第十五

章DNA的

、修復(fù)和重組DNA作為遺傳物質(zhì)的特點(diǎn)（replication）表達(dá)（expression）：轉(zhuǎn)錄（transcription）翻譯（translation）中心法則（the

central

dogma）第一節(jié)DNA的代謝一、DNA代謝包括DNA修復(fù)和重組、：遺傳信息從一代細(xì)胞傳給下一代DNA細(xì)胞修復(fù)：遺傳信息傳遞的高保真性；DNA對(duì)損傷的敏感性重組：遺傳信息的重新排列、組合，遺傳的多樣性二、大腸桿菌遺傳圖——DNA代謝相關(guān)酶（蛋白）各沿染色體相對(duì)順序和位置的排列圖第二節(jié)DNA的一般規(guī)律一、DNA的半保留（semi-conservative

replication）DNA生物

時(shí)，母鏈DNA解開為兩單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對(duì)規(guī)律，

互補(bǔ)子鏈。子代DNA中，一單鏈從親代完整地接受過來，另一單鏈則完全重新合成。兩個(gè)子代DNA都和親代DNA堿基序列一致?！氡Ａ羧Ａ羰?分散式半保留式子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式DNA

方式鑒定模型的建立Matthew

Meselson

and

Franklin

Stahl

(1957)Testing

Models

for

DNA

replicationMeselson

and

Stahl

(1957)Density

labeling

experiment

on

E.

coli

(bacterial)

DNABacterial

culture15NH4ClSole

N

source)Bacterial

culturewith

dense

DNAThis

is

the

starting

material

for

the

experiment14NH4ClBacterial

culturewith

dense

DNAHarvest

some

cells“1st

generation”Harvest

some

cells“2nd

generation”etcor

each

generation

isolate

the

DNA

and

spin

through

a

density

(CsCl)

gradient).Detect

DNA

in

the

gradient

(eg

by

UV

absorption)onitor

how

many

DNA

bands

there

are

after

each

generatio14NH4ClBacterial

culture“0

generation”1957年Mathew

Meselson和FranklinStahl證明了DNA的半保留半保留

的意義子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了DNA作為遺傳物質(zhì)的保守性（conversation）。多數(shù)生物(origin)，時(shí)，開始于特定部位起始點(diǎn)/原點(diǎn)方向大多為雙向——2個(gè)

叉（：亦有單向——1個(gè)

叉（rpelication

fork）。二、DNA的起始點(diǎn)和方式John

CairnsAdd

a

highconcentration

of

3H-

thymidinen

media

with

lowconcentration

of3H-

thymidineBacterialculture*T

*T*T*T*T

*T

*T*T

*T

*T*T

*T

*T*T*T*T*T*T

*T

*T

*T*T

*T

*T

*T

*T*T

*T

*T*T

*TAll

DNA

is

lightlylabeled

with

radioactivity*T*T*TDense

label

at

the

replication

forkwhere

new

DNA

is

being

madeCairns

then

isolated

the

chromosomes

by

lysing

the

cells

very

very

gentlyand

placed

them

on

an

electron

micrograph

(EM)

grid

which

he

exposedtoE.ColiDNAθ起點(diǎn)，雙向展開，形成θ狀中一個(gè)間物，直至兩個(gè)

叉相遇——θ

。真核生物的真核生物

有多個(gè)

起始點(diǎn)（30-300kbp）。一個(gè)

起始區(qū)代表一個(gè)單位——是獨(dú)立完成子（replicon）。

子的功能單位。三、

的半不連續(xù)性semi-discontinuous

replication領(lǐng)頭鏈/前導(dǎo)鏈(leading

strand)隨從鏈/滯后鏈(lagging

strand)解鏈方向片段okazaki

fragmentDNA兩條鏈都可作模板DNA鏈

方向：

53Evidence

for

the

Semi-Discontinuous

replicatiomodel

was

provided

by

the

Okazakis

(1968)(pulse-chase

experiment)Bacteria

arereplicatingBacterialcultureHarvest

thebacteriaat

different

timesafter

the

chaseIsolate

their

DNASeparate

the

strands(using

alkaliconditions)Run

on

a

sizing

gradientsmallestlargestRadioactivity

will

onlybe

in

the

DNA

that

wasmade

during

the

pulsesmallelargesResults

ofpulse-chase

experiment5’Direction

ofunwinding3’3’Pulse3’5’Primer5’3’5’3’***5’第三節(jié)DNA

的酶學(xué)The

Enzymology

of

DNA

Replication的化學(xué)反應(yīng)(dNMP)n

+

dNTP

→(dNMP)n+1

+

PPi參與DNA

的物質(zhì)底物:

dATP,

dGTP,

dCTP,

dTTP（dNTP）聚合酶:DNApolymerase（

DNA-pol

）模板（template）:解開成單鏈的DNA母鏈引物（primer）:

互補(bǔ)于模板鏈的寡核苷酸片段，提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合其他的酶和蛋白質(zhì)因子：DNA

體（replisome）一、DNA聚合酶全稱：依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent

DNA

polymerase)發(fā)現(xiàn)：1956年，Arthur

Kornberg，大腸桿菌提取液（pol

I）活性：

1. 53

的聚合活性（模板、引物、底物、能量）2.

核酸外切酶（exonuclease）活性聚合活性A核酸外切酶活性3

5外切酶活性能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解。5

3外切酶活性能切除引物。DNA-pol

I速度慢：

核苷酸/秒連續(xù)性低：約50核苷酸缺陷株可存活活性：大于全部DNA聚合酶活性的90%DNA-pol

I

不是大腸桿菌DNA的

酶IIIIIIDNA-pol結(jié)構(gòu)主要功能參與修復(fù)酶大腸桿菌DNA聚合酶35

外切活性53

外切活性速度(核苷酸/秒)連續(xù)性亞基數(shù)Mr≥≥10830,000Pol

A

Pol

B(dna

A)有

有有

無Pol

C(dna

E)有無1103,000校讀錯(cuò)誤切除引物切口移位≥488,000小片段323個(gè)氨基酸5

核酸外切酶活性大片段/Klenow

片段

604個(gè)氨基酸

DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N

端C

端Klenow片段是

DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。β亞基的環(huán)形鉗子結(jié)構(gòu)末端俯視圖側(cè)視圖二、

中的分子解鏈（unwi

ndi

ng）及DNA

分子拓?fù)洌?/p>

topo）學(xué)變化1.

解螺旋酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白解螺旋酶(helicase,

dnaB)——利用ATP供能，作用于氫鍵，使

DNA雙鏈解開成為兩條單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白(single

strandedDNA

bindingprotein,

SSB)——在

中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整解鏈過程中正超螺旋（superhelix）的形成2.

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNAtopoisomerase)拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)既能水解、又能連接磷酸二酯鍵分類拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ作用機(jī)制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。3.

引物酶(primase)DNA聚合酶：不能從頭

新鏈，3-OH加入核苷酸。起始時(shí)催化生成RNA引物,引物酶：依賴DNA的RNA聚合酶。4.

DNA連接酶OOO

PO-HOO-OPO-ODNA連接酶DNA連接酶(DNA

ligase)的作用DNA

gyrase旋轉(zhuǎn)酶FunctionProtein

NameDNA

GyraseSSBDnaAHUPriAPriBPriCDnaBDnaCDnaTPrimaseDNAP

III

holoenzymeDNAP

ILigaseTusUnwinding

DNASingle-stranded

DNAbindingInitiation

factorHistone-like

(DNA

binding

and

bending)Primosome

assemblyPrimosome

assemblyPrimos