基因工程基本原理及操作方法2016.7.30在傳統(tǒng)的藥品生產(chǎn)中，某些藥品如胰島素、干擾素直接從生物體的哪些結(jié)構(gòu)中提??？藥品直接從生物的組織、細(xì)胞或血液中提取。傳統(tǒng)生產(chǎn)方法的缺點由于受原料來源的限制，價格十分昂貴?？衫檬裁捶椒▉斫鉀Q上述問題？利用基因工程方法高效率地生產(chǎn)出各種高質(zhì)量、低成本的藥品?；蚬こ趟幬锂愜娡黄鸹蚬こ趟幬飪?yōu)點1、概念：基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。通俗的說，就是把A生物的特定基因提取或人工合成，加以修飾改造后轉(zhuǎn)化到B生物的細(xì)胞里，通過B生物表達(dá)A生物的蛋白。

例如，將合成的人胰島素基因轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中，通過畢赤酵母表達(dá)人胰島素蛋白。經(jīng)提純后用于糖尿病患者。

一、基因工程的概念與流程2、步驟：(1)重組質(zhì)粒構(gòu)建；(2)重組質(zhì)粒鑒定;(3)轉(zhuǎn)化表達(dá)菌；(4)篩選高表達(dá)菌種；

上游操作的基本流程可簡化為：切、接、轉(zhuǎn)、增、檢。一、基因工程的概念與流程3、整體流程：

一、基因工程的概念與流程重組質(zhì)粒構(gòu)建（酶切與連接）

二、基因工程構(gòu)建步驟4、高表達(dá)菌種的篩選(1)常規(guī)表達(dá)篩選：一般為搖床法，通過挑取不同單克隆培養(yǎng)后，取樣電泳確定表達(dá)量，缺點是效率低，優(yōu)點是比較可靠；(2)高通量篩選法：采用Elisa法，基于免疫反應(yīng)。優(yōu)點是效率高，可迅速篩選到高表達(dá)菌株，缺點是與實際表達(dá)量可能有一點偏差，需將篩選到的高表達(dá)菌種進(jìn)一步進(jìn)行搖床驗證。

二、基因工程構(gòu)建步驟2.基因的針線──DNA連接酶連接酶的作用是：將互補(bǔ)配對的兩個黏性末端連接起來（磷酸二脂鍵），使之成為一個完整的DNA分子。三、基因工程常用技術(shù)與原理3.基因的針線──基因的運(yùn)輸工具——運(yùn)載體三、基因工程常用技術(shù)與原理4.基因的獲取──全基因人工合成或PCR擴(kuò)增(1)全基因人工合成：委托外公司進(jìn)行全基因人工合成獲得目的基因序列；(2)PCR擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增3個基本條件包括模板基因序列、引物和原料（DNA聚合酶、4種堿基等原材料）三、基因工程常用技術(shù)與原理a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。其中，退火溫度比較關(guān)鍵，可能會影響特異性及效率氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈5.PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因步驟;6.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞大腸桿菌系統(tǒng)：三、基因工程常用技術(shù)與原理6.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞酵母系統(tǒng)：三、基因工程常用技術(shù)與原理(2)PCR法如果已知目的序列的長度和兩端的序列，則可以設(shè)計合成一對引物，以轉(zhuǎn)化細(xì)胞所得的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，若能得到預(yù)期長度的PCR產(chǎn)物，則該轉(zhuǎn)化細(xì)胞可能含有目的基因。(3)DNA限制性內(nèi)切酶圖譜分析用重組時的限制性內(nèi)切酶切割重組子DNA，凝膠電泳后獲得與目的基因一致的片段，即證明重組子中有插入序列。(4)免疫學(xué)法利用特定抗體與目的基因表達(dá)產(chǎn)物特異性結(jié)合作用進(jìn)行篩選。(5)核苷酸序列測定宿主細(xì)胞的基本要求宿主細(xì)胞的分類：酵母優(yōu)點：產(chǎn)物類似與天然產(chǎn)物，容易分離純化缺點：動物細(xì)胞生長緩慢，培養(yǎng)條件苛刻，費用高，培養(yǎng)液濃度較小。上游常用載體、克隆菌及表達(dá)菌類型大腸系統(tǒng)常用載體：PET-3C、30a克隆菌：Top10表達(dá)菌：BL