1酵母雜交系統(tǒng)

酵母雜交系統(tǒng)是研究蛋白質(zhì)間相互作用的一種分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)相互作用的方法，如蛋白質(zhì)親和層析、親和印跡、免疫沉淀，反映的只是蛋白的體外相互作用。所以酵母雜交系統(tǒng)在研究蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域就有其重要地位和作用。

酵母雜交系統(tǒng)的分類酵母單雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)反向雜交酵母三雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song等首先在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立質(zhì)粒和菌株質(zhì)粒：誘餌質(zhì)粒pHIS2，文庫質(zhì)粒為pGATD7-rec2誘餌質(zhì)粒上連接有目標(biāo)靶序列，最小啟動(dòng)子和報(bào)告基因文庫質(zhì)粒則和反轉(zhuǎn)錄得到的真核生物cDNA連接，可以表達(dá)AD雜合蛋白酵母菌株：Y187GAL4基因是缺失型的；基因組中引入額外的報(bào)告基因LEU、TRP、HIS

Intheabsenceofbaitprotein,theAD/libraryfusionproteincannotbindtotheGAL4UASandthusdoesnotactivatetranscription.BInteractionbetweenthebaitandlibraryproteinsinvivoaactivatestranscriptionofThereportergene.

C

雙雜交系統(tǒng)是由Fields和Song于1989年提出的。它的建立是基于對真核生物掉空轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識(shí)，細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。轉(zhuǎn)錄激活因子，例如酵母轉(zhuǎn)錄因子Gal4，在結(jié)構(gòu)上是組件式的（modular），往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上結(jié)構(gòu)上可以分開、功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域（domain）構(gòu)成。其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNAbondingdomain,DNA-BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activationdomain,DNA-AD〉。這兩個(gè)結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_時(shí)仍分別具有功能，但是不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)兩者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時(shí)，才呈現(xiàn)完整的轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活上游激活序列（uostreamactivatingsequence,UAS）的下游啟動(dòng)子，使啟動(dòng)子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。

天然Gal4分子由一條多肽鏈組成，含881個(gè)氨基酸。它有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合域（DNA-bindingdomain,BD），由位于N-末端的1~147個(gè)氨基酸構(gòu)成，能夠識(shí)別位于Gal1基因的上游激活序列（upstreamactivatingsequence，UAS），此外，在其N-端還具有一段核定位序列；轉(zhuǎn)錄激活域（DNA-activating,AD），由位于C-末端的768~881位氨基酸構(gòu)成。當(dāng)Gal4的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域位于不同肽鏈上，只要它們在空間上充分接近，則能夠恢復(fù)Gal4作為轉(zhuǎn)錄因子的活性。圖1雙雜交系統(tǒng)工作原理示意圖

Fig.1

ModeloftranscriptionalactivationbyreconstitutionofGal4activity

a.天然Gal4蛋白具有DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域，誘導(dǎo)Gal1-LacZ轉(zhuǎn)錄；

b.只有DNA結(jié)合域（上）或轉(zhuǎn)錄激活域（下）的雜合蛋白不能激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄；

c.蛋白X和Y之間的相互作用使Gal4的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域接近導(dǎo)致報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄

a.thenativeGal4proteincontainsbothDNA-bindingandactivatingregionsandinducesGal1-LacZtranscription;

b.hybridscontainingeitherDB(upper)orAD(lower)areincapableofinducingtranscription;

c.aprotein-proteininteractionbetweenproteinsXandYbringstheGal4domainsintoclosesproximityandresultsintranscriptionalactivity圖2普通雙雜交系統(tǒng)的組成示意圖

一般地，將DB-X的融合蛋白稱作誘餌（bait），X往往是已知蛋白；AD-Y稱作獵物（prey），Y稱作獵物；整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程稱作“狩獵”（hunt或fish）

酵母雙雜交系統(tǒng)的基本原理獵物表達(dá)載體a.

VP16來自于單純皰疹病毒，它的轉(zhuǎn)錄激活活性高于其他兩個(gè)；酵母Gal4的轉(zhuǎn)錄激活域；c.

B42來自E.coli，轉(zhuǎn)錄激活活性弱，可以緩和有毒性的基因表達(dá)對細(xì)胞的影響，并且在B42后有流感病毒HA抗原，易于將蛋白分離純化針對非核內(nèi)蛋白質(zhì)

在酵母雙雜交系統(tǒng)中，BD-X和AD-Y在酵母細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生相互作用，表達(dá)的融合蛋白需要定向到核內(nèi)來激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，這就可能限制了大量非核內(nèi)蛋白質(zhì)，如膜蛋白，分泌蛋白，膜受體及胞質(zhì)蛋白等在此系統(tǒng)中的應(yīng)用。針對這個(gè)問題，發(fā)展了其它方法。SOS恢復(fù)系統(tǒng)（sosrecruitmentsystem,SRS）是針對于膜受體，細(xì)胞外分泌蛋白的一種方法。酵母的溫度敏感株，ras途徑突變體，由于缺乏鳥苷酸交換因子（guanylnucleotideexchangefactor,GEF）cdc25-2，所以不能將外來信號(hào)傳遞給膜上的RAS蛋白，致使酵母突變體在36℃不能存活。如果引入正常SOS蛋白，使SOS蛋白與RAS接近則可以使細(xì)胞存活。Arpnheim等將GEF蛋白（SOS蛋白）與X融合，蛋白Y與豆蔻?；盘?hào)融合，使Y定位于膜上。這樣，若X與Y結(jié)合，則X連同的SOS蛋白就會(huì)定位于膜上而靠近膜上的RAS蛋白，激活ras途徑，完成SOS過程，能在36℃下生長（圖3）。這一系統(tǒng)的建立沖破了許多的局限。圖3

SOS恢復(fù)系統(tǒng)Fig.3

SOSrecruitmentsystem三雜交系統(tǒng)

兩個(gè)蛋白之間通過第三者發(fā)生相互作用。第三物可以是蛋白質(zhì)、小分子或RNA。

酵母三雜交系統(tǒng)

通過小分子（配體）相互作用的三雜交系統(tǒng)（圖5），小分子與其受體的相互作用不僅是許多生物學(xué)過程的基礎(chǔ)，而且在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有重要的價(jià)值。通過小分子（配體）相互作用的三雜交系統(tǒng)圖5通過小分子的三雜交系統(tǒng)Fig.5smallligands-dependentthree-hybridsystemGlucoroticoid—地塞米松;Glucoroticoidreceptor—糖皮質(zhì)激素受體

Licitra等利用FK506與地塞米松雜合分子，將與LexA-BD融合的糖皮質(zhì)激素受體及雜合分子作為誘餌，用于篩選與AD融合的JurkatcDNA文庫，分離了與FK506結(jié)合的蛋白FKBP12。圖6

RNA介導(dǎo)的三雜交系統(tǒng)Fig.6

RNA-dependentthree-hybridsystemRNAbindingdomain1：RNA結(jié)合域1;RNAbindingdomain2：RNA結(jié)合域2;HybridRNA：RNA雜合分子

在這個(gè)系統(tǒng)中，與AD融合的蛋白是一個(gè)具有RNA結(jié)合域的蛋白（如細(xì)菌MS2），能夠與RNA分子的臂-環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合；RNA除具有臂-環(huán)結(jié)構(gòu)外，還有誘餌序列（test）。這樣RNA分子與DB-蛋白復(fù)合物構(gòu)成了雙雜交系統(tǒng)中的誘餌，它結(jié)合于報(bào)告基因的上游；第3個(gè)分子是AD-蛋白，如果該蛋白識(shí)別誘餌序列test并結(jié)合，則報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄。該系統(tǒng)用于確定識(shí)別目的RNA的蛋白質(zhì)的RNA結(jié)合域，也可以研究被已知蛋白質(zhì)識(shí)別的RNA序列。利用這個(gè)系統(tǒng)成功地發(fā)現(xiàn)了許多RNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。包括鐵離子調(diào)節(jié)蛋白與鐵反應(yīng)元件的結(jié)合[12]；HIV翻譯激活因子Tat與Tar反應(yīng)元件RNA序列的結(jié)合等酵母單雜交系統(tǒng)酵母單雜交是根據(jù)DNA結(jié)合蛋白(即轉(zhuǎn)錄因子)與DNA順式作用元件結(jié)合調(diào)控報(bào)道基因表達(dá)的原理，克隆與靶元件特異結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子基因(cDNA)的有效方法。其