答辯人：?jiǎn)蝸嗛笇?dǎo)老師：高潔教授趙廷昌研究員

瓜類細(xì)菌性果斑病菌抗銅差異性檢測(cè)答辯人：?jiǎn)蝸嗛项惣?xì)菌性果斑病菌抗銅差異性檢1研究?jī)?nèi)容2.

材料與方法

1.

前言3.

5.致謝結(jié)果與分析4.結(jié)論與討論研究?jī)?nèi)容2.材21前言

瓜類細(xì)菌性果斑?。˙FB）是發(fā)生在葫蘆科植物上的一種嚴(yán)重的世界性病害，該病害為種傳病害。病原菌為西瓜嗜酸菌(Acidovoraxcitrulli，簡(jiǎn)稱Ac)，是近年來(lái)傳入國(guó)內(nèi)的檢疫性有害生物，1985年首次被鑒定為類產(chǎn)堿假單胞菌西瓜亞種，1992年被更名為西瓜細(xì)菌性果斑病菌(Acidovoraxavenae

subsp.citrulli)。菌株間存在比較豐富的遺傳多樣性，可以分為兩個(gè)亞群，亞群Ⅰ主要分離自甜瓜、南瓜等，亞群Ⅱ主要分離自西瓜等。瓜類細(xì)菌性果斑病是國(guó)內(nèi)外西瓜甜瓜上危害最為嚴(yán)重的病害之一。目前除了嚴(yán)格檢疫尚無(wú)有效防治措施。1前言瓜類細(xì)菌性果斑?。˙F31.1危害癥狀圖1：瓜類細(xì)菌性果斑病發(fā)病癥狀：西瓜子葉(A),西瓜真葉(B),西瓜果實(shí)(C),甜瓜真葉(D),甜瓜果實(shí)(E),甜瓜果肉(F)1.1危害癥狀圖1：瓜類細(xì)菌性果斑病發(fā)病癥狀：西瓜子葉(A41.2瓜類細(xì)菌性果斑病的發(fā)生情況

該病害自1998年在我國(guó)首次報(bào)道，15年的時(shí)間已經(jīng)遍布了我國(guó)許多農(nóng)業(yè)大省。該病最早于1969年由Crall和sehenckt在美國(guó)佛羅里達(dá)州發(fā)現(xiàn)，并對(duì)果斑病的癥狀進(jìn)行了描述。1985年wall和santos在關(guān)島報(bào)道了西瓜細(xì)菌性果斑病的發(fā)生，并首次將其病原菌鑒定為類產(chǎn)堿假單胞菌西瓜亞種。1992年Willems等人根據(jù)西瓜果斑病病原菌的rRNA-DNA和DNA-DNA分子雜交研究結(jié)果，將其更名為西瓜細(xì)菌性果斑病菌(Acidovoraxavenae

subsp.citrulli)。1.2瓜類細(xì)菌性果斑病的發(fā)生情況該病害自1998年在我國(guó)51.3瓜類細(xì)菌性果斑病的防治關(guān)于該病害的防治方法有加強(qiáng)檢疫、藥劑防治、種子處理、從無(wú)病區(qū)引種、生物防治、采用抗病品種等。目前應(yīng)用最廣泛的是藥劑防治，有效的藥劑是銅制劑和抗生素。5%百菌清1公斤/畝、14%絡(luò)氨銅水劑300倍液或50%甲霜銅可濕性粉劑600倍液,77%氫氧化銅可濕性微粒粉劑400倍液,用量60～75升/畝,連續(xù)3～4次。硫酸鏈霉素或72%農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑4000倍液;40萬(wàn)單位的青霉素甲鹽5000倍液。藥劑防治方面主要是銅制劑。1.3瓜類細(xì)菌性果斑病的防治關(guān)于該病害的防治方法有加強(qiáng)檢疫61.4本論文研究目的及意義

我國(guó)的西瓜、甜瓜種植面積和產(chǎn)量都位居世界前列。瓜類細(xì)菌性果斑病給我國(guó)西甜瓜生產(chǎn)造成了嚴(yán)重危害。用于田間防治果斑病的主要是含銅殺菌劑。隨著銅制劑的不斷應(yīng)用病原菌對(duì)銅制劑抗性不斷增加，而目前國(guó)內(nèi)對(duì)果斑病菌菌株之間抗銅性的差異還沒有報(bào)道，因此本試驗(yàn)對(duì)113株菌株的抗銅性進(jìn)行了研究，闡明菌株間的抗銅性差異，從而為田間合理使用含銅殺菌劑提供有力的證據(jù)。1.4本論文研究目的及意義我國(guó)的西瓜、甜瓜種植面積和產(chǎn)7菌株號(hào)采集地點(diǎn)寄主分離部位亞群分離時(shí)間No.ofstrainLocationHostOrganisolatedgroupTimeisolatedAacw1內(nèi)蒙古臨河市西瓜葉片Ⅰ2002-9-3Aacw2內(nèi)蒙古臨河市西瓜葉片Ⅰ2002-9-3Fc247Unitedstates西瓜葉片Ⅰ2002-9-3Fc520UnitedStates西瓜葉片Ⅰ2002-9-3pslb1內(nèi)蒙古臨河市甜瓜葉片Ⅰ2000-7-14pslb2內(nèi)蒙古臨河市甜瓜葉片Ⅰ2000-7-14pslb3內(nèi)蒙古臨河市甜瓜葉片Ⅰ2000-7-14pslb4內(nèi)蒙古臨河市甜瓜葉片Ⅰ2000-7-14pslb8內(nèi)蒙古臨河市甜瓜葉片Ⅰ2000-7-14pslb9內(nèi)蒙古臨河市甜瓜葉片Ⅰ2000-7-14pslb10內(nèi)蒙古臨河市甜瓜葉片Ⅰ2000-7-14pslb15內(nèi)蒙古臨河市甜瓜葉片Ⅰ2000-7-18pslb19內(nèi)蒙古臨河市八一鄉(xiāng)甜瓜葉片Ⅰ2000-7-18pslb22內(nèi)蒙古臨河市八一鄉(xiāng)甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-7-18pslb23內(nèi)蒙古臨河市八一鄉(xiāng)甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-7-182材料與方法2.1供試菌株表1113株供試瓜類細(xì)菌性果斑病菌菌株菌株號(hào)采集地點(diǎn)寄主分離部位亞群分離時(shí)間No.ofstra8pslb24內(nèi)蒙古臨河市八一鄉(xiāng)甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-7-18pslb25內(nèi)蒙古臨河市八一鄉(xiāng)甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-7-18pslb28內(nèi)蒙古臨河市八一鄉(xiāng)甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-7-18pslb29內(nèi)蒙古臨河市八一鄉(xiāng)甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-7-18pslb30內(nèi)蒙古臨河市八一鄉(xiāng)甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-7-18pslb31內(nèi)蒙古臨河市八一鄉(xiāng)甜瓜葉片Ⅰ2000-7-25pslb35內(nèi)蒙古巴盟農(nóng)業(yè)多種經(jīng)營(yíng)站甜瓜子葉Ⅰ2000-8-20pslb36內(nèi)蒙古巴盟農(nóng)業(yè)多種經(jīng)營(yíng)站甜瓜子葉Ⅰ2000-8-20pslb37新疆甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-9-9pslb38新疆甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-9-9pslb39新疆呼圖壁甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-9-14pslb40新疆呼圖壁甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-9-14pslb41新疆呼圖壁甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-9-14pslb42新疆呼圖壁甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-9-14pslb44新疆甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-9-14pslb45新疆甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-9-14pslb46新疆甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-9-14pslb47新疆甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-9-14pslb48新疆甜瓜子葉Ⅰ2000-9-14pslb49新疆甜瓜葉片Ⅰ2000-9-14pslb52新疆甜瓜葉片Ⅰ2000-9-14pslb53新疆甜瓜葉片Ⅰ2000-9-14pslb54新疆甜瓜葉片Ⅰ2000-9-14pslb60新疆甜瓜葉片Ⅰ2000-9-14pslb61新疆甜瓜葉片Ⅰ2000-9-14pslb24內(nèi)蒙古臨河市八一鄉(xiāng)甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-7-18p9pslb62新疆甜瓜葉片Ⅰ2000-9-14pslb63新疆甜瓜葉片Ⅰ2000-9-14pslb64新疆甜瓜葉片Ⅰ2000-9-14pslb65新疆甜瓜葉片Ⅰ2000-9-14pslb68新疆阿爾泰甜瓜葉片Ⅰ2001-8-26pslb69新疆阿爾泰甜瓜葉片Ⅰ2001-8-26pslb70新疆阿爾泰甜瓜葉片Ⅰ2001-8-26pslb71新疆阿爾泰甜瓜葉片Ⅰ2001-8-26pslb73新疆阿爾泰甜瓜葉片Ⅰ2001-8-26pslb74新疆阿爾泰甜瓜葉片Ⅰ2001-8-26pslb75新疆阿爾泰甜瓜葉片Ⅰ2001-8-26pslb76新疆阿爾泰甜瓜葉片Ⅰ2001-8-26pslb88內(nèi)蒙古臨河市甜瓜果實(shí)Ⅰ2004-8-13pslb89內(nèi)蒙古臨河市甜瓜果實(shí)Ⅰ2004-8-13pslb90內(nèi)蒙古臨河市甜瓜果實(shí)Ⅰ2004-8-13pslb91內(nèi)蒙古臨河市甜瓜果實(shí)Ⅰ2004-8-13pslb92內(nèi)蒙古臨河市甜瓜果實(shí)Ⅰ2004-8-13pslb93新疆五家渠甜瓜葉片Ⅰ2005-7-21pslb94新疆五家渠甜瓜莖Ⅰ2005-7-21pslb95新疆五家渠甜瓜莖Ⅰ2005-7-21pslb96海南甜瓜莖Ⅰ2005-7-21pslb97山東甜瓜果實(shí)Ⅰ2009-5-4pslb98河北樂亭甜瓜果實(shí)Ⅰ2009-5-14pslb99浙江寧波甜瓜果實(shí)Ⅰ2009-5-25pslb101海南甜瓜果實(shí)Ⅰ2009-11-12pslb62新疆甜瓜葉片Ⅰ2000-9-14pslb63新疆10pslb102新疆(222團(tuán))甜瓜葉片Ⅰ2010-7-15pslb103新疆(222團(tuán))甜瓜葉片Ⅰ2010-7-15pslbtw19海南文昌西瓜嫁接苗Ⅰ2009-12-10pslbtw20海南三亞西瓜葉片Ⅰ2010-4-6Aac5臺(tái)灣西瓜葉片Ⅱ2002-9-3Aac13臺(tái)灣西瓜葉片Ⅱ2002-9-3Aac14臺(tái)灣西瓜葉片Ⅱ2002-9-3Fc491Japan西瓜葉片Ⅱ2002-9-3pslb86新疆甜瓜葉片Ⅱ2004-7-7pslbtw2北京西瓜果實(shí)Ⅱ2005-6-13pslbtw3北京西瓜果實(shí)Ⅱ2005-6-13pslbtw5北京西瓜果實(shí)Ⅱ2005-6-30pslbtw6北京西瓜果實(shí)Ⅱ2005-6-30pslbtw7北京西瓜果實(shí)Ⅱ2005-6-30pslbtw8北京西瓜果實(shí)Ⅱ2005-6-30pslbtw9北京西瓜果實(shí)Ⅱ2005-6-30pslbtw10北京西瓜果實(shí)Ⅱ2005-6-30pslbtw11北京西瓜果實(shí)Ⅱ2005-6-30pslbtw14廣東西瓜果實(shí)Ⅱ2008-10-24pslbtw15山東西瓜葉片Ⅱ2009-5-4pslbtw16黑龍江哈爾濱西瓜葉片Ⅱ2009-11-2pslbtw22北京大興西瓜果實(shí)Ⅱ2010-6-26pslbtw23北京大興西瓜果實(shí)Ⅱ2010-6-26pslbtw24北京大興西瓜果實(shí)Ⅱ2010-6-26pslbtw25北京大興西瓜果實(shí)Ⅱ2010-6-26pslb102新疆(222團(tuán))甜瓜葉片Ⅰ2010-7-1511pslbtw26北京大興西瓜果實(shí)Ⅱ2010-6-26pslbtw27新疆打瓜果實(shí)Ⅱ2010-8-1pslbtw28新疆打瓜果實(shí)Ⅱ2010-8-1pslbtw29新疆打瓜果實(shí)Ⅱ2010-8-1pslbtw30新疆打瓜果實(shí)Ⅱ2010-8-1pslbtw31新疆打瓜果實(shí)Ⅱ2010-8-1pslbtw32黑龍江哈爾濱西瓜葉片Ⅱ2010-8-11pslbtw33黑龍江哈爾濱西瓜葉片Ⅱ2010-8-11pslbtw34黑龍江哈爾濱西瓜果實(shí)Ⅱ2010-9-1pslbtw35黑龍江哈爾濱西瓜果實(shí)Ⅱ2010-9-1pslbtw36黑龍江哈爾濱西瓜果實(shí)Ⅱ2010-9-1pslbtw37黑龍江哈爾濱西瓜果實(shí)Ⅱ2010-9-1pslbtw38黑龍江哈爾濱西瓜果實(shí)Ⅱ2010-9-1pslbtw39海南文昌西瓜子葉Ⅱ2010-11-6pslbtw40海南西瓜子葉Ⅱ2010-11-6pslbtw41北京大興西瓜子葉Ⅱ2010-12-24pslbtw42北京大興西瓜子葉Ⅱ2010-12-24pslbtw43北京大興西瓜子葉Ⅱ2010-12-24pslbtw26北京大興西瓜果實(shí)Ⅱ2010-6-26pslb122.2供試試劑和儀器

電磁爐，微波爐，高壓滅菌鍋，超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，DL-CJ-2ND醫(yī)用型），恒溫培養(yǎng)箱（DHP120，上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司），蛋白胨、瓊脂粉、磷酸氫二鉀、七水合硫酸鎂購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司，五水硫酸銅購(gòu)自天津大學(xué)科威公司。2.2供試試劑和儀器電磁爐，微波爐，高132.3試驗(yàn)方法2.3.1不同濃度硫酸銅KB培養(yǎng)基配制用移液槍吸取硫酸銅母液加入溶化的KB培養(yǎng)基中，使硫酸銅的終濃度分別為：50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml、300μg/ml、350μg/ml、400μg/ml，450μg/ml，500μg/ml，550μg/ml，600μg/ml、650μg/ml、700μg/ml、750μg/ml，混勻后倒平板備用。

2.3.2接種活化實(shí)驗(yàn)室保存的113株果斑病菌株，28℃培養(yǎng)48h后，挑取單菌落劃線接種于不同濃度的硫酸銅平板上，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，并劃線接種于不含硫酸銅的KB平板作為對(duì)照，28℃培養(yǎng)，1d后開始觀察，觀察10d。2.3試驗(yàn)方法2.3.1不同濃度硫酸銅KB培養(yǎng)基配制143結(jié)果與分析3.1供試菌株對(duì)硫酸銅抗性差異比較

所有菌株對(duì)小于300μg/ml濃度均不敏感，300μg/ml濃度時(shí)只有pslbtw43菌株表現(xiàn)敏感，在濃度達(dá)700μg/ml時(shí)所有菌株在劃線培養(yǎng)10d后均不能生長(zhǎng)，據(jù)此推斷果斑病菌株對(duì)硫酸銅的最大抗性濃度約為700μg/ml。本試驗(yàn)結(jié)果與R.R.Walcott研究不一致。3結(jié)果與分析3.1供試菌株對(duì)硫酸銅抗性差異比較15表2果斑病菌對(duì)不同濃度硫酸銅敏感度

Table2bacteriasensitivitytodifferentconcentrationsofcoppersulfate菌株號(hào)硫酸銅濃度（μg/ml）50100150200250300350400450500550600650Aacw1＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Aacw2＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Aac5＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—Aac13＋＋＋＋＋＋＋＋—Aac14＋＋＋＋＋＋＋＋—Fc247＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—Fc356＋＋＋＋＋＋＋＋＋—Fc376＋＋＋＋＋＋＋＋—Fc491＋＋＋＋＋＋＋—Fc520＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋pslb1＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb2＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋pslb3＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—表2果斑病菌對(duì)不同濃度硫酸銅敏感度

Table2bact16pslb4＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb8＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb9＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb10＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb15＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb18＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb19＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb22＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb23＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb24＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb25＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb27＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb28＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb29＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb30＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb31＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb35＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb36＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb4＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb8＋＋＋＋＋＋17pslb37＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb38＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb39＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb40＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb41＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb42＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb44＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb45＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb46＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb47＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb48＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb49＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb52＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb53＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb54＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb60＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb61＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb62＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb37＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb38＋＋＋＋18pslb63＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb64＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb65＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb68＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb69＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb70＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb71＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb73＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb74＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb75＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb76＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb86＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb88＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb89＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb90＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb91＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb92＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb93＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb63＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb64＋＋＋＋＋19pslb94＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb95＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb96＋＋＋＋＋＋＋—pslb97＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb98＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb99＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb101＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb102＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb103＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw1＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw2＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw3＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw5＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw6＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw7＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw8＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw9＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw10＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb94＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb95＋＋＋＋20pslbtw11＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw14＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw15＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw16＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw19＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw20＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw22＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw23＋＋＋＋＋＋＋＋——pslbtw24＋＋＋＋＋＋＋＋——pslbtw25＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw26＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw27＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw28＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw29＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw30＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw31＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw32＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw33＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw11＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw1421

注：“＋”表示生長(zhǎng)，“—”表示不生長(zhǎng)。pslbtw34＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw35＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw36＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw37＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw38＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw39＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw40＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw41＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw42＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw43＋＋＋＋＋—注：“＋”表示生長(zhǎng)，“—”表示不生長(zhǎng)。pslbtw34＋＋223.2Ⅰ亞群和Ⅱ亞群菌株抗銅性差異

在硫酸銅濃度為500μg/ml時(shí)Ⅱ亞群73%的菌株不能夠生長(zhǎng)，而Ⅰ亞群菌株在濃度為650μg/ml時(shí)仍有72%的菌株生長(zhǎng).即Ⅰ亞群菌株抗銅性明顯強(qiáng)于Ⅱ亞群菌株，且在試驗(yàn)過(guò)程中，Ⅰ亞群菌株的生長(zhǎng)速率明顯高于Ⅱ亞群菌株。

硫酸銅濃度（μg/ml

）圖2Ⅰ亞群和Ⅱ亞群菌株抗銅差異比較Fig2subgroupⅠandⅡcopperresistancedifference3.2Ⅰ亞群和Ⅱ亞群菌株抗銅性差異在硫酸銅濃度為233.3不同寄主菌株抗銅性差異

圖3不同寄主菌株的抗銅差異分析Fig3Differentstrainsofhostresistancetocoppervarianceanalysis3.3不同寄主菌株抗銅性差異圖3不同寄主菌株的抗銅差異244結(jié)論與討論4.1結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)比果斑病菌株Ⅰ亞群菌株和Ⅱ亞群菌株、不同寄主菌株抗銅性差異，結(jié)果表明:(1)Ⅰ亞群菌株抗銅性明顯強(qiáng)于Ⅱ亞群菌株，且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，Ⅰ亞群菌株的生長(zhǎng)速率明顯高于Ⅱ亞群菌株。(2)寄主為甜瓜的菌株比其他寄主的菌株有更高的銅抗性。而Ⅰ亞群菌株主要分離自甜瓜、南瓜等，Ⅱ亞群菌株主要分離自西瓜，兩組分析得出的結(jié)論相符。本試驗(yàn)為大田中科學(xué)合理的防治果斑病提供了理論依據(jù)，在噴藥過(guò)程中，西瓜大田中配制農(nóng)藥濃度低于甜瓜大田，從而可以有效的減緩菌株對(duì)農(nóng)藥的抗性提升。4結(jié)論與討論4.1結(jié)論254.2討論

本試驗(yàn)得出的瓜類果斑病菌對(duì)硫酸銅的敏感濃度明顯高于R.R.Walcott的研究結(jié)果。

兩試驗(yàn)方法相同且兩研究中來(lái)自共同地方的菌株硫酸銅敏感度均與各實(shí)驗(yàn)相一致，這就排除了兩試驗(yàn)結(jié)果不同的地理因素。結(jié)果不一致的可能原因是R.R.Walcott所選的菌株均分離自2000年前，而本試驗(yàn)所選的菌株均分離自2000年后，由于農(nóng)藥的使用、空氣污染等使菌株的抗性增加。本試驗(yàn)所選的113株菌株，來(lái)自我國(guó)西甜瓜產(chǎn)區(qū)的10個(gè)省市，試驗(yàn)結(jié)果可以體現(xiàn)我國(guó)果斑病菌株整體的抗銅特征，具有代表性。4.2討論本試驗(yàn)得出的瓜類果斑病菌對(duì)硫酸銅的敏感26致謝本論文是在導(dǎo)師高潔的悉心指導(dǎo)下完成的。從論文的選題、實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)到論文的撰寫修改，每個(gè)環(huán)節(jié)都凝聚著趙老師的心血。高老師忘我的工作精神、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度、高尚的人格和平易近人的作風(fēng)令我終生受益，激勵(lì)我在今后的工作崗位和人生道路上不斷前進(jìn)與發(fā)展。高老師為我的學(xué)習(xí)付出了大量的心血。衷心感謝高老師在學(xué)習(xí)和生活上對(duì)我的關(guān)懷和幫助，在此獻(xiàn)上我最崇高的敬意和最誠(chéng)摯的謝意！論文完成期間，感謝王雪老師，感謝在實(shí)習(xí)期間趙廷昌老師、師姐王鐵霖、林振亞、楊?yuàn)檴?、師兄趙文龍、劉慧琴老師在日常的學(xué)習(xí)生活中給予我點(diǎn)點(diǎn)滴滴的關(guān)心和幫助。還有在我周圍一直支持我的同學(xué)，為我們搜尋就業(yè)信息，給我們提供建議。還有團(tuán)委老師，班委們，他們?yōu)槲覀兊膶W(xué)習(xí)生活一直忙碌著。在我的學(xué)習(xí)生涯中，我成長(zhǎng)的每一步都離不開父母的辛勤培養(yǎng)和無(wú)私關(guān)愛，他們對(duì)我的鼓勵(lì)和支持是我的堅(jiān)實(shí)后盾，在此向他們獻(xiàn)上最誠(chéng)摯的敬意和感謝。值此畢業(yè)之際，衷心感謝所有關(guān)心和幫助過(guò)我的老師、同學(xué)、親人和朋友，祝福他們身體健康，工作順利！最后要感謝陪伴我四年的大學(xué)同學(xué)，不管我做什么決定都一直支持我，鼓勵(lì)我，幫助我。謝謝吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，謝謝我周圍所有的人，讓我的大學(xué)生活豐富多彩。致謝2728答辯人：?jiǎn)蝸嗛笇?dǎo)老師：高潔教授趙廷昌研究員

瓜類細(xì)菌性果斑病菌抗銅差異性檢測(cè)答辯人：?jiǎn)蝸嗛项惣?xì)菌性果斑病菌抗銅差異性檢29研究?jī)?nèi)容2.

材料與方法

1.

前言3.

5.致謝結(jié)果與分析4.結(jié)論與討論研究?jī)?nèi)容2.材301前言

瓜類細(xì)菌性果斑?。˙FB）是發(fā)生在葫蘆科植物上的一種嚴(yán)重的世界性病害，該病害為種傳病害。病原菌為西瓜嗜酸菌(Acidovoraxcitrulli，簡(jiǎn)稱Ac)，是近年來(lái)傳入國(guó)內(nèi)的檢疫性有害生物，1985年首次被鑒定為類產(chǎn)堿假單胞菌西瓜亞種，1992年被更名為西瓜細(xì)菌性果斑病菌(Acidovoraxavenae

subsp.citrulli)。菌株間存在比較豐富的遺傳多樣性，可以分為兩個(gè)亞群，亞群Ⅰ主要分離自甜瓜、南瓜等，亞群Ⅱ主要分離自西瓜等。瓜類細(xì)菌性果斑病是國(guó)內(nèi)外西瓜甜瓜上危害最為嚴(yán)重的病害之一。目前除了嚴(yán)格檢疫尚無(wú)有效防治措施。1前言瓜類細(xì)菌性果斑?。˙F311.1危害癥狀圖1：瓜類細(xì)菌性果斑病發(fā)病癥狀：西瓜子葉(A),西瓜真葉(B),西瓜果實(shí)(C),甜瓜真葉(D),甜瓜果實(shí)(E),甜瓜果肉(F)1.1危害癥狀圖1：瓜類細(xì)菌性果斑病發(fā)病癥狀：西瓜子葉(A321.2瓜類細(xì)菌性果斑病的發(fā)生情況

該病害自1998年在我國(guó)首次報(bào)道，15年的時(shí)間已經(jīng)遍布了我國(guó)許多農(nóng)業(yè)大省。該病最早于1969年由Crall和sehenckt在美國(guó)佛羅里達(dá)州發(fā)現(xiàn)，并對(duì)果斑病的癥狀進(jìn)行了描述。1985年wall和santos在關(guān)島報(bào)道了西瓜細(xì)菌性果斑病的發(fā)生，并首次將其病原菌鑒定為類產(chǎn)堿假單胞菌西瓜亞種。1992年Willems等人根據(jù)西瓜果斑病病原菌的rRNA-DNA和DNA-DNA分子雜交研究結(jié)果，將其更名為西瓜細(xì)菌性果斑病菌(Acidovoraxavenae

subsp.citrulli)。1.2瓜類細(xì)菌性果斑病的發(fā)生情況該病害自1998年在我國(guó)331.3瓜類細(xì)菌性果斑病的防治關(guān)于該病害的防治方法有加強(qiáng)檢疫、藥劑防治、種子處理、從無(wú)病區(qū)引種、生物防治、采用抗病品種等。目前應(yīng)用最廣泛的是藥劑防治，有效的藥劑是銅制劑和抗生素。5%百菌清1公斤/畝、14%絡(luò)氨銅水劑300倍液或50%甲霜銅可濕性粉劑600倍液,77%氫氧化銅可濕性微粒粉劑400倍液,用量60～75升/畝,連續(xù)3～4次。硫酸鏈霉素或72%農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑4000倍液;40萬(wàn)單位的青霉素甲鹽5000倍液。藥劑防治方面主要是銅制劑。1.3瓜類細(xì)菌性果斑病的防治關(guān)于該病害的防治方法有加強(qiáng)檢疫341.4本論文研究目的及意義

我國(guó)的西瓜、甜瓜種植面積和產(chǎn)量都位居世界前列。瓜類細(xì)菌性果斑病給我國(guó)西甜瓜生產(chǎn)造成了嚴(yán)重危害。用于田間防治果斑病的主要是含銅殺菌劑。隨著銅制劑的不斷應(yīng)用病原菌對(duì)銅制劑抗性不斷增加，而目前國(guó)內(nèi)對(duì)果斑病菌菌株之間抗銅性的差異還沒有報(bào)道，因此本試驗(yàn)對(duì)113株菌株的抗銅性進(jìn)行了研究，闡明菌株間的抗銅性差異，從而為田間合理使用含銅殺菌劑提供有力的證據(jù)。1.4本論文研究目的及意義我國(guó)的西瓜、甜瓜種植面積和產(chǎn)35菌株號(hào)采集地點(diǎn)寄主分離部位亞群分離時(shí)間No.ofstrainLocationHostOrganisolatedgroupTimeisolatedAacw1內(nèi)蒙古臨河市西瓜葉片Ⅰ2002-9-3Aacw2內(nèi)蒙古臨河市西瓜葉片Ⅰ2002-9-3Fc247Unitedstates西瓜葉片Ⅰ2002-9-3Fc520UnitedStates西瓜葉片Ⅰ2002-9-3pslb1內(nèi)蒙古臨河市甜瓜葉片Ⅰ2000-7-14pslb2內(nèi)蒙古臨河市甜瓜葉片Ⅰ2000-7-14pslb3內(nèi)蒙古臨河市甜瓜葉片Ⅰ2000-7-14pslb4內(nèi)蒙古臨河市甜瓜葉片Ⅰ2000-7-14pslb8內(nèi)蒙古臨河市甜瓜葉片Ⅰ2000-7-14pslb9內(nèi)蒙古臨河市甜瓜葉片Ⅰ2000-7-14pslb10內(nèi)蒙古臨河市甜瓜葉片Ⅰ2000-7-14pslb15內(nèi)蒙古臨河市甜瓜葉片Ⅰ2000-7-18pslb19內(nèi)蒙古臨河市八一鄉(xiāng)甜瓜葉片Ⅰ2000-7-18pslb22內(nèi)蒙古臨河市八一鄉(xiāng)甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-7-18pslb23內(nèi)蒙古臨河市八一鄉(xiāng)甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-7-182材料與方法2.1供試菌株表1113株供試瓜類細(xì)菌性果斑病菌菌株菌株號(hào)采集地點(diǎn)寄主分離部位亞群分離時(shí)間No.ofstra36pslb24內(nèi)蒙古臨河市八一鄉(xiāng)甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-7-18pslb25內(nèi)蒙古臨河市八一鄉(xiāng)甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-7-18pslb28內(nèi)蒙古臨河市八一鄉(xiāng)甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-7-18pslb29內(nèi)蒙古臨河市八一鄉(xiāng)甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-7-18pslb30內(nèi)蒙古臨河市八一鄉(xiāng)甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-7-18pslb31內(nèi)蒙古臨河市八一鄉(xiāng)甜瓜葉片Ⅰ2000-7-25pslb35內(nèi)蒙古巴盟農(nóng)業(yè)多種經(jīng)營(yíng)站甜瓜子葉Ⅰ2000-8-20pslb36內(nèi)蒙古巴盟農(nóng)業(yè)多種經(jīng)營(yíng)站甜瓜子葉Ⅰ2000-8-20pslb37新疆甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-9-9pslb38新疆甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-9-9pslb39新疆呼圖壁甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-9-14pslb40新疆呼圖壁甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-9-14pslb41新疆呼圖壁甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-9-14pslb42新疆呼圖壁甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-9-14pslb44新疆甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-9-14pslb45新疆甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-9-14pslb46新疆甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-9-14pslb47新疆甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-9-14pslb48新疆甜瓜子葉Ⅰ2000-9-14pslb49新疆甜瓜葉片Ⅰ2000-9-14pslb52新疆甜瓜葉片Ⅰ2000-9-14pslb53新疆甜瓜葉片Ⅰ2000-9-14pslb54新疆甜瓜葉片Ⅰ2000-9-14pslb60新疆甜瓜葉片Ⅰ2000-9-14pslb61新疆甜瓜葉片Ⅰ2000-9-14pslb24內(nèi)蒙古臨河市八一鄉(xiāng)甜瓜果實(shí)Ⅰ2000-7-18p37pslb62新疆甜瓜葉片Ⅰ2000-9-14pslb63新疆甜瓜葉片Ⅰ2000-9-14pslb64新疆甜瓜葉片Ⅰ2000-9-14pslb65新疆甜瓜葉片Ⅰ2000-9-14pslb68新疆阿爾泰甜瓜葉片Ⅰ2001-8-26pslb69新疆阿爾泰甜瓜葉片Ⅰ2001-8-26pslb70新疆阿爾泰甜瓜葉片Ⅰ2001-8-26pslb71新疆阿爾泰甜瓜葉片Ⅰ2001-8-26pslb73新疆阿爾泰甜瓜葉片Ⅰ2001-8-26pslb74新疆阿爾泰甜瓜葉片Ⅰ2001-8-26pslb75新疆阿爾泰甜瓜葉片Ⅰ2001-8-26pslb76新疆阿爾泰甜瓜葉片Ⅰ2001-8-26pslb88內(nèi)蒙古臨河市甜瓜果實(shí)Ⅰ2004-8-13pslb89內(nèi)蒙古臨河市甜瓜果實(shí)Ⅰ2004-8-13pslb90內(nèi)蒙古臨河市甜瓜果實(shí)Ⅰ2004-8-13pslb91內(nèi)蒙古臨河市甜瓜果實(shí)Ⅰ2004-8-13pslb92內(nèi)蒙古臨河市甜瓜果實(shí)Ⅰ2004-8-13pslb93新疆五家渠甜瓜葉片Ⅰ2005-7-21pslb94新疆五家渠甜瓜莖Ⅰ2005-7-21pslb95新疆五家渠甜瓜莖Ⅰ2005-7-21pslb96海南甜瓜莖Ⅰ2005-7-21pslb97山東甜瓜果實(shí)Ⅰ2009-5-4pslb98河北樂亭甜瓜果實(shí)Ⅰ2009-5-14pslb99浙江寧波甜瓜果實(shí)Ⅰ2009-5-25pslb101海南甜瓜果實(shí)Ⅰ2009-11-12pslb62新疆甜瓜葉片Ⅰ2000-9-14pslb63新疆38pslb102新疆(222團(tuán))甜瓜葉片Ⅰ2010-7-15pslb103新疆(222團(tuán))甜瓜葉片Ⅰ2010-7-15pslbtw19海南文昌西瓜嫁接苗Ⅰ2009-12-10pslbtw20海南三亞西瓜葉片Ⅰ2010-4-6Aac5臺(tái)灣西瓜葉片Ⅱ2002-9-3Aac13臺(tái)灣西瓜葉片Ⅱ2002-9-3Aac14臺(tái)灣西瓜葉片Ⅱ2002-9-3Fc491Japan西瓜葉片Ⅱ2002-9-3pslb86新疆甜瓜葉片Ⅱ2004-7-7pslbtw2北京西瓜果實(shí)Ⅱ2005-6-13pslbtw3北京西瓜果實(shí)Ⅱ2005-6-13pslbtw5北京西瓜果實(shí)Ⅱ2005-6-30pslbtw6北京西瓜果實(shí)Ⅱ2005-6-30pslbtw7北京西瓜果實(shí)Ⅱ2005-6-30pslbtw8北京西瓜果實(shí)Ⅱ2005-6-30pslbtw9北京西瓜果實(shí)Ⅱ2005-6-30pslbtw10北京西瓜果實(shí)Ⅱ2005-6-30pslbtw11北京西瓜果實(shí)Ⅱ2005-6-30pslbtw14廣東西瓜果實(shí)Ⅱ2008-10-24pslbtw15山東西瓜葉片Ⅱ2009-5-4pslbtw16黑龍江哈爾濱西瓜葉片Ⅱ2009-11-2pslbtw22北京大興西瓜果實(shí)Ⅱ2010-6-26pslbtw23北京大興西瓜果實(shí)Ⅱ2010-6-26pslbtw24北京大興西瓜果實(shí)Ⅱ2010-6-26pslbtw25北京大興西瓜果實(shí)Ⅱ2010-6-26pslb102新疆(222團(tuán))甜瓜葉片Ⅰ2010-7-1539pslbtw26北京大興西瓜果實(shí)Ⅱ2010-6-26pslbtw27新疆打瓜果實(shí)Ⅱ2010-8-1pslbtw28新疆打瓜果實(shí)Ⅱ2010-8-1pslbtw29新疆打瓜果實(shí)Ⅱ2010-8-1pslbtw30新疆打瓜果實(shí)Ⅱ2010-8-1pslbtw31新疆打瓜果實(shí)Ⅱ2010-8-1pslbtw32黑龍江哈爾濱西瓜葉片Ⅱ2010-8-11pslbtw33黑龍江哈爾濱西瓜葉片Ⅱ2010-8-11pslbtw34黑龍江哈爾濱西瓜果實(shí)Ⅱ2010-9-1pslbtw35黑龍江哈爾濱西瓜果實(shí)Ⅱ2010-9-1pslbtw36黑龍江哈爾濱西瓜果實(shí)Ⅱ2010-9-1pslbtw37黑龍江哈爾濱西瓜果實(shí)Ⅱ2010-9-1pslbtw38黑龍江哈爾濱西瓜果實(shí)Ⅱ2010-9-1pslbtw39海南文昌西瓜子葉Ⅱ2010-11-6pslbtw40海南西瓜子葉Ⅱ2010-11-6pslbtw41北京大興西瓜子葉Ⅱ2010-12-24pslbtw42北京大興西瓜子葉Ⅱ2010-12-24pslbtw43北京大興西瓜子葉Ⅱ2010-12-24pslbtw26北京大興西瓜果實(shí)Ⅱ2010-6-26pslb402.2供試試劑和儀器

電磁爐，微波爐，高壓滅菌鍋，超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，DL-CJ-2ND醫(yī)用型），恒溫培養(yǎng)箱（DHP120，上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司），蛋白胨、瓊脂粉、磷酸氫二鉀、七水合硫酸鎂購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司，五水硫酸銅購(gòu)自天津大學(xué)科威公司。2.2供試試劑和儀器電磁爐，微波爐，高412.3試驗(yàn)方法2.3.1不同濃度硫酸銅KB培養(yǎng)基配制用移液槍吸取硫酸銅母液加入溶化的KB培養(yǎng)基中，使硫酸銅的終濃度分別為：50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml、300μg/ml、350μg/ml、400μg/ml，450μg/ml，500μg/ml，550μg/ml，600μg/ml、650μg/ml、700μg/ml、750μg/ml，混勻后倒平板備用。

2.3.2接種活化實(shí)驗(yàn)室保存的113株果斑病菌株，28℃培養(yǎng)48h后，挑取單菌落劃線接種于不同濃度的硫酸銅平板上，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，并劃線接種于不含硫酸銅的KB平板作為對(duì)照，28℃培養(yǎng)，1d后開始觀察，觀察10d。2.3試驗(yàn)方法2.3.1不同濃度硫酸銅KB培養(yǎng)基配制423結(jié)果與分析3.1供試菌株對(duì)硫酸銅抗性差異比較

所有菌株對(duì)小于300μg/ml濃度均不敏感，300μg/ml濃度時(shí)只有pslbtw43菌株表現(xiàn)敏感，在濃度達(dá)700μg/ml時(shí)所有菌株在劃線培養(yǎng)10d后均不能生長(zhǎng)，據(jù)此推斷果斑病菌株對(duì)硫酸銅的最大抗性濃度約為700μg/ml。本試驗(yàn)結(jié)果與R.R.Walcott研究不一致。3結(jié)果與分析3.1供試菌株對(duì)硫酸銅抗性差異比較43表2果斑病菌對(duì)不同濃度硫酸銅敏感度

Table2bacteriasensitivitytodifferentconcentrationsofcoppersulfate菌株號(hào)硫酸銅濃度（μg/ml）50100150200250300350400450500550600650Aacw1＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Aacw2＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Aac5＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—Aac13＋＋＋＋＋＋＋＋—Aac14＋＋＋＋＋＋＋＋—Fc247＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—Fc356＋＋＋＋＋＋＋＋＋—Fc376＋＋＋＋＋＋＋＋—Fc491＋＋＋＋＋＋＋—Fc520＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋pslb1＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb2＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋pslb3＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—表2果斑病菌對(duì)不同濃度硫酸銅敏感度

Table2bact44pslb4＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb8＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb9＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb10＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb15＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb18＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb19＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb22＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb23＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb24＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb25＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb27＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb28＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb29＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb30＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb31＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb35＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb36＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb4＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb8＋＋＋＋＋＋45pslb37＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb38＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb39＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb40＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb41＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb42＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb44＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb45＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb46＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb47＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb48＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb49＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb52＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb53＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb54＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb60＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb61＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb62＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb37＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb38＋＋＋＋46pslb63＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb64＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb65＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb68＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb69＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb70＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb71＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb73＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb74＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb75＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb76＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb86＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb88＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb89＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb90＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb91＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb92＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb93＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb63＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb64＋＋＋＋＋47pslb94＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb95＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb96＋＋＋＋＋＋＋—pslb97＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb98＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb99＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb101＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb102＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb103＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw1＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw2＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw3＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw5＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw6＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw7＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw8＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw9＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw10＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb94＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslb95＋＋＋＋48pslbtw11＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw14＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw15＋＋＋＋＋＋＋＋＋—pslbtw16＋＋＋＋＋＋＋＋＋—