急性毒性及其評(píng)價(jià)方法AcuteToxicityTesting第1頁(yè)，共34頁(yè)。一、急性毒性的概念急性毒性：是指機(jī)體(人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物)一次或24小時(shí)內(nèi)多次接觸外源化學(xué)物后在短期內(nèi)所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。

包括外觀改變、大體形態(tài)變化、行為方式及死亡效應(yīng)，最主要觀察指標(biāo)是LD50

第2頁(yè)，共34頁(yè)。?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接觸化學(xué)物的方式或途徑不同，“一次”的含義也有所不同經(jīng)口和注射接觸，“一次”是指在瞬間將受試化學(xué)物輸入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)經(jīng)呼吸道吸入與經(jīng)皮膚接觸，“一次”是指在一個(gè)特定的期間內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物持續(xù)地接觸受試化學(xué)物的過(guò)程

第3頁(yè)，共34頁(yè)。二、急性毒性試驗(yàn)的目的1.測(cè)試和求出受試化學(xué)物的致死劑量(通常以LD50

為主要參數(shù))，并對(duì)該外源化學(xué)物進(jìn)行急性毒性分級(jí)2.通過(guò)觀察動(dòng)物中毒作用表現(xiàn)、毒作用強(qiáng)度和死亡情況，初步評(píng)價(jià)毒物對(duì)機(jī)體的毒效應(yīng)特征、靶器官、劑量－反應(yīng)關(guān)系和對(duì)人體產(chǎn)生損害的危險(xiǎn)性第4頁(yè)，共34頁(yè)。3.為亞慢性及慢性毒性試驗(yàn)研究以及其他毒理試驗(yàn)提供接觸劑量和觀察指標(biāo)選擇的依據(jù)

4.為毒作用機(jī)理研究提供線索，了解中毒效應(yīng)的特征（包括癥狀，生理、生化與組織病理?yè)p傷）5.研究化學(xué)物急性中毒診斷、預(yù)防和急救治療措施第5頁(yè)，共34頁(yè)。三、急性毒性試驗(yàn)方法的要點(diǎn)(一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的原則：盡量選擇急性毒性反應(yīng)與人近似的動(dòng)物易于飼養(yǎng)，試驗(yàn)動(dòng)物操作方便繁殖生育力較強(qiáng)，數(shù)量較大能夠保障供應(yīng)價(jià)格較低，易于獲得動(dòng)物常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為大白鼠和小白鼠第6頁(yè)，共34頁(yè)。第7頁(yè)，共34頁(yè)。性別?急性毒性試驗(yàn)所用的動(dòng)物應(yīng)當(dāng)是雌、雄各半?如果在研究中發(fā)現(xiàn)待測(cè)化學(xué)物對(duì)雌、雄動(dòng)物的毒性大小有明顯差異時(shí)，應(yīng)分別求出雌性與雄性動(dòng)物各自的LD50

值?如果試驗(yàn)是為致畸試驗(yàn)作劑量準(zhǔn)備，也可僅做雌性動(dòng)物的LD50試驗(yàn)第8頁(yè)，共34頁(yè)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和數(shù)量

?在利用不同的方法測(cè)定化學(xué)物L(fēng)D50時(shí)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中對(duì)動(dòng)物數(shù)的要求不同?霍恩氏法測(cè)LD50

時(shí)要求有4個(gè)劑量組，每組4或5只動(dòng)物?改進(jìn)寇氏法、概率單位法、Bliss法測(cè)定則要求5－7個(gè)劑量組，每組10只動(dòng)物或10只以上?對(duì)于不同的化學(xué)物測(cè)定應(yīng)根據(jù)其相應(yīng)的試驗(yàn)規(guī)程確定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量第9頁(yè)，共34頁(yè)。動(dòng)物分組的原則：均衡性和隨機(jī)性

均衡性：要求各組動(dòng)物的平均體重及體重的離散度盡可能一致。具體來(lái)說(shuō)是：（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重不應(yīng)超過(guò)全體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平均體重的10％---控制離散度（2）每組之間的平均體重相差不應(yīng)超過(guò)5％---控制均衡性隨機(jī)性：每只動(dòng)物分散到各組去的機(jī)會(huì)是均等的，以避免成見(jiàn)或系統(tǒng)誤差第10頁(yè)，共34頁(yè)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的預(yù)處理適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，選擇生理健康的動(dòng)物凡經(jīng)口染毒時(shí)，要求試驗(yàn)前要對(duì)動(dòng)物禁食，以保證胃內(nèi)無(wú)食物，減少食物對(duì)化學(xué)物毒性的干擾大鼠、小鼠——隔夜進(jìn)食；染毒后禁食4h大動(dòng)物——每日上午喂食前染毒染毒后繼續(xù)禁食2~4h，但在禁食時(shí)要保障飲水第11頁(yè)，共34頁(yè)。(二)受試物及處理

受試物的接受、分樣、保管、稱(chēng)重、配制以及在此過(guò)程中嚴(yán)格的質(zhì)量保證影響急性毒性試驗(yàn)受試物劑型：水溶液、混懸液、油溶液第12頁(yè)，共34頁(yè)。(三)染毒方法1.經(jīng)口(胃腸道)染毒：（1）灌胃：?空腹?灌胃后2-3h復(fù)食?灌胃的體積不超過(guò)體重的1-2％：小鼠為0.2－1.0ml/只或0.1－0.5ml/10g較合適大鼠為5ml/只(通常用0.5－1.0ml/100g）家兔為10ml/2kg體重，狗不超過(guò)50ml/10kg第13頁(yè)，共34頁(yè)。灌胃器具制作

取l2號(hào)普通注射針頭，首先將針頭尖部去掉，然后用細(xì)銼刀把去掉部分銼平、銼光，再用沙紙磨光滑，有條件時(shí)可在針尖處點(diǎn)焊成球型。加工成有20度弧度的灌胃針，連接1ml或5ml的注射器，即成為大小鼠的灌胃器。第14頁(yè)，共34頁(yè)。灌胃操作方法先固定動(dòng)物,即用右手將小鼠尾巴提起，置于鼠籠或粗糙的平面上，當(dāng)小鼠向前掙扎時(shí)，用左手的拇指和食指捏住小鼠兩耳后頸背皮膚，翻轉(zhuǎn)小鼠置于掌心，拉直后肢，以小指壓住小鼠尾巴即可。在固定小鼠過(guò)程中，不要用力過(guò)大，勿握其頸部，以免窒息死亡。以灌胃器輕輕壓其頭部，使口腔與食道成一條直線，再將灌胃針沿上腭壁輕輕進(jìn)入食道，當(dāng)灌胃針進(jìn)入約3cm左右時(shí)即達(dá)胃內(nèi)。第15頁(yè)，共34頁(yè)。2.經(jīng)呼吸道接觸

在常溫、常壓下為氣態(tài)，或在生產(chǎn)過(guò)程中和生活過(guò)程中以蒸氣、氣溶膠、煙、粉塵狀態(tài)污染生產(chǎn)與生活環(huán)境空氣，此時(shí)就有可能經(jīng)呼吸道吸入。吸入接觸分為兩種方式：靜式吸入動(dòng)式吸入第16頁(yè)，共34頁(yè)。3.經(jīng)皮膚染毒?研究外源化學(xué)物經(jīng)皮膚吸收應(yīng)當(dāng)盡量選擇皮膚解剖、生理與人類(lèi)較近似的動(dòng)物為對(duì)象，目前多選用家兔和豚鼠?但由于研究化學(xué)物經(jīng)皮膚吸收的毒性(求經(jīng)皮LD50)所需的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物較多，使用家兔、豚鼠不夠經(jīng)濟(jì)，也常用大鼠代替第17頁(yè)，共34頁(yè)。第18頁(yè)，共34頁(yè)。4.經(jīng)注射染毒第19頁(yè)，共34頁(yè)。(四)試驗(yàn)程序1、查閱文獻(xiàn)首先了解分析受試化學(xué)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和其理化性質(zhì)，依此查閱文獻(xiàn)，找出與受試化學(xué)物化學(xué)結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)近似的化學(xué)物的毒性資料，并以文獻(xiàn)資料中相同的動(dòng)物種系和相同接觸途徑所測(cè)得的LD50(LC50)值作為受試化學(xué)物的預(yù)期毒性中值。第20頁(yè)，共34頁(yè)。2、預(yù)試驗(yàn)?以此預(yù)期毒性中值為待測(cè)化學(xué)物的中間劑量組，再上下各推1～2個(gè)劑量組做預(yù)試驗(yàn)（每個(gè)劑量組間的組距可以大些，有利于找出受試化學(xué)物的致死劑量范圍）?根據(jù)確定的劑量組進(jìn)行染毒?根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的死亡資料確定組距可根據(jù)以下公式計(jì)算出劑量分組：

i=(lgLD90-lgLD10)／(n-1)或：i=(lgLD100-lgLD0)／(n-1)

式中i為組距(相鄰的兩個(gè)劑量組對(duì)數(shù)劑量之差)；

n為設(shè)計(jì)的劑量組數(shù)。第21頁(yè)，共34頁(yè)。3、正式試驗(yàn)

一般來(lái)說(shuō)，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)所選用的LD50計(jì)算方法來(lái)確定組數(shù)。例如改良寇氏法一般設(shè)5～7個(gè)劑量組；霍恩法固定設(shè)4個(gè)劑量組。求得i后，以最低劑量組(LD0或LD10)的對(duì)數(shù)劑量加上一個(gè)i值，即是第二個(gè)劑量組的對(duì)數(shù)劑量，依此類(lèi)推直至最高劑量組，查各自的反對(duì)數(shù)即得出各組劑量的真實(shí)值。

123456LgLD0LgLD0+iLgLD0+2iLgLD0+3iLgLD0+4i???第22頁(yè)，共34頁(yè)。4.癥狀觀察(1)觀察時(shí)間和周期測(cè)定外源化學(xué)物的LD50(LC50)，一般要求計(jì)算實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接觸化學(xué)物之后兩周（14天）內(nèi)的總死亡數(shù)對(duì)于一些速死性化學(xué)物求其LD50(LC50)也可僅計(jì)算24小時(shí)的死亡率（有些速殺性化學(xué)物的24小時(shí)LD50

與兩周LD50

值往往沒(méi)有差別）應(yīng)注明是多少時(shí)間的LD50值，以便于在進(jìn)行毒性比較時(shí)有共同的基礎(chǔ)第23頁(yè)，共34頁(yè)。（2）中毒體癥和發(fā)生過(guò)程觀察很多化學(xué)物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接觸的初期往往先出現(xiàn)興奮現(xiàn)象，有的化學(xué)物在動(dòng)物接觸的初期首先表現(xiàn)為抑制現(xiàn)象

第24頁(yè)，共34頁(yè)。第25頁(yè)，共34頁(yè)。（3）死亡情況和時(shí)間分布：計(jì)算LD50重點(diǎn)觀察和記錄每只動(dòng)物死亡的時(shí)間，特別是最早出現(xiàn)死亡的時(shí)間以及各個(gè)劑量組動(dòng)物的死亡數(shù)。分析中毒死亡時(shí)間的規(guī)律具有一定意義，可為深人研究化學(xué)物的毒作用機(jī)制提供參考。第26頁(yè)，共34頁(yè)。（4）體重：體重可以反映動(dòng)物中毒后的整體變化。體重改變的原因很多，若化學(xué)毒物刺激或損傷消化道可出現(xiàn)試驗(yàn)動(dòng)物飲食減少甚至拒食，表現(xiàn)為體重減輕；若化學(xué)毒物引起腹瀉，將影響食物吸收和利用，體重也會(huì)減輕。如果化學(xué)毒物影響水的攝取或腎功能急性損傷，也可能在體重上反映出來(lái)。所以，對(duì)存活動(dòng)物尤其是對(duì)低于LD50劑量組的存活動(dòng)物，應(yīng)在觀察期14天內(nèi)稱(chēng)量其體重的變化，以便了解受試物引起毒效應(yīng)的持續(xù)時(shí)間。

第27頁(yè)，共34頁(yè)。（5）病理檢查和其它指標(biāo)觀察凡中毒死亡動(dòng)物應(yīng)及時(shí)解剖做病理學(xué)檢查，檢查器官有無(wú)充血、出血、水腫或其它改變，并對(duì)有變化的臟器作病理組織學(xué)檢查對(duì)存活動(dòng)物于觀察期結(jié)束后應(yīng)做病理學(xué)檢查根據(jù)試驗(yàn)需要可進(jìn)行某些生化指標(biāo)測(cè)定等第28頁(yè)，共34頁(yè)。經(jīng)典急性毒性試驗(yàn)的局限性消耗的動(dòng)物量大獲得的信息有限測(cè)得的LD50是一個(gè)統(tǒng)計(jì)近似值在安全性評(píng)價(jià)中僅評(píng)價(jià)動(dòng)物死亡和簡(jiǎn)單的癥狀觀察是不夠的，更需要的是生理學(xué)、血液學(xué)及其它化驗(yàn)檢查所提供的深入細(xì)致的毒性信息。第29頁(yè)，共34頁(yè)。急性毒性替代試驗(yàn)固定劑量法上－下移動(dòng)法第30頁(yè)，共34頁(yè)。四、急性毒性分級(jí)和評(píng)價(jià)第31頁(yè)，共34頁(yè)。第32頁(yè)，共34頁(yè)。第33頁(yè)，共34頁(yè)。內(nèi)容梗概急性毒性及其評(píng)價(jià)方法。急性毒性：是指機(jī)體(人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物)一次或24小時(shí)內(nèi)多次接觸外源化學(xué)物后在短期內(nèi)所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接觸化學(xué)物的方式或途徑不同，“一次”的含義也有所不同。經(jīng)呼吸道吸入與經(jīng)皮膚接觸，“一次”是指在一個(gè)特定的期間內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物持續(xù)地接觸受試化學(xué)物的過(guò)程。?對(duì)于不同的化學(xué)物測(cè)定應(yīng)根據(jù)其相應(yīng)的試驗(yàn)規(guī)程確定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量。隨機(jī)性：每只動(dòng)物分散到各組去的機(jī)會(huì)是均等的，以避免成見(jiàn)或系統(tǒng)誤差。大鼠、小鼠——隔夜進(jìn)食。大動(dòng)物——每日上午喂食前染毒。染毒后繼續(xù)禁食2~4h，但在禁食時(shí)要保障飲水。?灌胃的體積不超過(guò)體重的1-2％：。小鼠為0.2－1.0ml/只