2022/12/51藥物敏感性試驗(yàn)方法

(AntimicrobialSusceptibilityTest)

北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室楊啟文2022/12/52何時(shí)需進(jìn)行細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)？

當(dāng)一細(xì)菌是需要抗微生物藥治療的某感染過(guò)程的病原菌，而其敏感性不能從細(xì)菌的種屬特性可靠地推知時(shí)，就需要進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。 當(dāng)病原菌被認(rèn)為是屬于對(duì)常用抗生素能產(chǎn)生耐藥的菌種時(shí)，更需進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。2022/12/53何時(shí)不需進(jìn)行細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)？若感染的性質(zhì)不清楚、標(biāo)本含數(shù)種混合生長(zhǎng)的菌或正常菌群，而且這些菌與正在治療的感染關(guān)系很小時(shí)，通常不必作藥敏試驗(yàn)，因?yàn)槠鋵?shí)驗(yàn)結(jié)果可能有誤導(dǎo)作用。若感染是由公認(rèn)的對(duì)高效藥物敏感的微生物引起，就很少需要作藥敏試驗(yàn)。2022/12/55菌－－藥敏方法

測(cè)試菌藥敏方法普通需氧菌和兼性厭氧菌紙片擴(kuò)散法(M2-A8)苛養(yǎng)菌瓊脂稀釋法

厭氧菌稀釋法

(M7-A6)宏量(2ml)

肉湯稀釋法微量(0.1ml)2022/12/56可選用的抗生素B－內(nèi)酰胺類（青霉素類、B-內(nèi)酰胺/B-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合藥、頭孢類、碳青酶烯類、單環(huán)B-內(nèi)酰胺類）糖肽類（主要針對(duì)G+菌）氨基糖苷類大環(huán)內(nèi)酯類（G+菌或苛養(yǎng)的G-菌）四環(huán)素類喹諾酮類磺胺類和甲氧芐啶單一藥物類（氯霉素、克林霉素、利福平、呋喃妥因）2022/12/572022/12/58A組：常規(guī)首選藥敏試驗(yàn)組合B組：包括一些臨床上重要的，特別是針對(duì)醫(yī)院內(nèi)感染的藥物。在下列情況時(shí)可以選擇性報(bào)告：(1)對(duì)A組同類抗生素耐藥時(shí)(2)特定的標(biāo)本來(lái)源（如三代頭孢對(duì)腦脊液中的腸道桿菌，TMP/SMZ對(duì)泌尿道中的分離菌株）（3)多種細(xì)菌感染（4)多部位感染（5)對(duì)A組藥過(guò)敏、耐受或無(wú)效的病例（6)為流行病學(xué)調(diào)查目的向感染控制組報(bào)告。C組：包括某些醫(yī)院需要測(cè)試的替代性或補(bǔ)充性抗生素（由于該地區(qū)存在對(duì)某些首選藥物耐藥的菌株）。U(Urine)組：僅用于尿道中分離細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)，其他部位的感染不用此組藥物進(jìn)行試驗(yàn)。O(Other)組：可能有臨床使用指征，但在美國(guó)不作為常規(guī)測(cè)試和報(bào)告。Inv(Investigational)組：目前正在進(jìn)行抗菌活性評(píng)估，還未被FDA批準(zhǔn)。2022/12/510－紙片擴(kuò)散法AST2022/12/512－紙片擴(kuò)散法ASTMH平皿的標(biāo)化（1）厚度4mm（2）pH7.2－7.4（pH過(guò)低，氨基糖苷類與大環(huán)內(nèi)脂類失活，青霉素類活性增強(qiáng)）（3）濕度（4）胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶（TMP/SMZ-ATCC29212,抑菌圈≥20mm）（5）二價(jià)陽(yáng)離子含量：影響氨基糖苷類對(duì)綠膿桿菌、四環(huán)素對(duì)所有細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。過(guò)低，活性增強(qiáng)；過(guò)高，活性減弱）（6）某些苛養(yǎng)菌，需要在MH瓊脂中添加其他物質(zhì)或使用其他培養(yǎng)基（7）若當(dāng)天不使用，儲(chǔ)存于2-8°C，七天內(nèi)使用。2022/12/514－紙片擴(kuò)散法AST接種物的標(biāo)化（1）接種物制備：生長(zhǎng)法（肉湯增菌）直接菌落懸滴法（檢測(cè)苛養(yǎng)菌的推薦方法）（2）0.5麥?zhǔn)蠁挝粷岫龋▽?duì)于大多數(shù)細(xì)菌：1-2×108CFU/ml)

0.5麥?zhǔn)蠁挝槐葷峁苤苽洌?/p>

0.5ml0.048mol/L的BaCl2＋99.5ml0.18mol/L的H2SO42022/12/515－紙片擴(kuò)散法AST操作步驟制備接種物（0.5麥?zhǔn)蠁挝唬┙臃N（15分鐘內(nèi)接種，涂抹均勻）在接種好的瓊脂平板上貼加紙片

孵育（15分鐘內(nèi)反轉(zhuǎn)平板，35°C空氣孵育）

苛養(yǎng)菌5％CO2孵育判度結(jié)果和解釋結(jié)果2022/12/516－紙片擴(kuò)散法AST判讀結(jié)果將游標(biāo)卡尺置于反轉(zhuǎn)的平板的背面，測(cè)量到最接近的整數(shù)毫米數(shù)。平板應(yīng)距離一個(gè)黑色不反光的背景數(shù)英寸，并用反射光照明。如果是加血的瓊脂培養(yǎng)基，則應(yīng)在透射光照射下，打開培養(yǎng)皿蓋，從上表面測(cè)量抑菌圈。如果被測(cè)菌是葡萄球菌或腸球菌，則應(yīng)孵育24小時(shí)，再在透射光下分別觀察苯唑西林或萬(wàn)古霉素的透明抑菌圈內(nèi)有無(wú)耐甲氧西林或耐萬(wàn)古霉素菌落的微弱生長(zhǎng)。2022/12/517－紙片擴(kuò)散法AST判讀結(jié)果如果在透明的抑菌圈內(nèi)有任何的單個(gè)菌落，則應(yīng)進(jìn)行二次培養(yǎng)，重新鑒定和重新試驗(yàn)。對(duì)于變形桿菌屬，在本該十分明顯的抑菌圈內(nèi)的薄紗樣蔓延生長(zhǎng)應(yīng)該忽略。對(duì)于TMP/SMZ，培養(yǎng)基內(nèi)的藥物拮抗劑可能使細(xì)菌能微弱地生長(zhǎng)，應(yīng)忽略微弱生長(zhǎng)（生長(zhǎng)菌膜的20％或更少），并且應(yīng)測(cè)量更為明顯的邊緣來(lái)決定抑菌圈的直徑。用加血培養(yǎng)基測(cè)試鏈球菌時(shí)，應(yīng)測(cè)量生長(zhǎng)受抑制的區(qū)域，而不是溶血受抑制的區(qū)域。2022/12/518－紙片擴(kuò)散法AST解釋結(jié)果抑菌圈大小的解釋參閱CLSI/NCCLS文件M100-S15，結(jié)果應(yīng)報(bào)告細(xì)菌對(duì)被測(cè)藥物敏感、中介或耐藥。敏感－－該菌株所致感染可以用推薦用于此型感染及病原菌的抗生素劑量、進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹委煟谴嬖诮砂Y。中介－－藥物在生理濃集的部位具有臨床效力（如尿液中的喹諾酮類和

B－內(nèi)酰胺類）或者可用高于正常劑量的藥物進(jìn)行治療（如B－內(nèi)酰胺類）。耐藥－－測(cè)試菌不能被在體內(nèi)感染部位可能達(dá)到的抗生素濃度所抑制，臨床治療無(wú)效。2022/12/520北京協(xié)和醫(yī)院2004年518株aba對(duì)IMP的抑菌圈直徑分布2022/12/521－紙片擴(kuò)散法AST質(zhì)控目的：監(jiān)測(cè)藥敏精密度和準(zhǔn)確度；監(jiān)測(cè)試劑質(zhì)量；監(jiān)測(cè)操作者水平。質(zhì)控菌：ATCC25922、ATCC27853、ATCC25923等只要平均抑菌圈直徑?jīng)]有發(fā)生由于方法錯(cuò)誤造成的有意義的改變，質(zhì)控培養(yǎng)物就可以一直用于監(jiān)測(cè)試驗(yàn)的精密度和準(zhǔn)確度。如果某意外結(jié)果提示該菌株的內(nèi)在敏感性發(fā)生改變，就應(yīng)該換用此質(zhì)控株的新培養(yǎng)物。2022/12/523－瓊脂稀釋法AST

請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)瓊脂稀釋法試驗(yàn)，獲得美羅培南對(duì)80株測(cè)試大腸桿菌的MIC值。

Q:2022/12/525－瓊脂稀釋法AST

準(zhǔn)備對(duì)倍稀釋的藥液準(zhǔn)備菌液制備含抗生素的瓊脂平皿點(diǎn)種菌液

孵育

讀MIC值

2022/12/526－瓊脂稀釋法AST抗生素用量計(jì)算W=母液濃度×母液體積/藥物純度

=(256ug/ml×25倍)×4ml/0.91母液濃度依各個(gè)試驗(yàn)具體情況而定2022/12/527－瓊脂稀釋法AST對(duì)倍稀釋藥液藥物的溶解液和稀釋液參照CLSI/NCCLSM100-S15文件用滅菌蒸餾水稀釋至最低濃度為0.004×25ug/ml(一般比質(zhì)控范圍低限低一個(gè)稀釋度）質(zhì)控范圍：ATCC259220.008-0.06ATCC278530.25-12022/12/528－瓊脂稀釋法AST2022/12/530－瓊脂稀釋法AST菌液的準(zhǔn)備新鮮菌落

0.5麥?zhǔn)蠁挝唬?08CFU/ml）

1：10稀釋（107CFU/ml）

15分鐘內(nèi)接種2022/12/531－瓊脂稀釋法AST點(diǎn)種器點(diǎn)種（每塊平皿可點(diǎn)52個(gè)點(diǎn)）每個(gè)點(diǎn)為1-2ul,即104CFU注意：接種最初和最后要分別點(diǎn)種兩塊不含抗生素的MH平皿“質(zhì)控前“（檢查生長(zhǎng)菌的生長(zhǎng)性和純度）“質(zhì)控后“（檢驗(yàn)在接種過(guò)程中有無(wú)污染）2022/12/532－瓊脂稀釋法AST

吹干將平皿倒置，35°C,普通空氣孵育16-20h

讀MIC值2022/12/533－瓊脂稀釋法AST

0.008 0.0160.032