30十一月20221celluloseacetatemembraneelectrophoresis實驗四血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳30十一月20221celluloseacetate30十一月20222【實驗?zāi)康摹?/p>

掌握電泳法分離血清蛋白質(zhì)的原理掌握血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的操作方法及臨床意義30十一月20222【實驗?zāi)康摹空莆针娪痉ǚ蛛x血清蛋30十一月20223電泳：帶電粒子在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象電泳技術(shù)：利用電泳現(xiàn)象對混合物進(jìn)行分離分析的技術(shù)【實驗原理】30十一月20223電泳：帶電粒子在電場的作用下，向著與30十一月20224H＋OH－H＋OH－pH>pIpH=pIpH<pI30十一月20224H＋OH－H＋OH－pH>pI30十一月20225電泳速度:帶電粒子在電場中運動時，單位電場強度內(nèi)粒子運動的速度，以u表示，即

V—粒子運動的速度X—電場強度Q—粒子所帶電荷r—粒子的半徑η—介質(zhì)的粘度30十一月20225電泳速度:帶電粒子在電場中運動時，單30十一月20226影響電泳速度的因素1.樣品本身：分子形狀：形狀越小，與支持物介質(zhì)摩擦越小，u越大。球形分子>纖維狀分子Q越多，u越大；分子小，r越小，u越大；30十一月20226影響電泳速度的因素1.樣品本身：分子30十一月202272.緩沖溶液：pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大離子強度(I)：

I越大，電動電勢越小，u越小；

I越小，電動電勢越大，u越大，但樣品易擴散。離子強度如果過低，緩沖液的緩沖容量小，不易維持pH恒定

選擇離子強度時要兩者兼顧，一般離子強度的選擇范圍在0.02～0.2之間。30十一月202272.緩沖溶液：pH值：(pH-pI)30十一月20228電場強度：電泳支持物上每厘米的電位降，也稱電勢梯度。3.電場強度(X)X越大，u越快。支持物越短，X越大，u越快。

電場強度越大或支持物越短，電流將隨之增加，產(chǎn)熱也增加，影響分離效果。在進(jìn)行高壓電泳的時候必須用冷卻裝置，否則可引起蛋白質(zhì)等樣品發(fā)生熱變性而無法分離30十一月20228電場強度：電泳支持物上每厘米的電位降30十一月202294.支持介質(zhì)：①纖維薄膜(玻璃纖維薄膜，醋酸纖維薄膜)②凝膠(瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠)30十一月202294.支持介質(zhì)：①纖維薄膜(玻璃纖維薄30十一月202210負(fù)極正極－－－－－－－－表面帶負(fù)電荷帶正電荷的水層攜帶粒子向負(fù)極移動

如果樣品原本是移向負(fù)極的，則泳動的速度加快；如果樣品原本是移向正極的，則泳動的速度減慢。電滲作用：電滲：在電場作用下液體對固體支持物相對移動的現(xiàn)象。＋＋＋＋＋＋＋＋以紙電泳為例:30十一月202210負(fù)極正極－－－－－－－30十一月202211區(qū)帶電泳的分類（一）支持物物理性狀1．濾紙及其它纖維(如玻璃纖維、醋酸纖維、聚氯乙烯纖維薄膜)電泳2．粉末電泳：如纖維素粉、淀粉電泳；3．凝膠電泳：如瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳；4．絲線電泳：尼龍絲、人造絲電泳。30十一月202211區(qū)帶電泳的分類30十一月202212（二）支持物裝置形式：1．平板式電泳：支持物水平放置；2．垂直板式電泳：聚丙烯酰胺凝膠可做成垂直板式電泳；3．垂直柱式電泳：聚丙烯酰胺盤狀電泳30十一月202212（二）支持物裝置形式：1．平板式電30十一月202213(三)pH連續(xù)性：1．連續(xù)pH電泳：即整個電泳過程pH保持不變，如常用的紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳等。2．非連續(xù)pH電泳：緩沖液和電泳支持物間有不同的pH的電泳，如聚丙烯酰胺凝膠盤狀電脈，等電聚焦電泳等30十一月202213(三)pH連續(xù)性：30十一月202214

醋酸纖維薄膜為支持物

pH=8.6的巴比妥緩沖液血清蛋白的pI均小于8.6

負(fù)電荷電泳時向正極移動由于遷移率不同而被分離30十一月202214醋酸纖維薄膜為支持物30十一月202215γβα2α1清蛋白

分子越小，泳動速度越快帶電量越多，泳動速度越快30十一月202215γβα30十一月202216膜條經(jīng)過氨基黑10B染色后顯出清晰色帶。2.定性,定量各色帶蛋白質(zhì)含量與染料結(jié)合量基本成正比?？蓪⒏魃珟Ъ糸_，分別溶于堿性溶液中。用分光光度法計算各種蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。30十一月2022162.定性,定量30十一月202217醋酸纖維薄膜：醋酸纖維加工的細(xì)密且薄的微孔膜廣泛應(yīng)用醫(yī)學(xué)臨床各種生物分子的分離分析

血清蛋白、血紅蛋白、球蛋白脂蛋白、糖蛋白甲胎蛋白、類固醇及同工酶等30十一月202217醋酸纖維薄膜：血清蛋白、血紅蛋30十一月202218優(yōu)點：簡單快速缺點分辨率較低（聚丙烯酰胺凝膠電泳，PAGE）不適于制備（薄膜厚度約10～100μm，樣品用量很少）30十一月202218優(yōu)點：30十一月202219【器材及試劑】1、器材：醋酸纖維薄膜（2×8cm）常壓電泳儀竹鑷點樣器人血清或雞血清粗濾紙2、試劑：巴比妥緩沖液氨基黑10B0.25染色液漂洗液透明液30十一月202219【器材及試劑】1、器材：2、試劑：30十一月202220[操作]（一）儀器與薄膜的準(zhǔn)備1、醋酸纖維素薄膜的潤濕與選擇2.電泳槽的準(zhǔn)備3、電極槽的平衡30十一月202220[操作]（一）儀器與薄膜的準(zhǔn)備1、30十一月202221（二）點樣

取出薄膜，無光澤面向上平放在濾紙上點樣區(qū)距陰極端1.5cm

血清均勻涂在點樣器表面將點樣器輕輕印在點樣區(qū)內(nèi)，使血清完全滲透至薄膜內(nèi)形成一定寬度、粗細(xì)均勻的直線

實驗的關(guān)鍵，是獲得具有清晰區(qū)帶的電泳圖譜的重要環(huán)節(jié)30十一月202221（二）點樣取出薄膜，無光澤面向上30十一月202222（三）電泳

點樣端薄膜平貼陰極電泳槽支架濾紙橋(點樣面朝下)

另一端平貼在陽極端支架

要求：薄膜緊貼濾紙橋并繃直，薄膜之間相隔幾毫米蓋電泳槽蓋，平衡10min

打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電流強度為0.3mA/片，通電10min

調(diào)節(jié)電流強度為0.5mA/片，電泳60~90min

電泳后調(diào)節(jié)旋鈕電流為O，關(guān)閉電泳儀切斷電源30十一月202222（三）電泳點樣端薄膜平貼陰極電泳30十一月202223DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYY-Ⅲ型電泳槽30十一月202223DYY-5型穩(wěn)壓DYY-Ⅲ型30十一月20222430十一月20222430十一月20222530十一月20222530十一月202226【實驗注意事項】

不要用手觸摸纖維素膜注意區(qū)分醋酸纖維素薄膜的光面和毛面點樣位置要在1.5厘米以內(nèi)，不要距邊緣太近不要重復(fù)點樣膜放進(jìn)電泳槽時，將點樣面向下，點樣端靠近陰極30十一月202226【實驗注意事項】不要用手觸摸纖30十一月202227

用點樣器點樣時不要點的太多，但也不能太少線條均勻，用力水平。電泳槽放膜條支架上盡量不要有緩沖液30十一月202227用點樣器點樣時不要點的太多，但也30十一月202228（四）染色和漂洗

取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min

自來水沖洗，漂洗液漂洗更換3次漂洗液，脫去顏色，得到色帶清晰的電泳圖譜30十一月202228（四）染色和漂洗取出薄膜，直接30十一月202229【實驗結(jié)果】繪出電泳圖譜并標(biāo)明各條帶含義30十一月202229【實驗結(jié)果】繪出電泳圖譜并標(biāo)明各條30十一月20223030十一月20223030十一月202231臨床意義

血漿蛋白是血漿最主要的固體成分，含量60～80g/L

絕大部分由肝臟合成，僅γ球蛋白由漿細(xì)胞合成

正常值： 白蛋白57％~72％，α1球蛋白2％~5％

α2球蛋白4％~9％，β球蛋白6.5％~12％

γ球蛋白12％—20％30十一月202231臨床意義血漿蛋白是血漿最主要的30十一月202232可能相關(guān)疾病清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白骨髓瘤↑*腎病綜合癥↓↑*↑*腎炎↑*↑肝硬化↓↑*急性肝壞死↓*↑↑↑↑傳染性肝炎↓↑*↑*急性感染初期↑*↑*↑*慢性炎癥/感染后期↑*低球蛋白血癥↓*臨床上還可用A/G比來表示清球蛋白的量的關(guān)系：正常人A/G＝1.5～2.530十一月202232可能相關(guān)疾病清蛋白α1球蛋白α2球30十一月202233血漿蛋白的主要功能

維持血漿膠體滲透壓調(diào)節(jié)血漿pH值，維持酸堿平衡運輸營養(yǎng)物質(zhì)、代謝物、激素、藥物及金屬離子等免疫作用30十一月202233血漿蛋白的主要功能維持血漿膠體30十一月202234白蛋白降低：

合成能力不足：肝功能下降

合成原料不足：饑餓，腹瀉，腫瘤晚期

去路增加：腎病綜合癥，嚴(yán)重?zé)齻?，大出血?/p>

消耗過多：糖尿病，甲亢等30十一月202234白蛋白降低：30十一月202235球蛋白增加：感染，多發(fā)性骨髓瘤，自身免疫性疾病等球蛋白降低：皮質(zhì)功能亢進(jìn)，免疫缺陷病30十一月202235球蛋白增加：球蛋白降低：30十一月202236肝?。篈,α2-G,β-G,α1-G,γ-G，A/G下降甚至倒置腎?。涸缙冢哼x擇性蛋白尿，Mw較小蛋白質(zhì)丟失，含量下降。如白蛋白后期：非選擇性蛋白尿，Mw較小的蛋白質(zhì)丟失，含量下降分子量較大的蛋白質(zhì)（如γ-球蛋白）丟失，含量下降30十一月202236肝病：腎?。?0十一月202237【實驗思考】1．電泳時，點樣端置于電場的正極還是負(fù)極？為什么？2．電泳后，泳動在最前面的是何種蛋白質(zhì)？各譜帶為何種成分？請分析原因30十一月202237【實驗思考】1．電泳時，點樣端置于30十一月202238【常見問題及原因】1.電泳圖譜不齊：點樣時血清滴加不均2.電泳圖譜出現(xiàn)條痕：點樣后薄膜過干，或電泳槽密閉性不良，或電流過大，造成水分蒸發(fā)薄膜干燥3.分離不良：標(biāo)本滴加過多4.區(qū)帶過于緊密：緩沖液離子強度大于0.07530十一月202238【常見問題及原因】1.電泳圖譜不30十一月2022395.區(qū)帶拖尾：緩沖液離子強度小于0.056.染色后清蛋白中間色淺：染色時間不足，或清蛋白量過高減少樣品用量或延長染色時間30十一月2022395.區(qū)帶拖尾：緩沖液離子強度小于030十一月202240celluloseacetatemembraneelectrophoresis實驗四血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳30十一月20221celluloseacetate30十一月202241【實驗?zāi)康摹?/p>

掌握電泳法分離血清蛋白質(zhì)的原理掌握血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的操作方法及臨床意義30十一月20222【實驗?zāi)康摹空莆针娪痉ǚ蛛x血清蛋30十一月202242電泳：帶電粒子在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象電泳技術(shù)：利用電泳現(xiàn)象對混合物進(jìn)行分離分析的技術(shù)【實驗原理】30十一月20223電泳：帶電粒子在電場的作用下，向著與30十一月202243H＋OH－H＋OH－pH>pIpH=pIpH<pI30十一月20224H＋OH－H＋OH－pH>pI30十一月202244電泳速度:帶電粒子在電場中運動時，單位電場強度內(nèi)粒子運動的速度，以u表示，即

V—粒子運動的速度X—電場強度Q—粒子所帶電荷r—粒子的半徑η—介質(zhì)的粘度30十一月20225電泳速度:帶電粒子在電場中運動時，單30十一月202245影響電泳速度的因素1.樣品本身：分子形狀：形狀越小，與支持物介質(zhì)摩擦越小，u越大。球形分子>纖維狀分子Q越多，u越大；分子小，r越小，u越大；30十一月20226影響電泳速度的因素1.樣品本身：分子30十一月2022462.緩沖溶液：pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大離子強度(I)：

I越大，電動電勢越小，u越??；

I越小，電動電勢越大，u越大，但樣品易擴散。離子強度如果過低，緩沖液的緩沖容量小，不易維持pH恒定

選擇離子強度時要兩者兼顧，一般離子強度的選擇范圍在0.02～0.2之間。30十一月202272.緩沖溶液：pH值：(pH-pI)30十一月202247電場強度：電泳支持物上每厘米的電位降，也稱電勢梯度。3.電場強度(X)X越大，u越快。支持物越短，X越大，u越快。

電場強度越大或支持物越短，電流將隨之增加，產(chǎn)熱也增加，影響分離效果。在進(jìn)行高壓電泳的時候必須用冷卻裝置，否則可引起蛋白質(zhì)等樣品發(fā)生熱變性而無法分離30十一月20228電場強度：電泳支持物上每厘米的電位降30十一月2022484.支持介質(zhì)：①纖維薄膜(玻璃纖維薄膜，醋酸纖維薄膜)②凝膠(瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠)30十一月202294.支持介質(zhì)：①纖維薄膜(玻璃纖維薄30十一月202249負(fù)極正極－－－－－－－－表面帶負(fù)電荷帶正電荷的水層攜帶粒子向負(fù)極移動

如果樣品原本是移向負(fù)極的，則泳動的速度加快；如果樣品原本是移向正極的，則泳動的速度減慢。電滲作用：電滲：在電場作用下液體對固體支持物相對移動的現(xiàn)象。＋＋＋＋＋＋＋＋以紙電泳為例:30十一月202210負(fù)極正極－－－－－－－30十一月202250區(qū)帶電泳的分類（一）支持物物理性狀1．濾紙及其它纖維(如玻璃纖維、醋酸纖維、聚氯乙烯纖維薄膜)電泳2．粉末電泳：如纖維素粉、淀粉電泳；3．凝膠電泳：如瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳；4．絲線電泳：尼龍絲、人造絲電泳。30十一月202211區(qū)帶電泳的分類30十一月202251（二）支持物裝置形式：1．平板式電泳：支持物水平放置；2．垂直板式電泳：聚丙烯酰胺凝膠可做成垂直板式電泳；3．垂直柱式電泳：聚丙烯酰胺盤狀電泳30十一月202212（二）支持物裝置形式：1．平板式電30十一月202252(三)pH連續(xù)性：1．連續(xù)pH電泳：即整個電泳過程pH保持不變，如常用的紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳等。2．非連續(xù)pH電泳：緩沖液和電泳支持物間有不同的pH的電泳，如聚丙烯酰胺凝膠盤狀電脈，等電聚焦電泳等30十一月202213(三)pH連續(xù)性：30十一月202253

醋酸纖維薄膜為支持物

pH=8.6的巴比妥緩沖液血清蛋白的pI均小于8.6

負(fù)電荷電泳時向正極移動由于遷移率不同而被分離30十一月202214醋酸纖維薄膜為支持物30十一月202254γβα2α1清蛋白

分子越小，泳動速度越快帶電量越多，泳動速度越快30十一月202215γβα30十一月202255膜條經(jīng)過氨基黑10B染色后顯出清晰色帶。2.定性,定量各色帶蛋白質(zhì)含量與染料結(jié)合量基本成正比?？蓪⒏魃珟Ъ糸_，分別溶于堿性溶液中。用分光光度法計算各種蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。30十一月2022162.定性,定量30十一月202256醋酸纖維薄膜：醋酸纖維加工的細(xì)密且薄的微孔膜廣泛應(yīng)用醫(yī)學(xué)臨床各種生物分子的分離分析

血清蛋白、血紅蛋白、球蛋白脂蛋白、糖蛋白甲胎蛋白、類固醇及同工酶等30十一月202217醋酸纖維薄膜：血清蛋白、血紅蛋30十一月202257優(yōu)點：簡單快速缺點分辨率較低（聚丙烯酰胺凝膠電泳，PAGE）不適于制備（薄膜厚度約10～100μm，樣品用量很少）30十一月202218優(yōu)點：30十一月202258【器材及試劑】1、器材：醋酸纖維薄膜（2×8cm）常壓電泳儀竹鑷點樣器人血清或雞血清粗濾紙2、試劑：巴比妥緩沖液氨基黑10B0.25染色液漂洗液透明液30十一月202219【器材及試劑】1、器材：2、試劑：30十一月202259[操作]（一）儀器與薄膜的準(zhǔn)備1、醋酸纖維素薄膜的潤濕與選擇2.電泳槽的準(zhǔn)備3、電極槽的平衡30十一月202220[操作]（一）儀器與薄膜的準(zhǔn)備1、30十一月202260（二）點樣

取出薄膜，無光澤面向上平放在濾紙上點樣區(qū)距陰極端1.5cm

血清均勻涂在點樣器表面將點樣器輕輕印在點樣區(qū)內(nèi)，使血清完全滲透至薄膜內(nèi)形成一定寬度、粗細(xì)均勻的直線

實驗的關(guān)鍵，是獲得具有清晰區(qū)帶的電泳圖譜的重要環(huán)節(jié)30十一月202221（二）點樣取出薄膜，無光澤面向上30十一月202261（三）電泳

點樣端薄膜平貼陰極電泳槽支架濾紙橋(點樣面朝下)

另一端平貼在陽極端支架

要求：薄膜緊貼濾紙橋并繃直，薄膜之間相隔幾毫米蓋電泳槽蓋，平衡10min

打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電流強度為0.3mA/片，通電10min

調(diào)節(jié)電流強度為0.5mA/片，電泳60~90min

電泳后調(diào)節(jié)旋鈕電流為O，關(guān)閉電泳儀切斷電源30十一月202222（三）電泳點樣端薄膜平貼陰極電泳30十一月202262DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYY-Ⅲ型電泳槽30十一月202223DYY-5型穩(wěn)壓DYY-Ⅲ型30十一月20226330十一月20222430十一月20226430十一月20222530十一月202265【實驗注意事項】

不要用手觸摸纖維素膜注意區(qū)分醋酸纖維素薄膜的光面和毛面點樣位置要在1.5厘米以內(nèi)，不要距邊緣太近不要重復(fù)點樣膜放進(jìn)電泳槽時，將點樣面向下，點樣端靠近陰極30十一月202226【實驗注意事項】不要用手觸摸纖30十一月202266

用點樣器點樣時不要點的太多，但也不能太少線條均勻，用力水平。電泳槽放膜條支架上盡量不要有緩沖液30十一月202227用點樣器點樣時不要點的太多，但也30十一月202267（四）染色和漂洗

取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min

自來水沖洗，漂洗液漂洗更換3次漂洗液，脫去顏色，得到色帶清晰的電泳圖譜30十一月202228（四）染色和漂洗取出薄膜，直接30十一月202268【實驗結(jié)果】繪出電泳圖譜并標(biāo)明各條帶含義30十一月202229【實驗結(jié)果】繪出電泳圖譜并標(biāo)明各條30十一月20226930十一月20223030十一月202270臨床意義

血漿蛋白是血漿最主要的固體成分，含量60～80g/L

絕大部分由肝臟合成，僅γ球蛋白由漿細(xì)胞合成

正常值： 白蛋白57％~72％，α1球蛋白2％~5％

α2球蛋白4％~9％，β球蛋白6.5％~12％

γ球蛋白12％—20％30十一月202231臨床意義血漿蛋白是血漿最主要的30十一月202271可能相關(guān)疾病清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白骨髓瘤↑*腎病綜合癥↓↑*↑*腎炎↑*↑肝硬化↓↑*急性肝壞死↓*↑↑↑↑傳染性肝炎↓↑*↑*急性感染初期↑*↑*↑*慢性炎癥/感染后期↑*低