學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精PAGE23-學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精第2課時(shí)基因工程的實(shí)施過程1．簡述基因工程的一般過程。2．理解獲取目的基因的方法。(重、難點(diǎn)）3．掌握將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法。(重點(diǎn))4．掌握目的基因的檢測和鑒定方法。(重點(diǎn))知識點(diǎn)一｜獲取目的基因和構(gòu)建基因表達(dá)載體1．獲取目的基因(1)通過基因文庫獲取目的基因:①基因文庫的含義：將某種生物細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA切割成大小合適的片段，分別與載體連接起來，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因.這個(gè)受體菌群體就被稱為基因文庫。②種類：a．基因組文庫：含有一種生物所有的基因。b．部分基因文庫：含有一種生物的一部分基因。（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因:①原理：DNA分子半保留復(fù)制。②場所：生物體外（PCR儀）。③優(yōu)點(diǎn):操作簡單、容易掌握、結(jié)果可靠、能在較短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增。④發(fā)明家：美國科學(xué)家穆里斯。(3）通過化學(xué)方法直接人工合成目的基因:①儀器：DNA合成儀。②基因特點(diǎn)：比較小、脫氧核苷酸序列已知.2．構(gòu)建基因表達(dá)載體(1)目的：使目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞并有效表達(dá)，能穩(wěn)定存在且遺傳給后代。(2)組成：一個(gè)基因表達(dá)載體除了目的基因外，還應(yīng)包括啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等.eq\a\vs4\al（［合作探討]）基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心，下面圖1為基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程圖，圖2為基因表達(dá)載體模式圖。請據(jù)圖分析:圖2探討eq\a\vs4\al(1）：圖1中的①是什么物質(zhì)?切割目的基因和載體要選用同一種①嗎?為什么？提示：圖1中①是限制性核酸內(nèi)切酶。要，因?yàn)椋哼x用同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割會(huì)產(chǎn)生相同的黏性末端，可以在DNA連接酶的作用下將切割的目的基因和載體連接起來.探討eq\a\vs4\al(2）：圖1中②是什么物質(zhì)？試探討用②連接目的基因和載體DNA時(shí)產(chǎn)生幾種可能的連接方式?哪一種是符合要求的連接方式。提示：圖1中②是DNA連接酶?？赡苡?種連接方式，即目的基因和目的基因相連、載體DNA和載體DNA相連、目的基因和載體DNA相連。其中符合要求的是目的基因和載體DNA相連形成的重組DNA分子。探討eq\a\vs4\al（3）:圖2中的抗生素抗性基因?qū)儆谑裁椿颍磕芊駥⒛康幕虿迦朐摶蛑?？為什么？提示：?biāo)記基因.不能.標(biāo)記基因用于鑒定受體細(xì)胞是否成功導(dǎo)入目的基因，以便將含目的基因的細(xì)胞篩選出來，若有目的基因插入，則標(biāo)記基因被破壞，無法進(jìn)一步篩選。eq\a\vs4\al(［思維升華］)1．獲取目的基因(1）來源。目的基因可以從自然界中已有的物種中分離出來，也可以用人工方法合成。(2）具體方法。①從已有的物種中分離：從基因文庫中提取目的基因.②化學(xué)合成法:對于比較小,核苷酸序列已知的目的基因一般用人工合成的方法。如已知氨基酸序列，合成DNA。eq\x(蛋白質(zhì)的氨基酸序列）eq\o（→，\s\up10(推測)）eq\x(mRNA的核苷酸序列)eq\o（→,\s\up10(推測）)eq\x(結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列)eq\o（→,\s\up10(化學(xué)）,\s\do10（合成))eq\x(目的基因）③反轉(zhuǎn)錄法：它是以目的基因的mRNA為模板，合成堿基互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈DNA。eq\x（目的基因的mRNA）eq\o（→,\s\up10（反轉(zhuǎn)錄）)eq\x(單鏈DNA)eq\o(→,\s\up10(合成））eq\x（雙鏈DNA即目的基因)④利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因.a．PCR的含義：一項(xiàng)在生物體外通過酶促反應(yīng)有選擇地大量擴(kuò)增目的基因或DNA序列的技術(shù)。b．目的：短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因或DNA序列.c．原理:DNA分子半保留復(fù)制。d．特點(diǎn)：操作簡單、易掌握、結(jié)果可靠，能在短時(shí)間內(nèi)大量復(fù)制目的基因或DNA序列。e．步驟：第一步，向離心管加入模板、原料、引物及TaqDNA聚合酶。第二步，加熱至94℃，雙鏈DNA解旋為單鏈DNA。第三步，冷卻至55℃，引物與兩條單鏈DNA上的特定部位相互配對。第四步,加熱至72℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶)從引物起始進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成。如此重復(fù)循環(huán)多次。f．特點(diǎn)：指數(shù)形式擴(kuò)增.2．PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因與DNA復(fù)制的比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原則堿基互補(bǔ)配對原料四種脫氧核苷酸條件模板、ATP、酶不同點(diǎn)解旋方式DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化場所體外復(fù)制細(xì)胞核內(nèi)酶熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶)細(xì)胞內(nèi)含有的DNA聚合酶結(jié)果在短時(shí)間內(nèi)形成大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子[特別提醒]提取目的基因的三種方法的應(yīng)用情況(1）如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通過構(gòu)建基因文庫的方法，即通過用受體菌儲存并擴(kuò)增目的基因后,從基因文庫中獲取目的基因。(2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比較小,可以通過DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成。(3)如果知道擴(kuò)增目的基因及兩端的核苷酸序列，而且基因又比較大，則可以通過PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。3．構(gòu)建基因表達(dá)載體(1)基因表達(dá)載體結(jié)構(gòu)(2）分析①啟動(dòng)子：一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于目的基因上游的一段核苷酸序列,是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位.②目的基因：編碼相關(guān)蛋白質(zhì)，并形成基因工程產(chǎn)品或產(chǎn)生新的生物性狀.③終止子：一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于目的基因的尾端,作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止。④標(biāo)記基因：一般為抗生素抗性基因或熒光蛋白基因等，其作用是鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因（或目的基因是否導(dǎo)入成功)。（3)基因表達(dá)載體的功能將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并使之有效表達(dá).（4)基因表達(dá)載體的構(gòu)建步驟①用同一種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，使其產(chǎn)生相同末端。②將切下的目的基因片段與切開的質(zhì)粒混合，再加入適量DNA連接酶，使目的基因插入質(zhì)粒的切口處，形成一個(gè)重組DNA分子(重組質(zhì)粒）。［特別提醒］啟動(dòng)子和終止子、起始密碼子與終止密碼子的區(qū)別（1)啟動(dòng)子和終止子都在DNA上，在遺傳信息轉(zhuǎn)錄時(shí)起作用。啟動(dòng)子是啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的開始，終止子是DNA分子上決定轉(zhuǎn)錄停止的一段DNA序列,其組成單位都是脫氧核苷酸。(2)起始密碼子和終止密碼子都是mRNA上的三個(gè)相鄰堿基。起始密碼子決定翻譯的開始，終止密碼子決定翻譯的停止。1．下列屬于獲取目的基因的方法的是(）①利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成②從基因文庫中提?、蹚氖荏w細(xì)胞中提取④利用PCR技術(shù)⑤利用DNA轉(zhuǎn)錄⑥人工合成A．①②③⑤ B．①②⑤⑥C．①②③④ D．①②④⑥【解析】獲取目的基因的方法包括從基因文庫中獲取目的基因、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因和利用DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成。目的基因?qū)儆谕庠椿?，不能從受體細(xì)胞中提取,利用DNA轉(zhuǎn)錄合成的是RNA，不是目的基因?！敬鸢浮緿2．下圖為某種質(zhì)粒表達(dá)載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，ampr為青霉素抗性基因,tetr為四環(huán)素抗性基因，P為啟動(dòng)子，T為終止子，ori為復(fù)制原點(diǎn)。已知目的基因的兩端分別有包括EcoRⅠ,BamHⅠ在內(nèi)的多種酶的酶切位點(diǎn)。據(jù)圖回答：(1)將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒分別用EcoRⅠ酶切，酶切產(chǎn)物用DNA連接酶進(jìn)行連接后,其中由兩個(gè)DNA片段之間連接形成的產(chǎn)物有___________________、____________、____________三種.（2)用上述三種連接產(chǎn)物與無任何抗藥性的原核宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。之后將這些宿主細(xì)胞接種到含四環(huán)素的培養(yǎng)基中，能生長的原核宿主細(xì)胞所含有的連接產(chǎn)物有____________;若接種到含青霉素的培養(yǎng)基中，能生長的原核宿主細(xì)胞所含有的連接產(chǎn)物有____________.(3）目的基因表達(dá)時(shí),RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點(diǎn)是____________，其合成的產(chǎn)物是____________。(4)在上述實(shí)驗(yàn)中,為了防止目的基因和質(zhì)粒在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，酶切時(shí)應(yīng)選用的酶是__________________.【解析】（1)將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒分別用EcoRⅠ酶切，所產(chǎn)生的黏性末端相同，用DNA連接酶處理后，不同的片段隨機(jī)結(jié)合,可形成3種不同的連接物：目的基因——目的基因、目的基因——載體、載體-—載體。(2）在上述三種產(chǎn)物中，插入目的基因的都不能在四環(huán)素培養(yǎng)基上生長,只有載體——載體連接產(chǎn)物才能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長。（3)啟動(dòng)子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點(diǎn)，可啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程，合成mRNA。（4)由圖示和題目中提供的信息可知，同時(shí)運(yùn)用EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行酶切可有效防止酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接?！敬鸢浮浚?)目的基因-—載體連接物載體—-載體連接物目的基因--目的基因連接物（2)載體——載體連接物目的基因——載體連接物、載體-—載體連接物(3）啟動(dòng)子mRNA（4）EcoRⅠ和BamHⅠ知識點(diǎn)二｜目的基因的導(dǎo)入、檢測和鑒定1．導(dǎo)入目的基因(1)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞最常用的是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法.（2)將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞常用的是顯微注射法。(3)將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞常用的方法是Ca2＋處理法.2．檢測和鑒定目的基因（1）從DNA水平檢測：DNA分子雜交法。（2）從RNA水平檢測重組體：分子雜交技術(shù)。(3）從蛋白質(zhì)水平檢測：抗原—抗體雜交。(4)從個(gè)體水平對其生物學(xué)特定性狀進(jìn)行檢測。eq\a\vs4\al(［合作探討])將蘇云金芽孢桿菌（圖一)的毒蛋白基因提取出來導(dǎo)入普通棉花(圖二)細(xì)胞可培育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉（圖三）.請依據(jù)以上內(nèi)容探究下列問題。探討eq\a\vs4\al(1):為什么植物的體細(xì)胞可以作為受體細(xì)胞,而動(dòng)物的體細(xì)胞不能作為受體細(xì)胞?提示:植物細(xì)胞的全能性較高，可經(jīng)植物組織培養(yǎng)過程成為完整植物體,因此受體細(xì)胞可以是受精卵也可以是體細(xì)胞;動(dòng)物體細(xì)胞全能性受到限制，不能發(fā)育為一個(gè)新個(gè)體，因此動(dòng)物基因工程中的受體細(xì)胞一般是受精卵。探討eq\a\vs4\al（2）：從細(xì)胞器的功能上分析,若通過基因工程生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌作受體細(xì)胞嗎?提示：不可以。糖蛋白上的糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加工完成的，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌是原核生物，細(xì)胞中不含有這兩種細(xì)胞器。探討eq\a\vs4\al(3）：檢測棉花中導(dǎo)入的抗蟲基因是否表達(dá)的最簡便的方法是什么？提示：用葉片飼養(yǎng)棉鈴蟲，觀察棉鈴蟲是否死亡。探討eq\a\vs4\al（4）：DNA分子雜交的原理是什么？有哪些應(yīng)用？提示：堿基互補(bǔ)配對原則.可用于親子鑒定、刑事偵查、生物親緣關(guān)系鑒定等。eq\a\vs4\al([思維升華］)1．導(dǎo)入目的基因目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法。細(xì)胞類型方法轉(zhuǎn)化過程特點(diǎn)植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法目的基因插入Ti質(zhì)粒的T。DNA上→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→插入植物細(xì)胞中的染色體DNA上→目的基因表達(dá)經(jīng)濟(jì)、有效,適用于雙子葉植物和裸子植物動(dòng)物細(xì)胞顯微注射法目的基因表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物最為有效的將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞的方法微生物細(xì)胞Ca2＋處理法Ca2＋處理微生物細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→將基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合在緩沖液中→一定溫度下促使感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子簡便、經(jīng)濟(jì)、有效［特別提醒］（1)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞培育轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，受體細(xì)胞可以是體細(xì)胞和受精卵，因?yàn)橹参矬w細(xì)胞具有全能性。(2)將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，受體細(xì)胞是受精卵，不能用體細(xì)胞,因?yàn)楦叨确只膭?dòng)物體細(xì)胞的全能性受到限制。(3)微生物細(xì)胞作為受體細(xì)胞具有繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對較少等優(yōu)點(diǎn)。（4)將基因表達(dá)載體（重組質(zhì)粒）導(dǎo)入農(nóng)桿菌的常用方法是Ca2＋處理法。Ca2＋（CaCl2溶液）對微生物細(xì)胞的作用是增加細(xì)胞壁的通透性。2．檢測和鑒定目的基因檢測水平檢測內(nèi)容方法結(jié)果顯示分子水平的檢測檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體上是否插入了目的基因DNA分子雜交技術(shù)（基因探針＋轉(zhuǎn)基因生物的DNA）是否顯示出雜交帶檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄分子雜交技術(shù)（基因探針＋轉(zhuǎn)基因生物的mRNA)是否顯示出雜交帶檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交是否顯示出雜交帶個(gè)體水平的檢測包括抗蟲、抗病的接種實(shí)驗(yàn),以確定是否有抗性及抗性程度；基因工程產(chǎn)品需要與天然產(chǎn)品進(jìn)行活性比較等[特別提醒]不同分子檢測的原理、場所、探針的異同(1）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的檢測原理與復(fù)制水平的檢測原理是相似的,只是被檢測的物質(zhì)不再是轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA，而是轉(zhuǎn)基因生物的細(xì)胞內(nèi)的mRNA；進(jìn)行翻譯水平的檢測，則是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理。（2)不論是復(fù)制水平、轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平的檢測,都是在體外進(jìn)行的。（3)在DNA分子，mRNA分子上檢測目的基因是否插入、目的基因是否轉(zhuǎn)錄時(shí)，用的探針都是放射性同位素等標(biāo)記的含有目的基因的DNA片段.1．基因工程中科學(xué)家常采用細(xì)菌、酵母菌等微生物作為受體細(xì)胞，主要原因是()A．結(jié)構(gòu)簡單，操作方便 B．繁殖速度快C．遺傳物質(zhì)含量少 D．性狀穩(wěn)定,變異少【解析】目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，隨著受體細(xì)胞的繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌等微生物繁殖速度非?？?，在很短的時(shí)間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。因此,基因工程常用的受體細(xì)胞有細(xì)菌、真菌等?！敬鸢浮緽2．科學(xué)家通過基因工程方法，將蘇云金芽孢桿菌的Bt毒蛋白基因轉(zhuǎn)入普通棉株細(xì)胞內(nèi)，并成功實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，從而培育出了能抗棉鈴蟲的棉花植株—-抗蟲棉。其過程大致如圖所示。根據(jù)題意,回答下列問題。(1)基因工程操作程序的一般步驟是____________、____________、____________、________。(2)Ti質(zhì)粒是農(nóng)桿菌中的一種質(zhì)粒，其上有T。DNA，把目的基因插入Ti質(zhì)粒的T。DNA中是利用T。DNA的______________的特點(diǎn)。（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法有很多種,該題中涉及的是______________。（4）若目的基因能在棉株體內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)，主要是因?yàn)開____________，分子水平檢測目的基因是否表達(dá)的方法是______________?！窘馕觥勘绢}以抗蟲棉的培育為背景，考查了運(yùn)用基因工程技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因作物的步驟、方法。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的常用方法,利用它能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物,以及其Ti質(zhì)粒上的T。DNA能轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體DNA上的特點(diǎn)，可以把目的基因插入其Ti質(zhì)粒的T-DNA中，借助其作用使目的的基因成功導(dǎo)入受體細(xì)胞?！敬鸢浮?1）獲取目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體導(dǎo)入目的基因檢測和鑒定目的基因（2）可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并且整合到受體細(xì)胞染色體DNA上(3）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(4)目的基因插入了受體細(xì)胞的染色體DNA中抗原—抗體雜交［課堂小結(jié)]知識網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建核心語句歸納1.基因工程的操作步驟:獲取目的基因→構(gòu)建基因表達(dá)載體→目的基因的導(dǎo)入→目的基因的檢測與鑒定2.獲取目的基因的三種方法：基因文庫直接獲得、PCR擴(kuò)增、人工合成。3.基因表達(dá)載體的構(gòu)成：目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因等.4.導(dǎo)入目的基因的方法有：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法、Ca2＋處理法。5.檢測目的基因的方法:DNA分子雜交法、DNA-RNA分子雜交、抗原—抗體雜交、個(gè)體水平檢測.1．下列不屬于獲取目的基因的方法的是(）A．利用DNA連接酶復(fù)制目的基因B．化學(xué)方法直接合成C．從基因文庫中獲取目的基因D．利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因【解析】本題考查目的基因的獲取方法及DNA聚合酶和DNA連接酶的區(qū)別。對目的基因(DNA片段）進(jìn)行復(fù)制需利用DNA聚合酶而不是DNA連接酶?！敬鸢浮緼2．基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對的是()A．目的基因與載體的結(jié)合B．將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞C．目的基因的表達(dá)D．目的基因的人工合成【解析】合成目的基因及其與載體的結(jié)合都有堿基互補(bǔ)配對過程，而將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞是通過載體的運(yùn)輸作用進(jìn)入的，不存在堿基互補(bǔ)配對過程?！敬鸢浮緽3．要檢測目的基因是否成功地插入受體DNA中，需要用核酸探針，核酸探針是指（）A．用于檢測疾病的醫(yī)療器械B．用放射性同位素或熒光分子等標(biāo)記的DNA分子C．合成β。球蛋白的DNAD．合成苯丙羥化酶的DNA片段【解析】核酸探針是指已知核苷酸序列的DNA片段(實(shí)際上是單鏈），為了便于對雜交結(jié)果進(jìn)行檢測，需要對其做放射性同位