第四章植物離體無(wú)性繁殖與脫毒技術(shù)第一節(jié)植物離體無(wú)性繁殖技術(shù)第二節(jié)植物脫病毒技術(shù)第四章植物離體無(wú)性繁殖與脫毒技術(shù)第一節(jié)植物離體無(wú)性繁1有性繁殖無(wú)性繁殖無(wú)融合生殖營(yíng)養(yǎng)繁殖繁殖方式無(wú)融合生殖：在子房和胚珠內(nèi)不經(jīng)受精作用而以種子進(jìn)行繁殖的方式。營(yíng)養(yǎng)繁殖：由植物體的根、莖、葉等營(yíng)養(yǎng)器官或某種特殊組織產(chǎn)生新植株的生殖方式。廣義上的無(wú)性繁殖。無(wú)性系：指由同一個(gè)體通過無(wú)性繁殖產(chǎn)生的一個(gè)群體，它們的遺傳背景基本一致。有性繁殖無(wú)性繁殖無(wú)融合生殖營(yíng)養(yǎng)繁殖繁殖方式無(wú)融合生殖：在子房2目前，植物脫毒離體快繁技術(shù)仍是植物細(xì)胞工程技術(shù)應(yīng)用的主流之一；是生物技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)并取得顯著效益的一個(gè)領(lǐng)域，已廣泛應(yīng)用于花卉、蔬菜、果樹、藥材和林木的種苗生產(chǎn)。目前，植物脫毒離體快繁技術(shù)仍是植物細(xì)胞工程技術(shù)應(yīng)用的主流之一3植物快繁與脫毒培養(yǎng)課件4植物快繁與脫毒培養(yǎng)課件5植物快繁與脫毒培養(yǎng)課件6植物快繁與脫毒培養(yǎng)課件7植物快繁與脫毒培養(yǎng)課件8植物快繁與脫毒培養(yǎng)課件9植物快繁與脫毒培養(yǎng)課件10植物快繁與脫毒培養(yǎng)課件11一、離體無(wú)繁殖的概念和意義離體無(wú)性繁殖：在離體培養(yǎng)條件下，將來(lái)自優(yōu)良植株的莖尖、腋芽、葉片、鱗片等各種器官、組織和細(xì)胞進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)，經(jīng)過不斷地切割繁殖，使其再生形成完整植株，在短期內(nèi)獲得大量遺傳性均一的個(gè)體的方法。又稱快速無(wú)性繁殖或微繁殖、微體繁殖。試管苗：由離體無(wú)性繁殖獲得的植株稱試管苗。植物脫毒：利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，脫除植物細(xì)胞中侵染的病毒，生產(chǎn)健康的繁殖材料。第一節(jié)植物離體無(wú)性繁殖技術(shù)一、離體無(wú)繁殖的概念和意義第一節(jié)植物離體無(wú)性繁殖技術(shù)12植物離體無(wú)性繁殖的意義起始材料少，生長(zhǎng)周期短、繁殖速度“快”，每年以數(shù)萬(wàn)倍乃至數(shù)百萬(wàn)倍的速度進(jìn)行繁殖，不受自然條件干擾，實(shí)現(xiàn)工廠化育苗；生產(chǎn)無(wú)病毒種苗，防止品種退化；體積微小、不攜帶病原菌，便于儲(chǔ)運(yùn)和種質(zhì)材料交換，減少病蟲害的傳播；能夠有效地保持優(yōu)良品種的特性，使原來(lái)難以通過無(wú)性繁殖的植株進(jìn)行無(wú)性繁殖。植物離體無(wú)性繁殖的意義起始材料少，生長(zhǎng)周期短、繁殖速度“快”13二、離體無(wú)性繁殖的類型1、腋生枝型（axillarybranching）是指利用外植體上已有的頂芽和腋芽誘導(dǎo)其發(fā)育成枝并培養(yǎng)成苗的繁殖方式。這種由芽到芽或苗的繁殖方法也被稱做為“無(wú)菌短技扦插”或“微型扦插”，其繁殖速度依植物種類不同而變化范圍較大，一般每個(gè)培養(yǎng)周期1～2月可增殖3～10倍。二、離體無(wú)性繁殖的類型1、腋生枝型（axillarybra14高等植物的每一個(gè)葉腋通常都存在著腋芽，其中每一個(gè)都能發(fā)育成為與主軸相同的枝或苗，但在自然生長(zhǎng)情況下由于頂端優(yōu)勢(shì)(terminaldominance)的存在大多數(shù)腋芽受到抑制，處于休眠狀態(tài)。

離體條件下，在外源細(xì)胞分裂素的作用下可以使頂芽和腋芽共同發(fā)育，形成多枝多芽的小灌木叢狀結(jié)構(gòu)。高等植物的每一個(gè)葉腋通常都存在著腋芽，其中每一個(gè)都能發(fā)育成為15

叢生芽增殖叢生芽增殖16單莖節(jié)增殖單莖節(jié)增殖17以頂芽和腋芽發(fā)育進(jìn)行增殖的特點(diǎn)：

利用外植體上已有的芽分生組織，促使其萌發(fā)形成枝條或芽，方法簡(jiǎn)單，能高度保持遺傳穩(wěn)定性，繁殖速度較慢。適用于絕大多數(shù)植物的繁殖，對(duì)具有特殊觀賞價(jià)值的嵌合體(chimera)園藝植物來(lái)說，也是唯一能夠保持其原有嵌合特性的繁殖途徑。以頂芽和腋芽發(fā)育進(jìn)行增殖的特點(diǎn)：182、不定芽(adventitiousbud)型

不定芽（adventitiousbud）：從頂芽和腋芽之外的任何器官和組織上通過器官發(fā)生重新形成的、無(wú)固定著生位置的芽統(tǒng)稱為不定芽。不定芽產(chǎn)生的兩種途徑2、不定芽(adventitiousbud)型不定芽（a19不定芽增殖的特點(diǎn)：直接分化途徑產(chǎn)生的不定芽：

遺傳穩(wěn)定、繁殖速度較快間接分化途徑產(chǎn)生的不定芽：容易產(chǎn)生變異

利用不定芽增殖對(duì)于繁殖園藝上的嵌合體（chimera）植物來(lái)說，容易引起嵌合體的分離。

不定芽增殖的特點(diǎn)：利用不定芽增殖對(duì)于繁殖園藝上的嵌合203、體細(xì)胞胚（somaticembryo）型特點(diǎn)：最理想的繁殖方式，增殖系數(shù)高；遺傳相對(duì)穩(wěn)定；具有雙極性結(jié)構(gòu)，可以免去生根步驟；有利于實(shí)行機(jī)械化操作。目前只有少數(shù)植物能產(chǎn)生胚狀體，再生植株有返幼特性。3、體細(xì)胞胚（somaticembryo）型特點(diǎn)：214、原球莖(protocorm)型原球莖：蘭花種子發(fā)芽過程中的一種形態(tài)學(xué)構(gòu)造。蘭科植物的種子在萌發(fā)初期并不出現(xiàn)胚根，只是胚逐漸膨大，以后種皮的一端破裂，膨大的胚呈小圓錐狀，稱作原球莖。原球莖可以萌發(fā)形成具根芽的完整小苗。

離體培養(yǎng)中，由蘭花的莖尖、側(cè)芽、花莖、葉、根等都可作為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生類似于原球莖的結(jié)構(gòu)即類原球莖（protocormlikebody，PLB），也稱原球莖。4、原球莖(protocorm)型原球莖：蘭花種子發(fā)芽過程中22繁殖特點(diǎn)：蘭科植物所特有的繁殖方式；增殖速度快；成苗率高。繁殖特點(diǎn)：23三、植物離體無(wú)性繁殖的技術(shù)invitro

invivo

無(wú)菌培養(yǎng)物的建立（stage1）增殖培養(yǎng)（stage2）試管苗生根（stage3）試管苗的移植（stage4）

Stage0：供體材料的準(zhǔn)備

1978年Murashige將商業(yè)性快速繁殖過程劃分為四個(gè)階段：三、植物離體無(wú)性繁殖的技術(shù)invitroinvivo24（一）供體材料的準(zhǔn)備：Stage0對(duì)供體植株及外植體的衛(wèi)生、生理狀態(tài)進(jìn)行改進(jìn)。可以減少外植體的污染，易于消毒，并在離體培養(yǎng)時(shí)啟動(dòng)生長(zhǎng)較好。

常采用的方法：供體植株在人工氣候箱或溫室栽培1-3月；噴灑抗生素；供體枝條預(yù)培養(yǎng)或黃化處理；修剪、嫁接、避免頂部澆水和雨后取材等。（一）供體材料的準(zhǔn)備：Stage0對(duì)供體植株及外植體的衛(wèi)生、25（二）無(wú)菌培養(yǎng)物的建立（stage1）外植體(explant)的選擇依據(jù)：供體植株的基因型：遺傳性狀是否優(yōu)良？培養(yǎng)難易？實(shí)用價(jià)值？外植體類型：取材難易？再生難易？遺傳變異？增殖類型：誘導(dǎo)的難易？繁殖速度？遺傳穩(wěn)定性？目的：獲得無(wú)菌材料，啟動(dòng)外植體的生長(zhǎng)程序：外植體的選擇、消毒、接種和培養(yǎng)（二）無(wú)菌培養(yǎng)物的建立（stage1）外植體(explant26

外植體培養(yǎng)一段時(shí)間后可形成一個(gè)或多個(gè)芽，或帶根的植株、胚狀體、愈傷組織、原球莖等，如果將這些材料進(jìn)行切割并繼續(xù)培養(yǎng)，可以進(jìn)行連續(xù)的生長(zhǎng)繁殖的話，那么可認(rèn)為已經(jīng)建立了無(wú)菌培養(yǎng)物，可以進(jìn)入離體繁殖的下一個(gè)階段。外植體培養(yǎng)一段時(shí)間后可形成一個(gè)或多個(gè)芽，或帶根的植株、27（三）增殖培養(yǎng)（stage2）一種植物增殖的快慢，通常通過增殖（或繁殖）速度或增殖倍數(shù)（或系數(shù)）來(lái)表示。增殖速度（multiplicationrate）：即經(jīng)一次增殖培養(yǎng)或在一定時(shí)間段內(nèi)由一個(gè)繁殖體所增殖獲得的總繁殖體數(shù)或苗數(shù)。目的：獲得大量的無(wú)菌芽苗、體胚、原球莖等方法：反復(fù)進(jìn)行、連續(xù)的培養(yǎng)（三）增殖培養(yǎng)（stage2）一種植物增殖的快慢，通常通過增28繁殖（或增殖）速度的計(jì)算

Y=M·Xn

Y：年繁殖總數(shù)

M：起始繁殖的無(wú)菌母株數(shù)

X：每個(gè)培養(yǎng)周期增殖的倍數(shù)

n：全年可進(jìn)行增殖培養(yǎng)的周期次數(shù)繁殖（或增殖）速度的計(jì)算Y=M·Xn29

培養(yǎng)物的增殖速度和植物種類、外植體類型、增殖方式、培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)方式等有關(guān)，不同培養(yǎng)物之間的增殖速度差異很大。一般來(lái)說對(duì)同一種植物，增殖培養(yǎng)階段的每次培養(yǎng)都是相同。增殖速度一般是穩(wěn)定的。增殖培養(yǎng)是一個(gè)重復(fù)進(jìn)行的培養(yǎng)過程。隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，培養(yǎng)物的數(shù)量成幾何數(shù)增加。培養(yǎng)物的增殖速度和植物種類、外植體類型、增殖方式、培30月增殖倍數(shù)為2時(shí)月增殖倍數(shù)為4時(shí)月增殖倍數(shù)為2時(shí)月增殖倍數(shù)為4時(shí)31（四）試管苗生根（stage3）目的：誘導(dǎo)第二階段形成的無(wú)根芽苗分化出根，最終形成具有根、莖、芽（生長(zhǎng)點(diǎn)）的完整小植株，以便移栽。壯苗培養(yǎng)生根誘導(dǎo)（四）試管苗生根（stage3）目的：誘導(dǎo)第二階段形成321、壯苗培養(yǎng)目的：使芽苗伸長(zhǎng)而健壯，有利于生根。壯苗階段不需要芽苗量的增殖，而是為了獲得足夠數(shù)量的大苗用于生根誘導(dǎo)，有時(shí)也將這一處理稱為芽苗的伸長(zhǎng)階段（elongation）。方法：降低或去除細(xì)胞分裂素，增加碳源。植物類型不同，壯苗培養(yǎng)時(shí)可以以單個(gè)的枝或叢狀的芽苗進(jìn)行。許多植物也可不需要進(jìn)行單獨(dú)的壯苗過程。1、壯苗培養(yǎng)許多植物也可不需要進(jìn)行單獨(dú)的壯苗過程。332、試管苗生根誘導(dǎo)生根方式：

（1）試管內(nèi)生根（2）試管外生根2、試管苗生根誘導(dǎo)生根方式：（1）試管內(nèi)生根（2）試管外34方法：分離單個(gè)的大苗、小芽叢、枝，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。（1）試管內(nèi)生根適用于絕大多數(shù)離體繁殖的植物生根培養(yǎng)基：一般選用無(wú)機(jī)鹽濃度較低的培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基。最常用的生長(zhǎng)素是NAA和IBA

。糖濃度要降低到1.0～1.5％。培養(yǎng)條件：加強(qiáng)光照強(qiáng)度。方法：分離單個(gè)的大苗、小芽叢、枝，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。（35（2）試管外生根方法：（1）試管內(nèi)誘導(dǎo)根原基后在移栽（2）生長(zhǎng)素處理莖基部后扦插在移栽基質(zhì)或營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中（3）直接扦插適用植物類型：一些植物生根較容易；在試管內(nèi)生根時(shí)根莖部常產(chǎn)生大量愈傷組織而影響根與莖的聯(lián)系。（2）試管外生根方法：適用植物類型：36（五）試管苗移栽和管理（stage4）1、試管苗的特點(diǎn)葉的特點(diǎn)：葉面積較小，功能不全，易失水，合作用能力低。根的特點(diǎn)：無(wú)根或生根率低，根與莖輸導(dǎo)組織不相通，根吸收功能低。

莖的特點(diǎn)：有的植物莖的輸導(dǎo)組織發(fā)育也不完善，木質(zhì)化程度低。光合作用能力：增殖階段，試管苗基本處于異養(yǎng)狀態(tài)，很少或不進(jìn)行光合作用；生根階段，異養(yǎng)兼自養(yǎng)。（五）試管苗移栽和管理（stage4）1、試管苗的特點(diǎn)372、移栽（transplantation）的一般方法試管苗馴化：試管苗的移栽過程實(shí)際上是試管苗逐步鍛煉和適應(yīng)外界環(huán)境的過程，這一過程也稱馴化（acclimatization）或煉苗。目的：使試管苗適應(yīng)試管內(nèi)到管外的變化，能順利成活并迅速生長(zhǎng)。2、移栽（transplantation）的一般方法試管苗馴38試管苗的出管移栽，要經(jīng)歷一系列由環(huán)境到生理功能及結(jié)構(gòu)上的劇烈變化過程。環(huán)境上：無(wú)菌-有菌；高濕度--低濕度；弱光--自然條件下的強(qiáng)光。組織結(jié)構(gòu)及生理功能上：葉片表面的角質(zhì)層和蠟質(zhì)層逐漸形成；氣孔的適應(yīng)能力、葉片的光合能力和根的主動(dòng)吸收能力需要逐漸發(fā)展；異養(yǎng)-完全的自養(yǎng)。因此，試管苗的移栽中，必須盡可能的創(chuàng)造最適宜于試管苗生存的環(huán)境條件，使其逐步適應(yīng)外界的環(huán)境條件，并正常生長(zhǎng)。試管苗的出管移栽，要經(jīng)歷一系列由環(huán)境到生理功能及結(jié)構(gòu)上的劇烈39移栽的一般步驟：

1）.開瓶鍛煉：放在較強(qiáng)光照條件下或溫室中，打開瓶口，鍛煉1～2周左右；

2）.試管苗就可以從培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)取出，小心的洗去根上附著的培養(yǎng)基，移栽進(jìn)合適的基質(zhì)中；

3）.精心管理，直至成活；

4）.進(jìn)一步培育成商品苗。移栽的一般步驟：401、鑒定的意義由于培養(yǎng)時(shí)，取材部位不同、器官發(fā)生途徑不同。供體材料的遺傳穩(wěn)定性不同。培養(yǎng)基中各種物質(zhì)，特別是植物激素，對(duì)植物細(xì)胞構(gòu)成化學(xué)誘變環(huán)境。那些在遺傳上可塑性強(qiáng)的種和那些易于通過不定芽再生的植物種的再生植株群體，可能會(huì)發(fā)生變異，故需要認(rèn)真進(jìn)行鑒定。（六）再生植株的鑒定1、鑒定的意義（六）再生植株的鑒定412、鑒定方法①細(xì)胞學(xué)及分子生物學(xué)鑒定：對(duì)再生株群體抽樣檢查根尖染色體數(shù)目、減數(shù)分裂期的染色體行為及分子水平變異等進(jìn)行鑒定。②形態(tài)鑒定：在田間對(duì)再生株的植物學(xué)性狀進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)變異株再作細(xì)胞學(xué)鑒定。2、鑒定方法423、鑒定的內(nèi)容：P67①商品性狀：②健康狀況：③遺傳穩(wěn)定性：④農(nóng)藝性狀：3、鑒定的內(nèi)容：P6743四、影響植物離體快速繁殖的因素（P67-68）1.外植體基因型供試植株和外植體本身的生理狀態(tài)外植體的類型、大小、部位等

2.培養(yǎng)基激素的使用多數(shù)仍符合“Skoog-Miller模式”最好是多個(gè)培養(yǎng)程序可以使用同一培養(yǎng)基3.培養(yǎng)條件溫度、光照、濕度、氣體狀況四、影響植物離體快速繁殖的因素（P67-68）1.外植體44五、離體無(wú)性繁殖過程中的技術(shù)問題（一）污染（contamination）（二）外植體的褐變(browning)（三）玻璃化(vitrification)（P69）五、離體無(wú)性繁殖過程中的技術(shù)問題（一）污染（contamin45一、病毒在植物體內(nèi)的分布、傳播和危害1、病毒在植物體內(nèi)的分布病毒(Virus)個(gè)體微小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，成熟的個(gè)體稱為病毒粒體，有球狀、桿狀、線條狀和彈狀以及分枝絲狀體，直徑或?qū)挾燃s為10-120nm，體積比細(xì)菌小得多，能通過細(xì)菌濾器。是一種嚴(yán)格寄生性的專性寄生物，又稱分子寄生物。第二節(jié)植物脫病毒技術(shù)一、病毒在植物體內(nèi)的分布、傳播和危害1、病毒在植物體內(nèi)的分布46病毒在植株體內(nèi)的擴(kuò)散：①短距離移動(dòng)：通過胞間連絲在植物細(xì)胞間移動(dòng)，其擴(kuò)散的速度很慢。如煙草普通花葉病毒運(yùn)轉(zhuǎn)速度為6-13um/小時(shí)；②長(zhǎng)距離移動(dòng)：通過維管束輸導(dǎo)組織系統(tǒng)移動(dòng)，其擴(kuò)散速度很快。如：水稻條紋葉枯病毒運(yùn)轉(zhuǎn)速度為25cm/小時(shí)。

病毒粒子侵入植物，一旦進(jìn)入韌皮部，通過維管束輸導(dǎo)組織與營(yíng)養(yǎng)主流一致進(jìn)行雙向移動(dòng)，會(huì)在植物體內(nèi)速度擴(kuò)散。病毒在植株體內(nèi)的擴(kuò)散：病毒粒子侵入植物，一旦進(jìn)入47病毒在植物體內(nèi)的分布

早在1934年，White發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒在煙草根中的分布是不均勻的，越靠根尖（roottip）區(qū)病毒含量越低，在根尖的頂端不含病毒。

病毒在植物體內(nèi)呈不均勻分布，幼嫩的組織中含病毒較少，越靠近生長(zhǎng)點(diǎn)的部位，病毒含量越低，生長(zhǎng)點(diǎn)（約0.1～1.0mm區(qū)域）則幾乎不含或含病毒很少。

這也是利用莖尖培養(yǎng)去病毒的理論依據(jù)。病毒在植物體內(nèi)的分布早在1934年，White發(fā)現(xiàn)煙48傳導(dǎo)抑制：在分生組織中，維管組織還不健全，胞間連絲也不發(fā)達(dá)，從而抑制了病毒的傳導(dǎo)。能量競(jìng)爭(zhēng)：分生組織的細(xì)胞不斷進(jìn)行活躍的分裂，需要消耗大量的能量，代謝旺盛，抑制了病毒核酸的復(fù)制。激素抑制：在分生組織中，內(nèi)源激素水平較高，因而阻滯了病毒的侵入或者抑制病毒的合成。

對(duì)于植物莖尖和根尖分生組織中病毒含量低的原因，主要有以下幾種解釋：傳導(dǎo)抑制：在分生組織中，維管組織還不健全，胞間連絲也不發(fā)達(dá)，492、病毒的傳播和危害（1）病毒的傳播傳播（transmission)是指病毒在植物群體中的轉(zhuǎn)移。病毒通過在田間寄主植株間的傳播不斷蔓延，造成病毒病的流行。2、病毒的傳播和危害（1）病毒的傳播50①介體傳播：病毒依附在其他生物體（昆蟲、螨、線蟲、真菌、菟絲子等）上，借其他生物體的活動(dòng)而進(jìn)行的傳播。病毒在植物個(gè)體間的傳播可分為兩類：②非介體傳播：機(jī)械傳播（或汁液摩擦傳播）、無(wú)性繁殖材科和嫁接傳播等。①介體傳播：病毒依附在其他生物體（昆蟲、螨、線蟲、真菌、菟51植物一旦染毒，終生帶毒，難用藥劑控制；受侵染的植株多表現(xiàn)為系統(tǒng)發(fā)??；導(dǎo)致良種的種性退化；通過嫁接或蟲媒傳播，隨著無(wú)性繁殖系數(shù)增大而傳播加快；嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量與產(chǎn)品質(zhì)量（尤其是一些潛隱性病毒危害更大）。（2）病毒對(duì)植物的危害植物一旦染毒，終生帶毒，難用藥劑控制；（2）病毒對(duì)植物的危害52病毒侵染后植物的癥狀外部癥狀：植株矮小，葉片變小，葉片數(shù)目減少，果實(shí)和種子變小；花葉和葉片皺縮。組織、器官或整個(gè)植物壞死，或發(fā)育不良，出現(xiàn)畸型。細(xì)胞學(xué)變化：小液泡出現(xiàn)，細(xì)胞器退化，葉綠體、線粒體聚集，細(xì)胞壁加厚、細(xì)胞壁之間出現(xiàn)沉淀物，形成內(nèi)含體。病毒侵染后植物的癥狀外部癥狀：植株矮小，葉片變小，葉片數(shù)目減53

目前已命名的植物病毒達(dá)一千多種，引起蔬菜、糧食、果樹、花卉等作物的病毒病，其危害僅次于真菌病害，處于第二位。植物病毒分布廣泛，幾乎所有植物都會(huì)受到一種或幾種病毒的侵染。特別是一些通過無(wú)性繁殖的植物，病毒的危害更是嚴(yán)重。病毒的危害給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)重大的損失。目前已命名的植物病毒達(dá)一千多種，引起蔬菜、糧食、果樹、花卉54小麥黃矮病香蕉束頂病毒環(huán)斑病毒病病薯小麥黃矮病香蕉束頂病毒環(huán)斑病毒病病薯55植物快繁與脫毒培養(yǎng)課件56郁金香碎色病毒郁金香碎色病毒57植物脫病毒的意義能夠有效地保持優(yōu)良品種的特性；生產(chǎn)無(wú)病毒種苗，防止品種退化；快速繁殖新品種，使優(yōu)良品種迅速應(yīng)用；節(jié)約耕地，提高農(nóng)產(chǎn)品的商品率。植物脫病毒的意義能夠有效地保持優(yōu)良品種的特性；58二、脫除植物病毒的方法及原理

脫毒：用人為的方法將植物體內(nèi)的病毒去掉的一種方法。無(wú)病毒苗：指的不帶特定某種或幾種病毒的植株。物理方法：X射線、紫外線、超短波、高溫?zé)崽幚淼?。鈍化病毒，從而達(dá)到抑制病毒蔓延的目的?；瘜W(xué)方法：采用化學(xué)抑制劑，干擾病毒在植物體內(nèi)的復(fù)制。生物學(xué)方法：選用抗病毒品種、采用種子繁殖或莖尖培養(yǎng)等方法。二、脫除植物病毒的方法及原理脫毒：用人為的方法將植物體內(nèi)的59物理方法化學(xué)方法生物學(xué)方法射線、超短波熱處理

低溫處理孔雀綠、硫尿嘧碇、8－氮鳥嘌呤抗病毒品種種子繁殖愈傷組織培養(yǎng)脫毒微型嫁接脫毒珠心組織脫毒莖尖分生組織培養(yǎng)

二、脫除植物病毒的方法及原理脫除植物病毒的方法物理方法化學(xué)方法生物學(xué)方法射線、超短波孔雀綠、硫尿嘧碇、8601、熱處理（heattreatment）原理：又稱溫?zé)岑煼?thermotherapy)，是依據(jù)病毒和寄主細(xì)胞對(duì)高溫忍耐性不同，利用這個(gè)差異，選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)奶幚頊囟群蜁r(shí)間，使植物組織中的很多病毒可被部分或完全鈍化或失活（不能殺死病毒），使病毒在植物體內(nèi)增殖減緩或停止，而失去侵染能力，而寄主仍然存活，從而達(dá)到治療的目的。方法：熱水處理、

熱空氣處理1、熱處理（heattreatment）原理：又稱溫?zé)岑煼?1植物快繁與脫毒培養(yǎng)課件62熱水處理：將要脫毒的植物材料浸入50℃左右的溫水中數(shù)分鐘或數(shù)小時(shí)。適用于休眠器官或較老的接穗、插條熱空氣處理：將植株高溫生長(zhǎng)室或生長(zhǎng)箱中（35～40℃）處理幾十分鐘到幾個(gè)月不等。注意逐漸升溫，保持環(huán)境中85～95％的相對(duì)濕度。有時(shí)采用高低溫交替處理。適用于生長(zhǎng)期的較幼嫩的材料。熱水處理：將要脫毒的植物材料浸入50℃左右的溫水中數(shù)分鐘或數(shù)632、低溫處理（cryogenictreatment）

低溫處理：又稱冷凍療法。如菊花植株經(jīng)5oC處理4個(gè)月，67％的植株可以脫去矮化病毒（CSV），22％的可脫去褪綠斑駁病毒（CCMV）；處理7.5個(gè)月，脫毒率可達(dá)73％和49％。超低溫處理：是超低溫保存和莖尖離體培養(yǎng)相結(jié)合的一種植物脫毒方法。由于含有病毒的頂端細(xì)胞的液泡較大，含水分較多,在超低溫保存過程中，易被形成的冰晶破壞致死，而含水分少、胞質(zhì)濃的分生組織抗凍性強(qiáng)，不宜被凍死，這樣經(jīng)超低溫處理后再生形成的植株可能是無(wú)病毒的。2、低溫處理（cryogenictreatment）低溫643、化學(xué)方法原理：孔雀綠、8-氮鳥嘌呤、2-硫脲嘧啶等化學(xué)物質(zhì)能夠抑制病毒的復(fù)制。方法：添加于培養(yǎng)基中，對(duì)需脫毒的材料進(jìn)行培養(yǎng)，多用于細(xì)胞、原生質(zhì)體培養(yǎng)脫毒。3、化學(xué)方法原理：孔雀綠、8-氮鳥嘌呤、2-硫脲嘧啶等化學(xué)654、愈傷組織培養(yǎng)脫毒

從感病毒的植物組織誘導(dǎo)形成的愈傷組織再分化出的植株中，有很大一部分無(wú)病毒，且隨愈傷組織繼代培養(yǎng)時(shí)間和周期的增多，獲得的無(wú)病毒苗比率提高。原因：細(xì)胞發(fā)生突變或愈傷組織細(xì)胞分裂迅速4、愈傷組織培養(yǎng)脫毒665、微型嫁接（micrografting）脫毒

把極小的（<0.2mm）莖尖作為接穗嫁接到由試管中培養(yǎng)出來(lái)的無(wú)菌實(shí)生苗砧木上，繼續(xù)培養(yǎng)形成完整的嫁接苗。5、微型嫁接（micrografting）脫毒把極676、珠心胚培養(yǎng)

柑橘屬植物可以通過珠心胚培養(yǎng)獲得無(wú)病毒植株。因?yàn)橹樾慕M織與植株的維管組織沒有直接聯(lián)系，可以認(rèn)為是無(wú)毒或少毒的。珠心胚來(lái)源于母體組織，本身就具有較強(qiáng)的分化能力。6、珠心胚培養(yǎng)柑橘屬植物可以通過珠心胚培養(yǎng)獲得無(wú)病毒68（1）莖尖分生組織（stem/shootapicalmeristem，apicaldome）：指莖的最幼齡葉原基上方的一部分，最大直徑0.1m，最大長(zhǎng)度約0.250mm。

在莖尖分生組織培養(yǎng)中，往往采用帶有1～2個(gè)葉原基的幼小的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)。

7、莖尖分生組織培養(yǎng)（1）莖尖分生組織（stem/shootapicalme69（2）供體植株的選擇和預(yù)處理供體植株的選擇：了解植物病毒種類及分布，確定莖尖大小，材料的典型性，外植體健康程度等。預(yù)處理：莖尖培養(yǎng)可與熱處理、化學(xué)療法相結(jié)合。（2）供體植株的選擇和預(yù)處理70（3）莖尖組織的分離

頂芽、側(cè)芽等→表面消毒→解剖鏡下無(wú)菌操作→去除幼葉、葉原基→切取含1-2個(gè)葉原基的生長(zhǎng)點(diǎn)（0.1～0.2mm）→即刻轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基。（3）莖尖組織的分離71馬鈴薯離體莖尖的大小對(duì)脫毒及成活效果的影響莖尖長(zhǎng)度（mm）葉原基數(shù)發(fā)育的小植株數(shù)去除馬鈴薯病毒的株數(shù)0.12150240.27242180.604640莖尖大小的選擇：大到足以脫去病毒，小到能成活并發(fā)育成枝。馬鈴薯離體莖尖的大小對(duì)脫毒及成活效果的影響莖尖長(zhǎng)度葉原基數(shù)發(fā)72

利用莖尖培養(yǎng)法脫除植物病毒時(shí)，最好找出莖原基所帶葉原基的數(shù)目與生長(zhǎng)點(diǎn)（莖尖）大小的相關(guān)性，確認(rèn)病毒在莖尖中的分布部位，然后確定莖尖大小就方便多了。

例：蘋果莖原基0．05－0.08mm

莖原基帶2片葉原基0．1－0.2mm

莖原基帶4片葉原基0．3－0.4mm

莖原基帶6片葉原基0．6－0.8mm利用莖尖培養(yǎng)法脫除植物病毒時(shí)，最好找出73不同病毒種類在植物莖尖中的分布部位不同馬鈴薯：卷葉病毒、Y病毒：分布于1.0－3.0mm

X病毒：分布于0．2－0．5mm

G病毒：分布于0．2－0．3mm

S病毒：0．2mm以下

取莖尖培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)不同大小莖尖，所脫除的病毒種類不同。不同病毒種類在植物莖尖中的分布部位不同74（4）莖尖分生組織的培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基有MS、White、Morel、農(nóng)事場(chǎng)、革新等配方。在莖尖培養(yǎng)中，初接種培養(yǎng)基和用于苗增殖的培養(yǎng)基往往是不同的。應(yīng)含有植物激素。莖尖越小，莖尖內(nèi)營(yíng)養(yǎng)、水分越難長(zhǎng)時(shí)間維持。因此對(duì)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)組成，滲透壓、酸堿度、激素種類及濃度要求也就越高。（4）莖尖分生組織的培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基有MS、White、Mo75培養(yǎng)方式固體培養(yǎng)法紙橋培養(yǎng)法液體振蕩培養(yǎng)法

培養(yǎng)條件：一般光下，恒溫培養(yǎng)方式固體培養(yǎng)法培養(yǎng)條件：一般光下，恒溫76

通過各種脫毒方法獲得的植株中只有一部分是無(wú)毒植株，需要進(jìn)一步檢驗(yàn)。很多病毒具有一個(gè)延遲的復(fù)蘇期，所以必須對(duì)植株進(jìn)行多次檢驗(yàn)。無(wú)病毒苗并沒有獲得對(duì)病毒的抗性，在試管外的保存和繁殖期間仍可能再次感染病毒。病毒檢測(cè)需要在無(wú)病毒苗培養(yǎng)和生產(chǎn)繁殖過程中重復(fù)多次進(jìn)行。

三、植物病毒的鑒定及無(wú)病毒苗的保存和繁殖通過各種脫毒方法獲得的植株中只有一部分是無(wú)毒植株，需要77（一）病毒的鑒定方法（P77-78）

直接鑒定法1、指示植物鑒定法2、血清學(xué)鑒定法3、電子顯微鏡檢查法4、分子檢測(cè)法（一）病毒的鑒定方法（P77-78）直接鑒定法78（二）脫毒苗的保存與繁殖1、脫毒苗的保存

脫毒苗的離體保存隔離區(qū)保存延緩生長(zhǎng)—在培養(yǎng)基中加入生長(zhǎng)延緩劑，如B9或矮壯素，以延長(zhǎng)繼代時(shí)間。低溫保存—放在4℃冰箱內(nèi)低溫保存，保存期可達(dá)1年左右。超低溫保存—-80℃以下離體保存（二）脫毒苗的保存與繁殖1、脫毒苗的保存延緩生長(zhǎng)—在培養(yǎng)792、無(wú)病毒苗的繁殖

利用無(wú)病毒種源，通過大量繁殖可以源源不斷的為生產(chǎn)上提供無(wú)病毒的優(yōu)良種苗，以提高產(chǎn)量改善品質(zhì)。離體快繁田間隔離繁殖2、無(wú)病毒苗的繁殖利用無(wú)病毒種源，通過大量繁殖80思考題1.離體快速繁殖一般可分為哪幾個(gè)階段？簡(jiǎn)述其操作的一般程序。2.快速繁殖中，培養(yǎng)物的增殖途徑有哪幾種?各有何特點(diǎn)？3.試管苗有什么特點(diǎn)？4.外植體選擇應(yīng)注意哪些問題？5.植物離體快速無(wú)性繁殖有什么特點(diǎn)？主要適用于哪些植物類型？6.防治植物病毒病有哪些方法？7.簡(jiǎn)述莖尖分生組織培養(yǎng)脫毒的一般方法。8.影響莖尖分生組織培養(yǎng)去除病毒的因素都有哪些?9.病毒檢測(cè)的方法？10.如何進(jìn)行無(wú)病毒苗的保存和繁殖？思考題1.離體快速繁殖一般可分為哪幾個(gè)階段？簡(jiǎn)述其操作的81第四章植物離體無(wú)性繁殖與脫毒技術(shù)第一節(jié)植物離體無(wú)性繁殖技術(shù)第二節(jié)植物脫病毒技術(shù)第四章植物離體無(wú)性繁殖與脫毒技術(shù)第一節(jié)植物離體無(wú)性繁82有性繁殖無(wú)性繁殖無(wú)融合生殖營(yíng)養(yǎng)繁殖繁殖方式無(wú)融合生殖：在子房和胚珠內(nèi)不經(jīng)受精作用而以種子進(jìn)行繁殖的方式。營(yíng)養(yǎng)繁殖：由植物體的根、莖、葉等營(yíng)養(yǎng)器官或某種特殊組織產(chǎn)生新植株的生殖方式。廣義上的無(wú)性繁殖。無(wú)性系：指由同一個(gè)體通過無(wú)性繁殖產(chǎn)生的一個(gè)群體，它們的遺傳背景基本一致。有性繁殖無(wú)性繁殖無(wú)融合生殖營(yíng)養(yǎng)繁殖繁殖方式無(wú)融合生殖：在子房83目前，植物脫毒離體快繁技術(shù)仍是植物細(xì)胞工程技術(shù)應(yīng)用的主流之一；是生物技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)并取得顯著效益的一個(gè)領(lǐng)域，已廣泛應(yīng)用于花卉、蔬菜、果樹、藥材和林木的種苗生產(chǎn)。目前，植物脫毒離體快繁技術(shù)仍是植物細(xì)胞工程技術(shù)應(yīng)用的主流之一84植物快繁與脫毒培養(yǎng)課件85植物快繁與脫毒培養(yǎng)課件86植物快繁與脫毒培養(yǎng)課件87植物快繁與脫毒培養(yǎng)課件88植物快繁與脫毒培養(yǎng)課件89植物快繁與脫毒培養(yǎng)課件90植物快繁與脫毒培養(yǎng)課件91植物快繁與脫毒培養(yǎng)課件92一、離體無(wú)繁殖的概念和意義離體無(wú)性繁殖：在離體培養(yǎng)條件下，將來(lái)自優(yōu)良植株的莖尖、腋芽、葉片、鱗片等各種器官、組織和細(xì)胞進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)，經(jīng)過不斷地切割繁殖，使其再生形成完整植株，在短期內(nèi)獲得大量遺傳性均一的個(gè)體的方法。又稱快速無(wú)性繁殖或微繁殖、微體繁殖。試管苗：由離體無(wú)性繁殖獲得的植株稱試管苗。植物脫毒：利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，脫除植物細(xì)胞中侵染的病毒，生產(chǎn)健康的繁殖材料。第一節(jié)植物離體無(wú)性繁殖技術(shù)一、離體無(wú)繁殖的概念和意義第一節(jié)植物離體無(wú)性繁殖技術(shù)93植物離體無(wú)性繁殖的意義起始材料少，生長(zhǎng)周期短、繁殖速度“快”，每年以數(shù)萬(wàn)倍乃至數(shù)百萬(wàn)倍的速度進(jìn)行繁殖，不受自然條件干擾，實(shí)現(xiàn)工廠化育苗；生產(chǎn)無(wú)病毒種苗，防止品種退化；體積微小、不攜帶病原菌，便于儲(chǔ)運(yùn)和種質(zhì)材料交換，減少病蟲害的傳播；能夠有效地保持優(yōu)良品種的特性，使原來(lái)難以通過無(wú)性繁殖的植株進(jìn)行無(wú)性繁殖。植物離體無(wú)性繁殖的意義起始材料少，生長(zhǎng)周期短、繁殖速度“快”94二、離體無(wú)性繁殖的類型1、腋生枝型（axillarybranching）是指利用外植體上已有的頂芽和腋芽誘導(dǎo)其發(fā)育成枝并培養(yǎng)成苗的繁殖方式。這種由芽到芽或苗的繁殖方法也被稱做為“無(wú)菌短技扦插”或“微型扦插”，其繁殖速度依植物種類不同而變化范圍較大，一般每個(gè)培養(yǎng)周期1～2月可增殖3～10倍。二、離體無(wú)性繁殖的類型1、腋生枝型（axillarybra95高等植物的每一個(gè)葉腋通常都存在著腋芽，其中每一個(gè)都能發(fā)育成為與主軸相同的枝或苗，但在自然生長(zhǎng)情況下由于頂端優(yōu)勢(shì)(terminaldominance)的存在大多數(shù)腋芽受到抑制，處于休眠狀態(tài)。

離體條件下，在外源細(xì)胞分裂素的作用下可以使頂芽和腋芽共同發(fā)育，形成多枝多芽的小灌木叢狀結(jié)構(gòu)。高等植物的每一個(gè)葉腋通常都存在著腋芽，其中每一個(gè)都能發(fā)育成為96

叢生芽增殖叢生芽增殖97單莖節(jié)增殖單莖節(jié)增殖98以頂芽和腋芽發(fā)育進(jìn)行增殖的特點(diǎn)：

利用外植體上已有的芽分生組織，促使其萌發(fā)形成枝條或芽，方法簡(jiǎn)單，能高度保持遺傳穩(wěn)定性，繁殖速度較慢。適用于絕大多數(shù)植物的繁殖，對(duì)具有特殊觀賞價(jià)值的嵌合體(chimera)園藝植物來(lái)說，也是唯一能夠保持其原有嵌合特性的繁殖途徑。以頂芽和腋芽發(fā)育進(jìn)行增殖的特點(diǎn)：992、不定芽(adventitiousbud)型

不定芽（adventitiousbud）：從頂芽和腋芽之外的任何器官和組織上通過器官發(fā)生重新形成的、無(wú)固定著生位置的芽統(tǒng)稱為不定芽。不定芽產(chǎn)生的兩種途徑2、不定芽(adventitiousbud)型不定芽（a100不定芽增殖的特點(diǎn)：直接分化途徑產(chǎn)生的不定芽：

遺傳穩(wěn)定、繁殖速度較快間接分化途徑產(chǎn)生的不定芽：容易產(chǎn)生變異

利用不定芽增殖對(duì)于繁殖園藝上的嵌合體（chimera）植物來(lái)說，容易引起嵌合體的分離。

不定芽增殖的特點(diǎn)：利用不定芽增殖對(duì)于繁殖園藝上的嵌合1013、體細(xì)胞胚（somaticembryo）型特點(diǎn)：最理想的繁殖方式，增殖系數(shù)高；遺傳相對(duì)穩(wěn)定；具有雙極性結(jié)構(gòu)，可以免去生根步驟；有利于實(shí)行機(jī)械化操作。目前只有少數(shù)植物能產(chǎn)生胚狀體，再生植株有返幼特性。3、體細(xì)胞胚（somaticembryo）型特點(diǎn)：1024、原球莖(protocorm)型原球莖：蘭花種子發(fā)芽過程中的一種形態(tài)學(xué)構(gòu)造。蘭科植物的種子在萌發(fā)初期并不出現(xiàn)胚根，只是胚逐漸膨大，以后種皮的一端破裂，膨大的胚呈小圓錐狀，稱作原球莖。原球莖可以萌發(fā)形成具根芽的完整小苗。

離體培養(yǎng)中，由蘭花的莖尖、側(cè)芽、花莖、葉、根等都可作為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生類似于原球莖的結(jié)構(gòu)即類原球莖（protocormlikebody，PLB），也稱原球莖。4、原球莖(protocorm)型原球莖：蘭花種子發(fā)芽過程中103繁殖特點(diǎn)：蘭科植物所特有的繁殖方式；增殖速度快；成苗率高。繁殖特點(diǎn)：104三、植物離體無(wú)性繁殖的技術(shù)invitro

invivo

無(wú)菌培養(yǎng)物的建立（stage1）增殖培養(yǎng)（stage2）試管苗生根（stage3）試管苗的移植（stage4）

Stage0：供體材料的準(zhǔn)備

1978年Murashige將商業(yè)性快速繁殖過程劃分為四個(gè)階段：三、植物離體無(wú)性繁殖的技術(shù)invitroinvivo105（一）供體材料的準(zhǔn)備：Stage0對(duì)供體植株及外植體的衛(wèi)生、生理狀態(tài)進(jìn)行改進(jìn)。可以減少外植體的污染，易于消毒，并在離體培養(yǎng)時(shí)啟動(dòng)生長(zhǎng)較好。

常采用的方法：供體植株在人工氣候箱或溫室栽培1-3月；噴灑抗生素；供體枝條預(yù)培養(yǎng)或黃化處理；修剪、嫁接、避免頂部澆水和雨后取材等。（一）供體材料的準(zhǔn)備：Stage0對(duì)供體植株及外植體的衛(wèi)生、106（二）無(wú)菌培養(yǎng)物的建立（stage1）外植體(explant)的選擇依據(jù)：供體植株的基因型：遺傳性狀是否優(yōu)良？培養(yǎng)難易？實(shí)用價(jià)值？外植體類型：取材難易？再生難易？遺傳變異？增殖類型：誘導(dǎo)的難易？繁殖速度？遺傳穩(wěn)定性？目的：獲得無(wú)菌材料，啟動(dòng)外植體的生長(zhǎng)程序：外植體的選擇、消毒、接種和培養(yǎng)（二）無(wú)菌培養(yǎng)物的建立（stage1）外植體(explant107

外植體培養(yǎng)一段時(shí)間后可形成一個(gè)或多個(gè)芽，或帶根的植株、胚狀體、愈傷組織、原球莖等，如果將這些材料進(jìn)行切割并繼續(xù)培養(yǎng)，可以進(jìn)行連續(xù)的生長(zhǎng)繁殖的話，那么可認(rèn)為已經(jīng)建立了無(wú)菌培養(yǎng)物，可以進(jìn)入離體繁殖的下一個(gè)階段。外植體培養(yǎng)一段時(shí)間后可形成一個(gè)或多個(gè)芽，或帶根的植株、108（三）增殖培養(yǎng)（stage2）一種植物增殖的快慢，通常通過增殖（或繁殖）速度或增殖倍數(shù)（或系數(shù)）來(lái)表示。增殖速度（multiplicationrate）：即經(jīng)一次增殖培養(yǎng)或在一定時(shí)間段內(nèi)由一個(gè)繁殖體所增殖獲得的總繁殖體數(shù)或苗數(shù)。目的：獲得大量的無(wú)菌芽苗、體胚、原球莖等方法：反復(fù)進(jìn)行、連續(xù)的培養(yǎng)（三）增殖培養(yǎng)（stage2）一種植物增殖的快慢，通常通過增109繁殖（或增殖）速度的計(jì)算

Y=M·Xn

Y：年繁殖總數(shù)

M：起始繁殖的無(wú)菌母株數(shù)

X：每個(gè)培養(yǎng)周期增殖的倍數(shù)

n：全年可進(jìn)行增殖培養(yǎng)的周期次數(shù)繁殖（或增殖）速度的計(jì)算Y=M·Xn110

培養(yǎng)物的增殖速度和植物種類、外植體類型、增殖方式、培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)方式等有關(guān)，不同培養(yǎng)物之間的增殖速度差異很大。一般來(lái)說對(duì)同一種植物，增殖培養(yǎng)階段的每次培養(yǎng)都是相同。增殖速度一般是穩(wěn)定的。增殖培養(yǎng)是一個(gè)重復(fù)進(jìn)行的培養(yǎng)過程。隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，培養(yǎng)物的數(shù)量成幾何數(shù)增加。培養(yǎng)物的增殖速度和植物種類、外植體類型、增殖方式、培111月增殖倍數(shù)為2時(shí)月增殖倍數(shù)為4時(shí)月增殖倍數(shù)為2時(shí)月增殖倍數(shù)為4時(shí)112（四）試管苗生根（stage3）目的：誘導(dǎo)第二階段形成的無(wú)根芽苗分化出根，最終形成具有根、莖、芽（生長(zhǎng)點(diǎn)）的完整小植株，以便移栽。壯苗培養(yǎng)生根誘導(dǎo)（四）試管苗生根（stage3）目的：誘導(dǎo)第二階段形成1131、壯苗培養(yǎng)目的：使芽苗伸長(zhǎng)而健壯，有利于生根。壯苗階段不需要芽苗量的增殖，而是為了獲得足夠數(shù)量的大苗用于生根誘導(dǎo)，有時(shí)也將這一處理稱為芽苗的伸長(zhǎng)階段（elongation）。方法：降低或去除細(xì)胞分裂素，增加碳源。植物類型不同，壯苗培養(yǎng)時(shí)可以以單個(gè)的枝或叢狀的芽苗進(jìn)行。許多植物也可不需要進(jìn)行單獨(dú)的壯苗過程。1、壯苗培養(yǎng)許多植物也可不需要進(jìn)行單獨(dú)的壯苗過程。1142、試管苗生根誘導(dǎo)生根方式：

（1）試管內(nèi)生根（2）試管外生根2、試管苗生根誘導(dǎo)生根方式：（1）試管內(nèi)生根（2）試管外115方法：分離單個(gè)的大苗、小芽叢、枝，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。（1）試管內(nèi)生根適用于絕大多數(shù)離體繁殖的植物生根培養(yǎng)基：一般選用無(wú)機(jī)鹽濃度較低的培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基。最常用的生長(zhǎng)素是NAA和IBA

。糖濃度要降低到1.0～1.5％。培養(yǎng)條件：加強(qiáng)光照強(qiáng)度。方法：分離單個(gè)的大苗、小芽叢、枝，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。（116（2）試管外生根方法：（1）試管內(nèi)誘導(dǎo)根原基后在移栽（2）生長(zhǎng)素處理莖基部后扦插在移栽基質(zhì)或營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中（3）直接扦插適用植物類型：一些植物生根較容易；在試管內(nèi)生根時(shí)根莖部常產(chǎn)生大量愈傷組織而影響根與莖的聯(lián)系。（2）試管外生根方法：適用植物類型：117（五）試管苗移栽和管理（stage4）1、試管苗的特點(diǎn)葉的特點(diǎn)：葉面積較小，功能不全，易失水，合作用能力低。根的特點(diǎn)：無(wú)根或生根率低，根與莖輸導(dǎo)組織不相通，根吸收功能低。

莖的特點(diǎn)：有的植物莖的輸導(dǎo)組織發(fā)育也不完善，木質(zhì)化程度低。光合作用能力：增殖階段，試管苗基本處于異養(yǎng)狀態(tài)，很少或不進(jìn)行光合作用；生根階段，異養(yǎng)兼自養(yǎng)。（五）試管苗移栽和管理（stage4）1、試管苗的特點(diǎn)1182、移栽（transplantation）的一般方法試管苗馴化：試管苗的移栽過程實(shí)際上是試管苗逐步鍛煉和適應(yīng)外界環(huán)境的過程，這一過程也稱馴化（acclimatization）或煉苗。目的：使試管苗適應(yīng)試管內(nèi)到管外的變化，能順利成活并迅速生長(zhǎng)。2、移栽（transplantation）的一般方法試管苗馴119試管苗的出管移栽，要經(jīng)歷一系列由環(huán)境到生理功能及結(jié)構(gòu)上的劇烈變化過程。環(huán)境上：無(wú)菌-有菌；高濕度--低濕度；弱光--自然條件下的強(qiáng)光。組織結(jié)構(gòu)及生理功能上：葉片表面的角質(zhì)層和蠟質(zhì)層逐漸形成；氣孔的適應(yīng)能力、葉片的光合能力和根的主動(dòng)吸收能力需要逐漸發(fā)展；異養(yǎng)-完全的自養(yǎng)。因此，試管苗的移栽中，必須盡可能的創(chuàng)造最適宜于試管苗生存的環(huán)境條件，使其逐步適應(yīng)外界的環(huán)境條件，并正常生長(zhǎng)。試管苗的出管移栽，要經(jīng)歷一系列由環(huán)境到生理功能及結(jié)構(gòu)上的劇烈120移栽的一般步驟：

1）.開瓶鍛煉：放在較強(qiáng)光照條件下或溫室中，打開瓶口，鍛煉1～2周左右；

2）.試管苗就可以從培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)取出，小心的洗去根上附著的培養(yǎng)基，移栽進(jìn)合適的基質(zhì)中；

3）.精心管理，直至成活；

4）.進(jìn)一步培育成商品苗。移栽的一般步驟：1211、鑒定的意義由于培養(yǎng)時(shí)，取材部位不同、器官發(fā)生途徑不同。供體材料的遺傳穩(wěn)定性不同。培養(yǎng)基中各種物質(zhì)，特別是植物激素，對(duì)植物細(xì)胞構(gòu)成化學(xué)誘變環(huán)境。那些在遺傳上可塑性強(qiáng)的種和那些易于通過不定芽再生的植物種的再生植株群體，可能會(huì)發(fā)生變異，故需要認(rèn)真進(jìn)行鑒定。（六）再生植株的鑒定1、鑒定的意義（六）再生植株的鑒定1222、鑒定方法①細(xì)胞學(xué)及分子生物學(xué)鑒定：對(duì)再生株群體抽樣檢查根尖染色體數(shù)目、減數(shù)分裂期的染色體行為及分子水平變異等進(jìn)行鑒定。②形態(tài)鑒定：在田間對(duì)再生株的植物學(xué)性狀進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)變異株再作細(xì)胞學(xué)鑒定。2、鑒定方法1233、鑒定的內(nèi)容：P67①商品性狀：②健康狀況：③遺傳穩(wěn)定性：④農(nóng)藝性狀：3、鑒定的內(nèi)容：P67124四、影響植物離體快速繁殖的因素（P67-68）1.外植體基因型供試植株和外植體本身的生理狀態(tài)外植體的類型、大小、部位等

2.培養(yǎng)基激素的使用多數(shù)仍符合“Skoog-Miller模式”最好是多個(gè)培養(yǎng)程序可以使用同一培養(yǎng)基3.培養(yǎng)條件溫度、光照、濕度、氣體狀況四、影響植物離體快速繁殖的因素（P67-68）1.外植體125五、離體無(wú)性繁殖過程中的技術(shù)問題（一）污染（contamination）（二）外植體的褐變(browning)（三）玻璃化(vitrification)（P69）五、離體無(wú)性繁殖過程中的技術(shù)問題（一）污染（contamin126一、病毒在植物體內(nèi)的分布、傳播和危害1、病毒在植物體內(nèi)的分布病毒(Virus)個(gè)體微小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，成熟的個(gè)體稱為病毒粒體，有球狀、桿狀、線條狀和彈狀以及分枝絲狀體，直徑或?qū)挾燃s為10-120nm，體積比細(xì)菌小得多，能通過細(xì)菌濾器。是一種嚴(yán)格寄生性的專性寄生物，又稱分子寄生物。第二節(jié)植物脫病毒技術(shù)一、病毒在植物體內(nèi)的分布、傳播和危害1、病毒在植物體內(nèi)的分布127病毒在植株體內(nèi)的擴(kuò)散：①短距離移動(dòng)：通過胞間連絲在植物細(xì)胞間移動(dòng)，其擴(kuò)散的速度很慢。如煙草普通花葉病毒運(yùn)轉(zhuǎn)速度為6-13um/小時(shí)；②長(zhǎng)距離移動(dòng)：通過維管束輸導(dǎo)組織系統(tǒng)移動(dòng)，其擴(kuò)散速度很快。如：水稻條紋葉枯病毒運(yùn)轉(zhuǎn)速度為25cm/小時(shí)。

病毒粒子侵入植物，一旦進(jìn)入韌皮部，通過維管束輸導(dǎo)組織與營(yíng)養(yǎng)主流一致進(jìn)行雙向移動(dòng)，會(huì)在植物體內(nèi)速度擴(kuò)散。病毒在植株體內(nèi)的擴(kuò)散：病毒粒子侵入植物，一旦進(jìn)入128病毒在植物體內(nèi)的分布

早在1934年，White發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒在煙草根中的分布是不均勻的，越靠根尖（roottip）區(qū)病毒含量越低，在根尖的頂端不含病毒。

病毒在植物體內(nèi)呈不均勻分布，幼嫩的組織中含病毒較少，越靠近生長(zhǎng)點(diǎn)的部位，病毒含量越低，生長(zhǎng)點(diǎn)（約0.1～1.0mm區(qū)域）則幾乎不含或含病毒很少。

這也是利用莖尖培養(yǎng)去病毒的理論依據(jù)。病毒在植物體內(nèi)的分布早在1934年，White發(fā)現(xiàn)煙129傳導(dǎo)抑制：在分生組織中，維管組織還不健全，胞間連絲也不發(fā)達(dá)，從而抑制了病毒的傳導(dǎo)。能量競(jìng)爭(zhēng)：分生組織的細(xì)胞不斷進(jìn)行活躍的分裂，需要消耗大量的能量，代謝旺盛，抑制了病毒核酸的復(fù)制。激素抑制：在分生組織中，內(nèi)源激素水平較高，因而阻滯了病毒的侵入或者抑制病毒的合成。

對(duì)于植物莖尖和根尖分生組織中病毒含量低的原因，主要有以下幾種解釋：傳導(dǎo)抑制：在分生組織中，維管組織還不健全，胞間連絲也不發(fā)達(dá)，1302、病毒的傳播和危害（1）病毒的傳播傳播（transmission)是指病毒在植物群體中的轉(zhuǎn)移。病毒通過在田間寄主植株間的傳播不斷蔓延，造成病毒病的流行。2、病毒的傳播和危害（1）病毒的傳播131①介體傳播：病毒依附在其他生物體（昆蟲、螨、線蟲、真菌、菟絲子等）上，借其他生物體的活動(dòng)而進(jìn)行的傳播。病毒在植物個(gè)體間的傳播可分為兩類：②非介體傳播：機(jī)械傳播（或汁液摩擦傳播）、無(wú)性繁殖材科和嫁接傳播等。①介體傳播：病毒依附在其他生物體（昆蟲、螨、線蟲、真菌、菟132植物一旦染毒，終生帶毒，難用藥劑控制；受侵染的植株多表現(xiàn)為系統(tǒng)發(fā)病；導(dǎo)致良種的種性退化；通過嫁接或蟲媒傳播，隨著無(wú)性繁殖系數(shù)增大而傳播加快；嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量與產(chǎn)品質(zhì)量（尤其是一些潛隱性病毒危害更大）。（2）病毒對(duì)植物的危害植物一旦染毒，終生帶毒，難用藥劑控制；（2）病毒對(duì)植物的危害133病毒侵染后植物的癥狀外部癥狀：植株矮小，葉片變小，葉片數(shù)目減少，果實(shí)和種子變小；花葉和葉片皺縮。組織、器官或整個(gè)植物壞死，或發(fā)育不良，出現(xiàn)畸型。細(xì)胞學(xué)變化：小液泡出現(xiàn)，細(xì)胞器退化，葉綠體、線粒體聚集，細(xì)胞壁加厚、細(xì)胞壁之間出現(xiàn)沉淀物，形成內(nèi)含體。病毒侵染后植物的癥狀外部癥狀：植株矮小，葉片變小，葉片數(shù)目減134

目前已命名的植物病毒達(dá)一千多種，引起蔬菜、糧食、果樹、花卉等作物的病毒病，其危害僅次于真菌病害，處于第二位。植物病毒分布廣泛，幾乎所有植物都會(huì)受到一種或幾種病毒的侵染。特別是一些通過無(wú)性繁殖的植物，病毒的危害更是嚴(yán)重。病毒的危害給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)重大的損失。目前已命名的植物病毒達(dá)一千多種，引起蔬菜、糧食、果樹、花卉135小麥黃矮病香蕉束頂病毒環(huán)斑病毒病病薯小麥黃矮病香蕉束頂病毒環(huán)斑病毒病病薯136植物快繁與脫毒培養(yǎng)課件137郁金香碎色病毒郁金香碎色病毒138植物脫病毒的意義能夠有效地保持優(yōu)良品種的特性；生產(chǎn)無(wú)病毒種苗，防止品種退化；快速繁殖新品種，使優(yōu)良品種迅速應(yīng)用；節(jié)約耕地，提高農(nóng)產(chǎn)品的商品率。植物脫病毒的意義能夠有效地保持優(yōu)良品種的特性；139二、脫除植物病毒的方法及原理

脫毒：用人為的方法將植物體內(nèi)的病毒去掉的一種方法。無(wú)病毒苗：指的不帶特定某種或幾種病毒的植株。物理方法：X射線、紫外線、超短波、高溫?zé)崽幚淼?。鈍化病毒，從而達(dá)到抑制病毒蔓延的目的。化學(xué)方法：采用化學(xué)抑制劑，干擾病毒在植物體內(nèi)的復(fù)制。生物學(xué)方法：選用抗病毒品種、采用種子繁殖或莖尖培養(yǎng)等方法。二、脫除植物病毒的方法及原理脫毒：用人為的方法將植物體內(nèi)的140物理方法化學(xué)方法生物學(xué)方法射線、超短波熱處理

低溫處理孔雀綠、硫尿嘧碇、8－氮鳥嘌呤抗病毒品種種子繁殖愈傷組織培養(yǎng)脫毒微型嫁接脫毒珠心組織脫毒莖尖分生組織培養(yǎng)

二、脫除植物病毒的方法及原理脫除植物病毒的方法物理方法化學(xué)方法生物學(xué)方法射線、超短波孔雀綠、硫尿嘧碇、81411、熱處理（heattreatment）原理：又稱溫?zé)岑煼?thermotherapy)，是依據(jù)病毒和寄主細(xì)胞對(duì)高溫忍耐性不同，利用這個(gè)差異，選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)奶幚頊囟群蜁r(shí)間，使植物組織中的很多病毒可被部分或完全鈍化或失活（不能殺死病毒），使病毒在植物體內(nèi)增殖減緩或停止，而失去侵染能力，而寄主仍然存活，從而達(dá)到治療的目的。方法：熱水處理、

熱空氣處理1、熱處理（heattreatment）原理：又稱溫?zé)岑煼?42植物快繁與脫毒培養(yǎng)課件143熱水處理：將要脫毒的植物材料浸入50℃左右的溫水中數(shù)分鐘或數(shù)小時(shí)。適用于休眠器官或較老的接穗、插條熱空氣處理：將植株高溫生長(zhǎng)室或生長(zhǎng)箱中（35～40℃）處理幾十分鐘到幾個(gè)月不等。注意逐漸升溫，保持環(huán)境中85～95％的相對(duì)濕度。有時(shí)采用高低溫交替處理。適用于生長(zhǎng)期的較幼嫩的材料。熱水處理：將要脫毒的植物材料浸入50℃左右的溫水中數(shù)分鐘或數(shù)1442、低溫處理（cryogenictreatment）

低溫處理：又稱冷凍療法。如菊花植株經(jīng)5oC處理4個(gè)月，67％的植株可以脫去矮化病毒（CSV），22％的可脫去褪綠斑駁病毒（CCMV）；處理7.5個(gè)月，脫毒率可達(dá)73％和49％。超低溫處理：是超低溫保存和莖尖離體培養(yǎng)相結(jié)合的一種植物脫毒方法。由于含有病毒的頂端細(xì)胞的液泡較大，含水分較多,在超低溫保存過程中，易被形成的冰晶破壞致死，而含水分少、胞質(zhì)濃的分生組織抗凍性強(qiáng)，不宜被凍死，這樣經(jīng)超低溫處理后再生形成的植株可能是無(wú)病毒的。2、低溫處理（cryogenictreatment）低溫1453、化學(xué)方法原理：孔雀綠、8-氮鳥嘌呤、2-硫脲嘧啶等化學(xué)物質(zhì)能夠抑制病毒的復(fù)制。方法：添加于培養(yǎng)基中，對(duì)需脫毒的材料進(jìn)行培養(yǎng)，多用于細(xì)胞、原生質(zhì)體培養(yǎng)脫毒。3、化學(xué)方法原理：孔雀綠、8-氮鳥嘌呤、2-硫脲嘧啶等化學(xué)1464、愈傷組織培養(yǎng)脫毒

從感病毒的植物組織誘導(dǎo)形成的愈傷組織再分化出的植株中，有很大一部分無(wú)病毒，且隨愈傷組織繼代培養(yǎng)時(shí)間和周期的增多，獲得的無(wú)病毒苗比率提高。原因：細(xì)胞發(fā)生突變或愈傷組織細(xì)胞分裂迅速4、愈傷組織培養(yǎng)脫毒1475、微型嫁接（micrografting）脫毒

把極小的（<0.2mm）莖尖作為接穗嫁接到由試管中培養(yǎng)出來(lái)的無(wú)菌實(shí)生苗砧木上，繼續(xù)培養(yǎng)形成完整的嫁接苗。5、微型嫁接（micrografting）脫毒把極1486、珠心胚培養(yǎng)

柑橘屬植物可以通過珠心胚培養(yǎng)獲得無(wú)病毒植株。因?yàn)橹樾慕M織與植株的維管組