第一部分實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)咳?shí)驗(yàn)流↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓第二部分實(shí)驗(yàn)方第一向電泳——毛細(xì)管等電聚焦電泳儀器準(zhǔn) 燒杯1000mL、50mL各1個(gè)量筒1000mL（或500mL）、100mL、10mL1注射器1mL（帶長(zhǎng)針頭）、微量注射器100μL（或50μL）覆蓋溶液（25mL/班）含8mol/L尿素，1%兩性電解質(zhì)pH3~9.5，5w/v)NP40(NonidetP40Substitute)和100mmol/LDTT取12g尿素，0.25mL兩性電解質(zhì)(pH3~9.5)，12.5mL的10%的NP40和0.386gDTT，用重蒸水溶解后，定容到 平衡溶液（250mL/班）Tris-HClpH6.8)緩沖液，含2%SDS，100mmol/LDTT和10%甘油15mLTris-HCl(pH6.8)，50mL10%SDS，3.86gDTT和mL甘油，用重蒸水定容到250mL30Acrylamide第一向儲(chǔ)液（100mL/班）含28.4%(w/v)acrylamide和1.6%(w/v)N,N'-methylene-bis-用重蒸水先將1.6gbisacrylamide溶解后，再加入28.4gacrylamide，溶解，用重蒸水定容到100mL。如果溶液混10%(w/v)NP40（20mL/班）配制100mL溶液，稱(chēng)量10gNP40，用重蒸水定容到100mL，室溫存放。20mmol/LNaOH 配制500mL，稱(chēng)0.4gNaOH用蒸餾水定容到500mL。10mmol/LH3PO4 配制2000mL，量取1.35mLH3PO4(85%)用蒸餾水定容到2000mL。固定液乙醇35mL，三氯乙酸10g，磺基水楊酸3.5g，加蒸餾水定容到100mL。脫色液乙醇25mL，冰乙酸10mL，加蒸餾水定容到100mL。10%過(guò)硫酸銨0.1g過(guò)硫酸銨溶于1mL重蒸水中，在(1)準(zhǔn)備玻璃管取4支18cm的長(zhǎng)玻璃管，洗凈晾干。(2)配制第一向凝膠溶液（8mL4組）配制方法見(jiàn)表1。表1第一向凝膠溶液配方尿3.84重蒸2.030%Acrylamide儲(chǔ)1.6攪拌溶10%1.5兩性電解質(zhì)0.5010%過(guò)硫酸銨1510 取1支1mL注射器和一根長(zhǎng)針頭，吸取約0.5mL第一向凝 液一邊后退針頭，注意針頭不要露出膠面,直至凝膠溶液 加樣待凝膠聚合后，用微量注射器吸去覆蓋在膠上的重蒸水。在每根上加20~30μL蛋白質(zhì)樣品溶液，然后安裝電泳槽加樣后將玻璃 上槽中玻璃管上端露出1cm，剝?nèi)ゲＡЧ芟露说?準(zhǔn)備電泳。在電泳槽的下槽加2000mL10mmol/LH3PO4 H3PO4溶液中)。上槽倒入500mL20mmol/LNaOH溶液，蓋上電泳槽蓋，注意正負(fù)電極。聚膠電在1000~1500V的電壓下進(jìn)行電泳，直至電流接近于為零(大約7~8h)停止電泳。如果聚焦好的凝膠不能馬上進(jìn)行第二向電泳，在管內(nèi)放置了幾小時(shí)以上,可在走第二向電 （8）平衡浸泡平衡20min，然后進(jìn)行第二向電泳.(9)染色另一條膠放入固定液中固定1~2h，用考 染色1h，再用脫色液脫色，觀察第一向聚焦效果。第二向電泳--SDS-聚丙烯酰胺凝膠電（SDS-溶液配30Acrylamide第二向儲(chǔ)液（500mL/班）含29.1%(w/v)acrylamide和0.9%(w/v)N,N'-methylene-bis-10 稱(chēng)10gSDS用重蒸水溶解，定容到100分離膠緩沖液（300mL/班）1.5mol/LTris-HCl緩沖稱(chēng)Tris109g，取1mol/LHCl144mL，用重蒸水定容至300濃縮膠緩沖液（300mL/班）0.5mol/LTris-HCl緩沖稱(chēng)Tris6g，取1mol/LHCl48mL，用重蒸水定容至100mL電極緩沖液（2500mL/2組）稱(chēng)6g的Tris，29g2.5gSDS，用蒸餾水定容到2.5L(5)電極緩沖液（2500mL/2組）稱(chēng)6g的Tris，29g甘氨酸，2.5gSDS，用蒸餾水定容到2.5L。固定液乙醇50mL，冰醋酸10mL，用蒸餾水定容至100mL。染色液0.25g 藍(lán)R-250，40mL乙醇，1010%過(guò)硫酸銨、脫色液同第一向電泳。實(shí)驗(yàn)步的左、右兩端各放入一條間隔條，對(duì)齊，玻璃板固定支架底座，凸輪，向內(nèi)側(cè)推入并旋轉(zhuǎn)180o，夾心式玻試凝膠濃試凝膠濃30%Acrylamide儲(chǔ)液分離膠緩沖液重蒸水10%SDSTEMED10%AP總體積側(cè)緩緩加入凝膠腔，不產(chǎn)生氣泡，然后用少量1/4濃度的分離膠緩沖液封膠面（高度約2mm），凝膠聚合大待凝膠聚合后用濾紙片吸干封膠緩沖液，灌注第二層板上沿3cm左右,最后用1/4濃度的分離膠緩沖液封膠面（約20mm）縮膠溶液，樣品槽模板，凝膠溶液應(yīng)到達(dá)短玻璃板上沿，聚合0.5~1h。濃縮膠溶液配制方法見(jiàn)表3。試凝膠濃530%Acrylamide儲(chǔ)液濃縮膠緩沖液重蒸水10%SDSTEMED10%AP總體積①將平衡好的膠條用少量的電極緩沖液漂洗，擺放在一塊干凈的玻璃板上，膠條的正位于小加樣槽一端。膠條兩端各切去約2cm，使凝膠長(zhǎng)度略短于加樣槽；1％瓊脂快膠層，瓊脂高度為1~2mm；沿2cm。蓋上電泳槽蓋子，接通電源，恒壓60V，電泳30 藍(lán)R250染色液染色2h，用脫色液脫色，直1、準(zhǔn)備試甲醇、冰醋酸、 2、試劑配制（每個(gè)組3％Na2CO3溶液150