考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）測定蛋白質(zhì)含量：分光光度的使用【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

1.掌握考馬斯亮藍(lán)染色法定量測定蛋白質(zhì)的原理與方法。

2.熟練分光光度計(jì)的使用和操作方法。

【實(shí)驗(yàn)原理】

考馬斯亮藍(lán)G250測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍(lán)G250在酸性溶液中呈棕紅色，最大吸收峰在465nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)通過范德華鍵結(jié)合成復(fù)合物時(shí)變?yōu)樗{(lán)色，其最大吸收峰移至595nm，而且消光系數(shù)更大?！酒鞑呐c試劑】（一）器材

1.可見光分光光度計(jì)

2.刻度移液管

3.移液槍

4.新鮮小麥葉片或綠豆芽下胚軸等（二）試劑

1.0.9%生理鹽水

2.考馬斯亮藍(lán)試劑

3.1000μg/ml蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液【分光光度法的基本原理和分光光度計(jì)的使用方法】

定義:分光光度法是利用物質(zhì)所特有的吸收光譜來鑒別物質(zhì)或測定其含量的分析檢測技術(shù)。特點(diǎn):靈敏、精確、快速和簡便，在復(fù)雜組分系統(tǒng)中，不需要分離，即能檢測出其中所含的極少量物質(zhì)。應(yīng)用:生物化學(xué)研究中廣泛使用的方法之一，廣泛用于糖，蛋白質(zhì)，核酸，酶等的快速定量檢測。

分光光度計(jì)的分類

紅外分光光度計(jì):可見光分光光度計(jì):紫外分光光度計(jì):測定波長范圍為大于760nm的紅外光區(qū)

測定波長范圍為400~760nm的可見光區(qū)測定波長范圍為200～400nm的紫外光區(qū)可見光譜可見光范圍內(nèi)波長和顏色的關(guān)系光照射到物質(zhì)上，物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)決定哪些特定波長的光被吸收。這一現(xiàn)象符合符合朗伯－比耳定律。入射光強(qiáng)度Io樣品濃度c光程b透射光強(qiáng)度I當(dāng)一束平行單色光(I0)照射有色溶液時(shí)，光的一部分被吸收，一部分透過溶液(I)（4）控制吸光度A的準(zhǔn)確的讀數(shù)范圍：吸光度控制在0.1~0.8讀數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，測量的準(zhǔn)確度較高。（5）選擇參比溶液：參比溶液是用來調(diào)節(jié)儀器工作零點(diǎn)的。無色樣品可用蒸餾水作參比溶液；反之應(yīng)采用不加樣品（加顯色劑）的溶劑作參比溶液。722型光柵分光光度計(jì)使用方法100調(diào)波長旋鈕電源開關(guān)T/A切換旋鈕消光零0靈敏度暗盒蓋比色皿拉桿顯示窗口1．調(diào)整（1）接通電源。（2）調(diào)波長調(diào)節(jié)器至所需波長。（3）開啟電源開關(guān)，指示燈亮，選擇開關(guān)置于“T”，將靈敏度旋鈕調(diào)至”1”檔位，調(diào)節(jié)透光率[100%T]。預(yù)熱20min.預(yù)熱儀器應(yīng)在不測定時(shí)，將比色皿暗箱蓋打開，使光路切斷。2．校正（1）打開吸收池暗室蓋，調(diào)節(jié)[0%T]旋鈕，使數(shù)字顯示為“00.0”，將參比溶液置于光路，蓋上吸收池蓋，調(diào)節(jié)透光率[100%T]旋鈕，數(shù)字顯示為“100.0”。（2）如果顯示不到“100”，則可適當(dāng)增加電流放大器靈敏度檔數(shù)，當(dāng)改變靈敏度后必須重新校正“0”和“100”。（3）按（1）連續(xù)幾次調(diào)整“00.0”和“100.0”后，將選擇開關(guān)置于“A”，調(diào)節(jié)吸光度調(diào)零旋鈕，使數(shù)字顯示為“.000”，即可進(jìn)行吸光度A的測量.3．測定將待測樣品的比色皿放入相應(yīng)的樣品穴，輕輕拉動(dòng)比色皿座架拉桿，使待測溶液進(jìn)入光路，測定。顯示值（小數(shù)后三位數(shù)）即為待測樣品的吸光度值Ａ。讀數(shù)后，打開比色皿暗箱蓋。4.關(guān)機(jī)實(shí)驗(yàn)完畢，切斷電源，將各調(diào)節(jié)旋鈕恢復(fù)至初始位置。將比色皿取出洗凈，晾干，存于專用盒內(nèi)，并將比色皿座架及暗箱用軟紙擦凈。【實(shí)驗(yàn)步驟】（一）、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作1.取試管6支，按下表進(jìn)行編號并加入試劑。試劑試管編號1234561000μg/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（μl）0204060801000.9%生理鹽水（μl）100806040200蛋白質(zhì)含量（μg/0.1ml）0204060801002.分別向上述各管加入3.0ml考馬斯亮藍(lán)G250試劑,充分振蕩混合，放置5min后，測定A595值。3.以A595為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.蛋白質(zhì)含量測定:

取3支試管，各吸取樣品提取液0.1ml，加入考馬斯亮藍(lán)G250試劑3.0ml，充分振蕩混合,放置5min后，測A595值。3.根據(jù)A595值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出樣品中蛋白含量。

樣品蛋白質(zhì)含量（μg/g鮮重）=m(μg)×提取液總體積(ml)