流式細(xì)胞術(shù)的基本原理與應(yīng)用簡介余琪琪12-09-2011第一頁，共三十九頁。流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry）就是對處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行逐個(gè)、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選的技術(shù)。InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid第二頁，共三十九頁。流式細(xì)胞儀工作原理示意圖第三頁，共三十九頁。流式細(xì)胞儀可提供的信息物理信息：通過散射光信號反映熒光信息：通過熒光信號反映第四頁，共三十九頁。散射光信號的產(chǎn)生488nm激光產(chǎn)生散射光SSCFSC第五頁，共三十九頁。前向角散射光信號（FSC）第六頁，共三十九頁。側(cè)向角散射光信號（SSC）第七頁，共三十九頁。利用散射光信號對混合細(xì)胞分群紅細(xì)胞裂解的全血第八頁，共三十九頁。熒光信號的產(chǎn)生第九頁，共三十九頁。熒光信號的表示方法雙參數(shù)點(diǎn)圖單參數(shù)直方圖第十頁，共三十九頁。一個(gè)完整的流式實(shí)驗(yàn)流程樣品的準(zhǔn)備熒光標(biāo)記的選擇對照設(shè)置儀器條件的確定數(shù)據(jù)分析第十一頁，共三十九頁。樣品準(zhǔn)備血液或骨髓標(biāo)本體液、灌洗液、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞貼壁細(xì)胞組織標(biāo)本單細(xì)胞懸液，濃度51051106/mL第十二頁，共三十九頁。樣本流速的選擇高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快，但分辨率低.低流速：一般用于對分辨率要求較高的分析，如DNA分析。

（注：根據(jù)制備樣本濃度隨時(shí)調(diào)整流速）第十三頁，共三十九頁。熒光標(biāo)記抗體的選擇盡量使用直標(biāo)抗體多色標(biāo)記時(shí)應(yīng)該增加各種抗體的用量或適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間根據(jù)流式細(xì)胞儀的類型及熒光素的光譜選擇熒光抗體根據(jù)檢測物（抗原）表達(dá)量選擇熒光染料使用雙標(biāo)以上抗體需要做熒光補(bǔ)償?shù)谑捻?，共三十九頁。流式?xì)胞儀型號：BDFACSCantoII光學(xué)信號的產(chǎn)生：激光（488nm，633nm）光學(xué)信號的收集：光學(xué)濾片光電倍增管（PMT）：將光信號轉(zhuǎn)換成電信號第十五頁，共三十九頁。FACSCantoII的光學(xué)濾片長通濾片（Longpass，LP）帶通濾片（Bandpass，BP）LP500500/50第十六頁，共三十九頁。750-810nm650-670nmFACSCantoII信號檢測組件第十七頁，共三十九頁。常見熒光染料的發(fā)射波長熒光強(qiáng)度：APC>PE>PE-Cy7>FITC每個(gè)通道只能選擇一種熒光素各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配搭配的熒光素之間的發(fā)射光譜重疊盡量小第十八頁，共三十九頁。第十九頁，共三十九頁。對照設(shè)置陰性對照陽性對照補(bǔ)償對照第二十頁，共三十九頁。陰性對照空白對照：即不進(jìn)行任何標(biāo)記的細(xì)胞。主要用于確定待測標(biāo)本的基礎(chǔ)熒光域值同型對照：即用同型抗體作平行實(shí)驗(yàn)。同型抗體為沒有特異性、與熒光抗體蛋白亞型一致的免疫球蛋白，通常是未進(jìn)行免疫小鼠血清的純化IgG1或IgG2。

第二十一頁，共三十九頁。陽性對照陽性對照：陽性對照即應(yīng)用已知表達(dá)某種抗原的細(xì)胞（陽性細(xì)胞）進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。通常用于檢測抗體是否有問題或確定實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性第二十二頁，共三十九頁。補(bǔ)償對照補(bǔ)償對照:多色熒光分析，進(jìn)行熒光補(bǔ)償將用于多色標(biāo)記的各種熒光抗體分別與樣本反應(yīng)，一一進(jìn)行單色標(biāo)記，以測定熒光信號的重疊并做適當(dāng)調(diào)整第二十三頁，共三十九頁。儀器條件的確定電壓閾值熒光補(bǔ)償（多色分析）第二十四頁，共三十九頁。電壓PMT將光信號轉(zhuǎn)換成電信號，調(diào)整PMT的電壓，信號強(qiáng)度將隨之改變。放大器兩種放大方式：線性放大（lin）對數(shù)放大（log）光信號光電倍增管（PMT）放大器電信號第二十五頁，共三十九頁。線性放大（lin）按光強(qiáng)度的線性關(guān)系輸出信號（FSC、SSC、細(xì)胞周期檢測等）第二十六頁，共三十九頁。對數(shù)放大（log）按光強(qiáng)度的對數(shù)關(guān)系輸出信號，用于大多數(shù)熒光染色實(shí)驗(yàn)第二十七頁，共三十九頁。閾值（threshhold）屏蔽噪音信號和碎片信號第二十八頁，共三十九頁。熒光補(bǔ)償采用合適的方法校正熒光染料之間疊加所造成的誤差第二十九頁，共三十九頁。補(bǔ)償公式通常干擾光占該染料所發(fā)出熒光總量的X%。RD1-X%FITC第三十頁，共三十九頁。補(bǔ)償模型PE-X%FITC橫平豎直第三十一頁，共三十九頁。補(bǔ)償調(diào)整的實(shí)驗(yàn)過程樣本準(zhǔn)備：陰性樣本，單陽性樣本調(diào)整：第一步：陰性樣本調(diào)整所有PMT

第二步：單陽性樣本調(diào)整補(bǔ)償自動(dòng)調(diào)補(bǔ)償手動(dòng)調(diào)補(bǔ)償?shù)谌?，共三十九頁。判斷?biāo)準(zhǔn)：橫平豎直第三十三頁，共三十九頁。數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)顯示方式：單參數(shù)直方圖二維散點(diǎn)圖二維等高線圖假三維圖三維圖列表模式設(shè)門：在細(xì)胞分布圖中指定某一個(gè)范圍或某一細(xì)胞性狀的細(xì)胞群，并對其進(jìn)行單參數(shù)或多參數(shù)分析。第三十四頁，共三十九頁。單參數(shù)直方圖雙參數(shù)點(diǎn)圖二維等高圖Pseudo3DPlot3DPlot密度圖假三維圖三維圖第三十五頁，共三十九頁。設(shè)門設(shè)定陰性與陽性群體的界限確定陽性與陰性細(xì)胞群體統(tǒng)計(jì)陽性或陰性細(xì)胞群體的百分率，平均熒光值，絕對數(shù)或抗體結(jié)合數(shù)第三十六頁，共三十九頁。流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用細(xì)胞生理學(xué)研究（細(xì)胞相對大小和顆粒性、胞內(nèi)pH值檢測、Ca2+流動(dòng)性檢測、膜電勢檢測、細(xì)胞活性檢測、細(xì)胞活力的檢測）細(xì)胞膜表面標(biāo)記胞內(nèi)標(biāo)記細(xì)胞周期分析凋亡分析CBA（CytometricBeadArray）第三十七頁，共三十九頁。謝謝！第三十八頁，共三十九頁。內(nèi)容梗概流式細(xì)胞術(shù)的基本原理與應(yīng)用簡介。12-09-2011。流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry）就是對處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行逐個(gè)、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選的技術(shù)。熒光信息：通過熒光信號反映。體液、灌洗液、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。低流速：一般用于對分辨率要求較高的分析，如DNA分析。根據(jù)流式細(xì)胞儀的類型及熒光素的光譜選擇熒光抗體。型號：BDFACSCantoII。熒光強(qiáng)度：APC>PE>PE-Cy7>FITC。搭配的熒光素之間的發(fā)射光譜重疊盡量小。同型抗體為沒有特異性、與熒光抗體蛋白亞型一致的免疫球蛋白，通常是未進(jìn)行免疫小鼠血清的純化IgG1或IgG2。陽性對照：陽性對照即應(yīng)用已知表達(dá)某種抗原的細(xì)胞（陽性細(xì)胞）進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。補(bǔ)償對照:多色熒光分析，進(jìn)行熒光補(bǔ)償。PMT將光信號轉(zhuǎn)換成電信號，調(diào)整PMT的電壓，信號強(qiáng)度將隨之改變。（FSC、SSC、細(xì)胞周期檢測等）。屏蔽噪音信號和碎片信號。采用合適的方法