植物材料的固定、包埋和制片_、植物材料的固定和包埋在此過程應注意防止Rnase的污染。所使用的熔蠟管〔管蓋不能耐受180°C烘，只需高壓濕熱滅菌即可)、量筒、三角瓶和藥勺均需180C烘5小時以上。所用蒸餾水無需用DEPC處理。所固定的材料越小越好，盡可能切除多余的材料。材料取下后應立即固定。取材后假設不能立即固定，則應置于冰上運輸。配試劑前請計算一下所需用量，用多少配多少，節(jié)約試劑。第一天一、配制甲醛溶液〔以300ml量為例〕1、先打開一個60C左右的水浴鍋。2、在通風櫥中往三角瓶中加入12g多聚甲醛(終濃度為4%)。3、用量筒配300mlPBS緩沖液〔30ml10XPBS+270ml水〕，另加1粒NaOH，蓋好錫箔紙后，輕輕搖動，稍微溶化后置于水浴鍋中溶解。4、完全溶解后，取出，加0.1%Tween-20(300ul)和0.1%Triton(300ul)混勻〔包埋水稻時還要再加3ml25%的戊二醛〕。5、置于冰上或4C冰箱降至室溫，然后用硫酸調(diào)pH至。6、把配制好的甲醛溶液分裝到小瓶中，〔一般用10ml的小瓶〕。7、分裝好的甲醛溶液應放置在冰浴中當天使用。二、固定材料1、取植物新鮮材料，去除不需要的部分至適當大小。注意：所固定的材料越小越好，盡可能去除無用多余的部分。2、把取好材料放入冰浴的裝有甲醛溶液的小瓶中。注意每瓶中的切塊數(shù)：太多固定不好；太少則浪費固定液〔固定液:材料巳20:1〕。3、材料放入固定液后，應通過抽真空〔1至數(shù)分鐘，視具體情況而定：盡可能短時間，以材料沉入固定液中為準〕，幫助固定液進入組織中，以到達迅速固定植物材料的目的。抽氣減壓時，盡量不要使液體過分沸騰。抽真空時，材料一般在固定液中浮起;抽完真空的材料應該沉入固定液中，有時可能要反復多次抽真空，直至材料沉沒在固定液中。一般抽真空多于5分鐘大部份材料還不沉沒在固定液中的情況極少見，如果此情況發(fā)生，建議抽真空達10分鐘后，繼續(xù)做步驟4。4、抽真空后需要更換一次新鮮的固定液。5、更換新鮮固定液后，材料在4C過夜。注意：甲醛有劇毒，因此藥品的稱取和溶液的配置必須在通風櫥中進行！多聚甲醛極易飛散；稱取時通風櫥可暫不抽風；要防止將多聚甲醛灑落在天平或臺面上造成污染，如有灑落，要及時清理。第二天按以下序列對材料進行脫水〔水為高壓滅過菌的雙蒸水〕。1、0.85%NaCl冰浴，30分鐘2、50%乙醇/0.85%NaCl冰浴，5小時3、70%乙醇/0.85%NaCl冰浴，5小時4、85%乙醇/0.85%NaCl4C，過夜注：進第三天1、95%Z入50%乙醇后，材料應開始脫色。:醇/水4C，5小時2、100%乙醇4C，5小時3、100%乙醇4C，過夜注：第三天起，每個脫水步驟時間可延長至一天。兩次100%乙醇脫水后，材料應為無色。第四天1、100%乙醇室溫，2小時2、50%乙醇/50%二甲苯室溫，1小時3、100%二甲苯室溫，1小時4、100%二甲苯室溫，1小時5、100%二甲苯室溫，1小時6、50%二甲苯/50%石蠟58C，過夜〔使用熔蠟臺）注：使用二甲苯后，應在通風櫥中操作，要防止讓在同一實驗室工作的人聞到二甲苯的味道。第五至七天每天換兩次100%石蠟〔58°C〕，傾倒時防止產(chǎn)生氣泡。注意：在換石蠟前1-2小時，把石蠟裝于干凈熔蠟管內(nèi)，置于熔蠟臺上熔化備用。第八天紙盒的處理：將折好的紙盒于氯仿〔廢氯仿可回收重復利用〕中泡一會，再取出晾干。包埋蠟塊：先準備一盆水放在旁邊備用，再將大小合適的紙盒放在熔蠟臺上〔在紙盒上寫明材料的名稱等有關內(nèi)容〕，將新熔化的石蠟傾倒于此盒內(nèi)，把材料放到此盒內(nèi)。用加熱的鑷子迅速把材料按需要的切面及材料之間的間隔排列整齊。用嘴吹氣，使石蠟外表凝固形成一層薄膜時，再平放入冷水中，使其盡快凝固，數(shù)秒后翻轉(zhuǎn)蠟塊。約半小時后取出，置于有吸水紙的塑料框里晾干。包埋好的蠟塊放入4。。冰箱中備用。二、載玻片和蓋玻片的處理1、將挑好的載玻片和蓋玻片放入洗液〔2%HCl+70%乙醇溶液：70ml無水乙醇+2ml濃HCl+28mlH0浸泡過夜，流水沖洗干凈。2、準備2個燒杯的雙蒸水、2個燒杯的95%乙醇和2個燒杯的無水乙醇，將洗好的載玻片和蓋玻片依次經(jīng)過這6個燒杯，在干的紙上蘸干酒精后，于酒精燈上燒干。3、燒好的載玻片和蓋玻片放在折好的錫紙上晾干，最后用錫箔紙包裹。4、180C烘5個小時。5、待載玻片冷卻，加4ul多聚-L-賴氨酸〔1mg/ml〕于一端。用蓋玻片〔已經(jīng)過180C烘5個小時處理〕的一邊接觸液滴，進行涂片。涂片時應觀察到“虹膜”的形成。注意：假設涂片后多聚-L-賴氨酸不形成一層水膜，則說明載玻片沒有洗干凈，必須重洗。請注意標記載玻片的哪一面涂有多聚-L-賴氨酸。6、涂片之后放入37C的燙板中干燥過夜〔最短可以4小時，水干了即可〕，準備切片。經(jīng)過處理的載玻片應在一周內(nèi)使用。。7、最后封片用的蓋玻片不需作任何處理。使用前用擦鏡紙擦凈即可〔主要是防塵〕。三、切片和展片1、修塊。將包有材料的小蠟塊〔包含一個材料〕初步修成六面體，粘在硬木塊上。用刀片將蠟塊修成梯形，在材料的周圍各留2mm的石蠟即可〔盡可能少留〕。2、切片。切片的厚度為7-10um。在解剖鏡下用暗視野觀察蠟帶，以決定取舍。3、展片。將DEPC處理過的蒸餾水滴加在涂有多聚賴氨酸的載玻片上〔注意分清哪一面涂有多聚賴氨酸〕，將蠟帶的反面〔注意正反面！〕漂浮于其上放入燙板上〔42C〕進行展片。蠟帶完全展開后〔數(shù)分鐘至幾十分鐘不等，注意觀察以免展過頭，以組織不裂開為度：吸去多余的水，用一張鏡頭紙輕輕壓在蠟帶上，然后用吸水紙吸去多余的水。置于42C燙板上干燥過夜。4、切好的片子應盡量在一星期內(nèi)進行雜交。［物組織RNA原位雜交第二部分RNA探針的地高辛標記一、轉(zhuǎn)錄模板的線性化要轉(zhuǎn)錄的DNA〔150-1200bp無polyA尾〕被克隆在合適轉(zhuǎn)錄載體的多克隆位點上，多克隆位點的外端帶有SP6、T7或T3RNA多聚酶的啟動子，燦SK、pKS、pGEM-T和pSPT18或19。轉(zhuǎn)錄反應開始之前必須將DNA模板在插入序列的一端進行酶切為防止轉(zhuǎn)錄出非目的的RNA，應選用產(chǎn)生5’端凸出〔或平端？〕的內(nèi)切酶，酶切必須完全。酶切時要同時制備正義和反義DNA模板。酶切體系：總體積200ulH2O152或172ulTOC\o"1-5"\h\z10XBuffer20ul10XBSA0或20ul質(zhì)?！?ug/ul〕6ul酶〔10u/ul〕6ulRNase〔10mg/ml〕6ul1、質(zhì)粒終濃度為ug/ul，加入合適的內(nèi)切酶及緩沖液〔200ul酶切體系〕，在合適的溫度下保溫〔如37°C，2小時〕，電泳檢查是否酶切完全。酶切后可以加入等體積的水〔200ul〕，這樣可以減少后面抽提時的損失〔注意：此時應該以混合后的體積作為1倍體積〕將3M的醋酸鈉取出化凍2、酶切后，加入等體積的酚〔Tris飽和的酚，下層溶液才是酚〕〔200ul〕：氯仿〔200ul〕〔先加酚，振蕩，再加氯仿，振蕩〕抽提，12000轉(zhuǎn)/別離心，5min，取上清夜〔棄下層有機相〕到EP管中。再加等體積的氯仿〔400ul〕抽提，12000轉(zhuǎn)/別離心，5min，取上清夜〔棄下層有機相〕到EP管中。再重復一次氯仿抽提，取上清。3、在上述水相中加入3M的醋酸鈉〔中和磷酸基團，有助于沉淀DNA〕，使終濃度到達〔由最后所得的上清液的體積決定〕。約1分半以后再加入2倍冰預冷的乙醇，置冰上1小時〔推薦是-20C過夜〕。4、樣品取出，12000g離心，10min。棄上清，加400ul70%乙醇，顛倒混勻后再12000rpm離心10min。把殘液吸盡后，真空干燥〔約1.5min〕，重懸于水或1/10TE〔〕溶液中使終濃度達ug/ul〔視最初的質(zhì)粒濃度來決定應加TE的體積〕，-20C保存。二、RNA探針的標記下午開始做，先將Buffer,DDT,ATP,GTP,CTP和Dig-UTP化凍，不同公司用各自的一套反應體系。1、標記反應體系：〔室溫下，以T7RNA聚合酶為例?！硨汒惵磻w系10ulDEPC水〔要根據(jù)模板加樣量決定〕ul10XT7轉(zhuǎn)錄緩沖液ulRNA酶抑制劑〔50u/ul〕ul5mMATPul5mMGTPul5mMCTPul1mMDIG-UTP1ulDNA線性模板〔ug〕1ulT7RNA聚合酶Total:25ulPromega的反應體系4-5ulDEPC水〔要根據(jù)模板加樣量決定〕5ul5XT7轉(zhuǎn)錄緩沖液ulDDT(100mM)ul5mMATPul5mMGTPul5mMCTPul1mMDIG-UTP1-2ulDNA線性模板ug,視模板濃度而定加樣體積)ulRNA酶抑制劑(40u/ul)1ulT7RNA聚合酶(20u/ul)Total:25ulTakara的反應體系4.5ulDEPC水〔要根據(jù)模板加樣量決定〕ul10XSP6轉(zhuǎn)錄緩沖液ulDDT(100mM)ul0.1%BSAul5mMATPul5mMGTPul5mMCTPul1mMDIG-UTP1.0ulDNA線性模板(0.05-ug，視模板濃度而定加樣體積)0.6ulRNA酶抑制劑(40u/ul)1.0ulSP6RNA聚合酶(10-50u/ul)Total:25ul此時將tRNA(100mg/ml)ffi3.8MNJ^c拿出來化凍并混勻。2、37°C溫育2小時〔此時可跑膠檢測轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的長度，但多省略〕。3、終止轉(zhuǎn)錄反應：75ul1xMS2ultRNA(100mg/ml)(Sigma,R4251,500units,TypeXXI,Ribonucleicacid,transfer,放在-20C的EP管；它在萬一有RNAase的情況下，則可以保護轉(zhuǎn)錄的RNA，犧牲自己去被降解；而且在沉淀的時候可以與合成的RNA共沉淀，尤其在合成的RNA量很少的情況下可以減少損失)1ulDNA酶〔無RNA酶污染的DNaseI(10u/ul)〕4、37C溫育10分鐘。5、沉淀：100ul3.8MNHAc〔可增加離子濃度〕、.4.一》600ul乙醇〔冰上預冷〕6、-20C過夜。〔或在干冰上10分鐘，時間稍微長點沒關系〕。配好明天用的70%乙醇/NaCl溶液，體積視標記的數(shù)量而定，孝C冰箱存放。早上過來先打開離心機和冷井制冷，同時打開C水浴。7、樣品取出，4C13000-15000轉(zhuǎn)/分〔F2402轉(zhuǎn)頭〕，離心10分鐘，棄上清。8、用200ul冰預冷的70%乙醇/NaCl沖洗沉淀〔HO405ul+45ul5MNaCl+10502ul乙醇〕。9、4C13000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘。棄上清，真空干燥。10、加入50ulDEPC水〔4C溶解10min后再到下一步〕。11、加入50ul2X碳酸緩沖液〔，使終濃度為200mM〕12、60C水解：模板〔插入片段〕長度水解時間600-1200bp80-90分鐘400-500bp60分鐘〔如Histone〕200-400bp20-30分鐘〔如cyclin〕小于200bp1-5分鐘此時取出10%醋酸和3MNaAc(pH4.8)化凍。13、沉淀10ul10%醋酸12ul3MNaAc(pH4.8)312ul乙醇〔冰預冷〕14、-20C，2小時。此時打開冷井。15、重復7-9步。此時取出TE(pH7.6)化凍。16、沉淀重懸于50ulTE(pH7.6)中，置-20C保存〔加入0.5ulRNasin(20u/ul)的RNA酶抑制劑，趙忠不加，因為他配的TE可靠，無RNase〕。三、RNA探針的檢測先配40mlDig1和15mlDig5溶液，再稱取40mgBlockingreagent加入8mlDig1中配Dig2溶液。1、點膜〔Southern用剩下的膜〕：ul待測探針；1-5ng/ul地高辛標記的對照RNA〔寶麗曼公司〕。2、自然吹干。3、置于小培養(yǎng)皿中，用5ml地高辛緩沖液1浸濕。4、地高辛緩沖液2中30分鐘。5、在5ml用5ml地高辛緩沖液1沖洗。6、在5ml地高辛緩沖液1+1ul地高辛抗體中30分鐘。7、用5ml地高辛緩沖液1沖洗2次，每次15分鐘。8、用5ml地高辛緩沖液5稍加沖洗。9、在地高辛緩沖液6中〔5ml地高辛緩沖液5中加入7ulNBT和5ulBCIP〕暗處顯色10分鐘以上。第三部分原位雜交前一天晚上每24張片子準備4-5升無菌水〔無須DEPC處理）。蓋玻片〔24-30片/30片載玻片），25ml量筒1個、50ml量筒5個、100ml量筒1個、250ml量筒3個、500ml量筒7個，1000ml燒杯4個，250ml三角瓶4個，500ml三角瓶4個，1000ml三角瓶8個，鐵藥勺3把，切片籃2個，平頭鑷2把。以上均需180°C烘5小時。檢查儲備液準備新滅菌的槍頭、離心管。第一天早上過來后先把下午實驗所需的玻璃缸洗凈：先自來水沖洗，雙蒸水過一次，再用無水乙醇過一次，略晾干，最后用氯仿過一次。然后置于通風櫥中吹干備用。同時準備以下12種溶液：首先從準備多聚甲醛開始，Rnase處理之前的溶液均需用滅菌的蒸餾水配制，Rnase處理之后即可直接使用蒸餾水。將以下溶液倒入通風櫥中的玻璃缸中：二甲苯1和2（2X300ml二甲苯溶液）100%乙醇1和2〔2X300ml無水乙醇溶液〕100%乙醇8.5%NaCl水95%乙醇285ml—15ml85%乙醇,0.85%NaCl255ml30ml15ml50%乙醇,0.85%NaCl150ml30ml120ml30%乙醇,0.85%NaCl90ml30ml180ml0.85%NaCl—30ml270mlPBS1和2(2X300ml)10XPBS2X30ml水2X270ml鏈蛋白酶〔protease〕0.125mg/ml（300ml）〔如果材料不同，則條件中需改變的是鏈蛋白酶的濃度及時間〕TOC\o"1-5"\h\z20X鏈蛋白酶緩沖液15ml水285ml鏈蛋白酶粉劑40mg甘氨酸0.2%(300ml)TOC\o"1-5"\h\z10XPBS30ml水264ml甘氨酸粉劑克4%多聚甲醛(300ml)10XPBS30ml水270ml多聚甲醛12克注意：〔1〕多聚甲醛有毒應在通風櫥中稱取配制，多聚甲醛極易飛散稱取時通風櫥不要抽風，防止將多聚甲醛灑落在天平或臺面上造成污染C2〕PBS和水加入三角瓶后，加入2-3粒NaOH,搖勻加熱^l」60°C。在通風櫥中加入_2克多聚甲醛,parafilm封口搖勻直到完全溶解。置于冰上降溫，用硫酸調(diào)。調(diào)值時不要心急，20ul一次慢慢地加。乙酸酐溶液〔溶于M三羥基乙基胺pH8〕〔現(xiàn)用現(xiàn)配〕TOC\o"1-5"\h\z2M三羥基乙基胺35ml水665ml乙酸酐3.6ml注意：此溶液現(xiàn)配現(xiàn)用，置弟00ml大缸中。大缸中先放入一個空的載片籃及轉(zhuǎn)子，當盛滿載玻片的載片籃放入玻璃缸、攪拌子開始攪拌時，再加入乙酸酐。_、組織預處理下午一點左右可以開始做。先打開37°C的水浴鍋。切片經(jīng)鏡檢后，裝入不銹鋼載片籃中〔24片/籃〕，在通風櫥中進行以下操作：〔1〕二甲苯110分鐘|（1）〔2〕二甲苯210分鐘〔3〕100%乙醇11分鐘|?個［新鮮）TOC\o"1-5"\h\z〔4〕100%乙醇230秒|個〔5〕95%乙醇30秒|個〔6〕85%乙醇，0.85%NaCl30秒個〔7〕50%乙醇，0.85%NaCl30秒個〔8〕30%乙醇，0.85%NaCl30秒今今個〔9〕0.85%NaCl2分鐘|〔此時于37C水浴中配鏈蛋白酶溶液，槍頭助溶；同時第二籃開始進入脫水程序〕〔10〕PBS12分鐘g〔PBS溶液中可以多放置一會〕〔11〕鏈蛋白酶10分鐘〔37C水浴，水解RNA上的蛋白，同時使探針容易進入〕〔12〕甘氨酸2分鐘〔終止鏈蛋白酶的反應〕〔13〕PBS12分鐘〔14〕多聚甲醛10分鐘〔后固定的作用，將RNA與細胞中的蛋白交聯(lián)再一起，同時可固定蛋白酶，同時應開始配乙酸酐溶液〕〔15〕PBS12分鐘〔16〕PBS22分鐘〔17〕乙酸酐10分鐘〔消除RNA上或細胞外表的正電荷〕〔18〕PBS22分鐘〔19〕0.85%NaCl2分鐘3、上行〔個〕脫水，從30%乙醇到100%乙醇‘100%乙醇1’換成新鮮的〕。注意：對于第二籃⑴將原'二甲苯1’倒掉〔回收）原'二甲苯2'成為新二甲苯1，新加入的二甲苯作為二甲苯1。⑵系列乙醇可以再用。（3）將原PBS1倒掉，原PBS2仍為PBS2，新配的PBS作為PBS1。⑷玻璃缸用完后，用滅菌蒸餾水沖洗，加少量乙醇浸泡，用時吹干即可。上行結(jié)束后，把載片籃取出，把無水乙醇吸干后用錫紙包好，留一個小口，與超凈臺上吹干。

二、雜交先打開80°C的水浴鍋。1、準備雜交緩沖液〔32ul/張，可以多準備一些?！?4張載玻片10Xsalt125ul甲酰胺a⑴500ultRNA(100mg/ml)ul50XDenhardt,s25ul水ul50%dextransulphate250ul總體積1000ul注意：50%dextransulphat目E常粘稠，加熱后，再用剪去尖端的槍頭加。2、震蕩混合雜交緩沖液，離心，置于室溫下。3、在冰上混合：〔每一張載玻片〕〔根據(jù)探針的濃度決定探針的加樣量〕TOC\o"1-5"\h\z探針2ul水2ul甲酰胺a⑴4ul4、將探針/水/甲酰胺混合物在80°C加熱2分鐘，離心，在冰上迅速冷卻。5、將探針混合液〔8ul/張〕與雜交緩沖液〔32ul/張〕混合，震蕩，離心，置于室溫下。6、將載片籃拿出，吹干載玻片上乙醇。鋪一層吸水紙，上面覆一層保鮮膜，還有平頭鑷子。7、每一張載玻片加38-40ul的雜交緩沖液/探針溶液，用處理過的蓋玻片蓋于其上，防止產(chǎn)生氣泡?！泊藭r最好關空調(diào)，防止產(chǎn)生氣泡〕8、準備2XSSC,50%甲酰胺〔50ml/盒，8張載玻片/盒，共三盒〕3盒6盒20XSSC15ml30ml水60ml120ml甲酰胺b⑵75ml150ml9、將4張吸水紙雙折，鋪于盒底，加入50ml2XSSC,50%甲酰胺，再于紙上層保鮮膜，載玻片置于其上。蓋上盒蓋，用膠帶密封。、10、在50C水浴中雜交過夜。注：甲酰胺a〔i〕指去離子甲酰胺MolecularBiologygrad&保存與冰箱中;甲酰胺b〔2〕---國產(chǎn)，保存于通風櫥下儲藏柜。準備沖洗緩沖液和NTE溶液，明天備用；同時清洗裝乙酸酐的盒子備用。第二天如果在早上準備第四步地高辛緩沖液2,第三、四步可以在同一天內(nèi)完成，共需12個小時。三、沖洗1、將一個水浴設定在37°C，如果要進行抗體染色〔第四步〕還需要一個50°C的水浴用于配置地高辛緩沖液2。2、準備沖洗緩沖液：〔每籃需要：1X500ml+3X300ml=1400ml〕沖洗緩沖液：2XSSC,50%甲酰胺b20XSSC50ml30ml甲酰胺b250ml150ml水200ml120ml總體積500ml300ml3、將載玻片放回入載片籃中。4、在800ml大塑料盒底部放入一個空載片籃，將裝有載玻片的籃置于其上，加入700ml沖洗緩沖液。在50C水浴中溫育30分鐘。注意：此時蓋玻片會落下。5、換入300ml玻璃缸，加入新鮮沖洗緩沖液，在50C水浴中溫育1小時30分鐘。重復一次。6、在沖洗的過程中，準備NTE溶液〔每籃需要：5X300ml〕NTE溶液1籃2籃5XNTE300ml600ml200ml水1200ml2400ml800ml總體積1500ml3000ml1000ml7、用NTE溶液，在37C水浴中沖洗兩次，每次5分鐘。8、載片籃放入RNA酶A溶液〔20ug/ml〕中，37C水浴溫育30分鐘。RNA酶A溶液1籃2籃RNA酶A儲備液10mg/ml0.6ml1.2mlNTE溶液300ml600ml注意：〔1〕RNA酶A溶液應提前放入37C水浴中預熱5分鐘。⑵加入RNA酶A以后各步：直接使用蒸餾水儀的蒸餾水即可。⑶加入RNA酶A之前和之后使用的玻璃缸一定要分開放置.切勿混用!〔4〕加入RNA酶A之前使用的玻璃缸，每次用完后沖洗干凈加入部分100%乙醇浸泡，下次使用前在通風櫥中吹干即可。

9、準備如下溶液:1XSSC1籃2籃20XSSC15ml30ml水285ml570mlPBS（每籃需要：2X300ml）1籃2籃10XPBS60ml120ml水540ml1080ml10、NTE溶液，室溫沖洗兩次，每次5分鐘。11、沖洗緩沖液，50°C水浴，溫育1小時。12、1XSSC，室溫，2分鐘。13、PBS，室溫，5分鐘。四、抗體染色1、用上面的50C的水浴用于配制地高辛緩沖液2〔因為有BSA的緣故，為半透明的溶液〕。2、準備如下溶液:地高辛緩沖液1〔100mMTris-Hcl,150mMNaCl〕（每24片需800ml）24片載玻片48片載玻片10X地高辛緩沖液180ml160ml水720ml1440ml地高辛緩沖液2S5MW/V]blockingXeagent〕每24片需90ml）3盒6盒Blockingreagent地高辛緩沖液190ml180ml注意：新鮮配置，在60-70C水浴中溶解1小時，溶液仍顯渾濁。Blockingreagent本身有很多類似核酸的片段，可用于封閉核酸。這一步的目的是防止非特異性的吸附。地高辛緩沖液3〔1%牛血清白蛋白[W/v],0.3%Triton[v/v]〕（每24片需500ml）3盒6盒牛血清白蛋白5g10g地高辛緩沖液1500ml1000mlTritonX-1001.5ml3.0ml注意：當天新鮮配置這一步的目的是封閉蛋白。

地高辛緩沖液4〔Anti-digoxigenin-AP1:3000〕（每24片需45ml）3盒Orm6盒Anti-digoxigenin-AP115ul30ul地高辛緩沖液345ml90ml注意：使用前2-3分鐘前再配置。地高辛緩沖液5〔100mMTris-HCl,100mMNaCl,50mMMgClJ（每24片需180ml）3盒6」盒10X地高辛緩沖液5A18ml36ml10X地高辛緩沖液5B18ml36ml水144ml288mlBuffer5A和5B均保存在室溫下。地高辛緩沖液6(每24片需75ml)3盒6盒地高辛緩沖液5