng)時(shí)開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)5min，根據(jù)結(jié)果的判定或通過(guò)膠體金分析儀讀取檢測(cè)結(jié)果，其他時(shí)間判定無(wú)效。注：實(shí)驗(yàn)時(shí)只能用紅色標(biāo)記筆標(biāo)記（因?yàn)楹谏珮?biāo)記筆含有結(jié)晶紫，會(huì)對(duì)該實(shí)驗(yàn)的魚造成污染），若待測(cè)樣本液pH不在6～8之間，需將pH調(diào)至6～8在進(jìn)行點(diǎn)樣。（3）結(jié)果的判定：陰性（－）：T線顯色強(qiáng)于C線顯色無(wú)明顯差異，表示樣本中不含有待測(cè)物或其濃度低于檢測(cè)限。陽(yáng)性（－）：T線顯色明顯弱于C線或T線不顯色，表示樣本中的待測(cè)物濃度等于或高于檢測(cè)限。無(wú)效：未出現(xiàn)C線，表明操作過(guò)程不正確或試紙條已失效。在此情況下，應(yīng)再次仔細(xì)閱讀說(shuō)明書，并用新的試紙條重新測(cè)試。3.注意事項(xiàng)（1）從原包裝中取出試劑桶和試紙袋，打開后取出所需數(shù)目的微孔試劑和試紙條，并做好標(biāo)記。請(qǐng)?jiān)?0min內(nèi)盡快使用。（2）此實(shí)驗(yàn)的試劑均為有機(jī)試劑對(duì)皮膚有傷害，請(qǐng)佩戴好口罩手套穿好實(shí)驗(yàn)服做好防護(hù)。若不慎沾到皮膚請(qǐng)立即用大量清水沖洗。（3）檢測(cè)試劑保存在2～8℃陰涼避光干燥環(huán)境中。四、方案實(shí)施（可行性驗(yàn)證）（一）實(shí)驗(yàn)過(guò)程的記錄：抽樣之前需提前準(zhǔn)備好抽樣檢測(cè)單，抽樣時(shí)記錄好抽樣的樣品的名稱、進(jìn)貨日期、進(jìn)貨數(shù)量以及抽樣的數(shù)量，還有進(jìn)貨地址、菜市場(chǎng)的檔口編號(hào)以及被檢測(cè)檔口（被抽樣單位及個(gè)人）的簽字，做好每個(gè)樣品的序號(hào)以免搞混影響結(jié)果的判定，記錄好以上信息就可以帶著樣品進(jìn)入快檢實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)完成后要把檢測(cè)項(xiàng)目和結(jié)論真實(shí)的記錄在抽樣單上，最后把抽樣日期、檢測(cè)員、抽樣單編號(hào)（某區(qū)的名稱首字母大寫+某市場(chǎng)名稱首字母大寫+檢測(cè)當(dāng)天日期）和所在市場(chǎng)填寫好；并且給市場(chǎng)負(fù)責(zé)人（超市負(fù)責(zé)人）簽字、留下負(fù)責(zé)人的聯(lián)系方式，最后清理快檢實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生，處理好廢液；接著進(jìn)行下一步的結(jié)果公示。表1食用農(nóng)產(chǎn)品快檢抽樣檢測(cè)單***市食用農(nóng)產(chǎn)品快檢抽樣檢測(cè)單抽樣日期：2020年11月23日抽樣單編號(hào)：*****20201123抽樣檢測(cè)執(zhí)行單位：***檢測(cè)公司市場(chǎng)負(fù)責(zé)人簽字：劉某所在市場(chǎng)***地址***證照號(hào)碼****經(jīng)營(yíng)者名稱***法人/負(fù)責(zé)人/聯(lián)系人劉某聯(lián)系電話***序號(hào)*樣品名稱樣品編號(hào)*抽樣數(shù)量（公斤）*進(jìn)貨數(shù)量（公斤）*進(jìn)貨日期*產(chǎn)地*檔口編號(hào)檔口簽名檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)論1草魚KFQ2020112340470.05102020.11.21某批發(fā)市場(chǎng)1號(hào)李某（11）√2鯽魚KFQ2020112340480.05102020.11.21某批發(fā)市場(chǎng)1號(hào)李某（11）√3白鰱KFQ2020112340490.05102020.11.21某批發(fā)市場(chǎng)1號(hào)李某（11）√4草魚KFQ2020112340510.05102020.1122某批發(fā)市場(chǎng)3號(hào)王某（11）√5鯽魚KFQ2020112340520.05102020.1122某批發(fā)市場(chǎng)3號(hào)王某（11）√6白鰱KFQ2020112340530.05102020.1122某批發(fā)市場(chǎng)3號(hào)王某（11）√（1）甲醛（2）有機(jī)磷和氨基甲酸酯類（3）菊酯類（4）克倫特羅（5）萊克多巴胺（6）沙丁胺醇（7）二氧化硫（8）蘇丹紅（9）吊白塊（10）氯霉素（11）(顯/隱性)孔雀石綠（14）（顯/隱性）結(jié)晶紫（15）呋喃它酮（16）呋喃西林（17）呋喃妥因（18）呋喃唑酮（19）喹諾酮類（沙星類）（20）殺菌劑（多菌靈）（21）黃曲霉毒素B1（22）毒死蜱（23）克百威（24）水胺硫磷（25）甲氰菊酯（26）有機(jī)氯類（27）6-芐基腺嘌呤（28）氟苯尼考（29）百菌清檢測(cè)員簽名：伍某日期：2020.11.23注明：1、打*號(hào)為必填項(xiàng)，如果沒(méi)有內(nèi)容，根據(jù)實(shí)際情況填“無(wú)”或者“經(jīng)營(yíng)者現(xiàn)場(chǎng)未提供相關(guān)信息”（簡(jiǎn)寫為未提供）。樣品編號(hào)方式市場(chǎng)的名稱首字母+項(xiàng)目序號(hào)+1字序列排列（系統(tǒng)生成）2、檢測(cè)項(xiàng)目標(biāo)記3、結(jié)論標(biāo)記：若所檢項(xiàng)目為未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)情況，則劃“√陰”；若發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)情況，且需通過(guò)相關(guān)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法進(jìn)行結(jié)果確認(rèn)，則劃“×陽(yáng)”。檢測(cè)項(xiàng)目或抽樣品種數(shù)量根據(jù)檢測(cè)要求及市場(chǎng)供應(yīng)特點(diǎn)和季節(jié)性做調(diào)整并上報(bào)區(qū)/市兩級(jí)。最終解釋權(quán)為***市食品藥品監(jiān)督管理局及***檢測(cè)公司共同所有。（二）實(shí)驗(yàn)結(jié)果公示完成操作（一）后需把結(jié)果記錄在公示表上，把記錄好的結(jié)果公示表貼在快檢實(shí)驗(yàn)室公示欄上，下面就是結(jié)果公示表。如果實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)陽(yáng)性，進(jìn)行復(fù)檢后還是陽(yáng)性，則需要向上級(jí)反映，報(bào)告所里和局里，并對(duì)對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行處理。表2某市場(chǎng)（超市）食用農(nóng)產(chǎn)品快檢信息***市場(chǎng)（超市）食用農(nóng)產(chǎn)品快檢信息***市場(chǎng)監(jiān)督管理局序號(hào)樣品名稱檢驗(yàn)項(xiàng)目檢驗(yàn)結(jié)果檔口信息1草魚孔雀石綠殘留陰性?陽(yáng)性□1號(hào)2鯽魚孔雀石綠殘留陰性?陽(yáng)性□1號(hào)3白鰱孔雀石綠殘留陰性?陽(yáng)性□1號(hào)4草魚孔雀石綠殘留陰性?陽(yáng)性□3號(hào)5鯽魚孔雀石綠殘留陰性?陽(yáng)性□3號(hào)6白鰱孔雀石綠殘留陰性?陽(yáng)性□3號(hào)***公司2020年11月23日五、注意事項(xiàng)1.請(qǐng)按照操作步驟進(jìn)行測(cè)試，操作時(shí)請(qǐng)勿觸摸試紙條顯色區(qū)，使用前將試紙條恢復(fù)到常溫狀態(tài)。2．檢測(cè)試劑取出后，請(qǐng)立即蓋好試劑桶蓋子。用不完的微孔，請(qǐng)立即用微孔蓋蓋住并放回試劑桶中密封保存。試劑桶用完一桶再打開另一桶，以免受潮。3.勿混用不同批次的試紙條和微孔試劑。4.本試紙條為一次產(chǎn)品，請(qǐng)勿重復(fù)使用。5.本產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果僅供參考，如需確證，請(qǐng)參照國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法。6.孔雀石綠試劑A具有易燃性、揮發(fā)性、微毒。六、設(shè)計(jì)小結(jié)膠體金免疫層析技術(shù)試劑因時(shí)效性高、操作簡(jiǎn)單、特異性好、試劑和樣品用量少、方便攜帶等特點(diǎn)，可很好的減少因操作和儀器引起的誤差，能有效滿足政府機(jī)構(gòu)對(duì)市場(chǎng)檢測(cè)需求，值得廣泛推廣運(yùn)用。通過(guò)這次畢業(yè)設(shè)計(jì)撰寫，使我明白畢業(yè)設(shè)計(jì)就是用自己已有的專業(yè)基礎(chǔ)知識(shí)，獨(dú)立的發(fā)現(xiàn)、分析、解決一個(gè)理論問(wèn)題或?qū)嶋H問(wèn)題，把知識(shí)轉(zhuǎn)化成實(shí)際訓(xùn)練。在沒(méi)做畢業(yè)設(shè)計(jì)以前只是對(duì)所學(xué)知識(shí)單純的總結(jié)，經(jīng)過(guò)這次畢業(yè)設(shè)計(jì)看到自己觀點(diǎn)上的片面。讓我明白學(xué)習(xí)是一個(gè)長(zhǎng)期積累的過(guò)程，也明白在實(shí)驗(yàn)室里任何錯(cuò)誤都會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，生活處處有問(wèn)題，有問(wèn)題就需要解決。在以后的工作、生活中要更加嚴(yán)謹(jǐn)認(rèn)真，不停止對(duì)知識(shí)的學(xué)習(xí)，努力提高自身的綜合素質(zhì)。七、參考資料[1]王蓓蓓,李爾春,衛(wèi)星華,李敏,張亞鋒.液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱色孔雀石綠殘留量[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào).202