分子雜交及生物芯片技術(shù)申川軍廣州中醫(yī)藥大學(xué)生物化學(xué)教研室參考書屈伸劉志國目錄

第一章生物大分子制備和分析常用技術(shù)

第二章蛋白質(zhì)、核酸的提取與分離

第三章PCR技術(shù)

第四章分子雜交與印跡技術(shù)

第五章分子克隆技術(shù)

第六章外源基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

第七章蛋白質(zhì)表達技術(shù)

第八章分子標(biāo)技術(shù)

第九章分子改造技術(shù)

第十章測序及人工合成技術(shù)

第十一章基因組學(xué)技術(shù)

第十二章蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

第十三章生物芯片技術(shù)

第十四章生物信息學(xué)技術(shù)

參考書馬文麗

鄭文嶺

彭翼飛

目錄第一章核酸的分子結(jié)構(gòu)與分子雜交的基本原理第二章核酸分子雜交的類型第一節(jié)固相核酸分子雜交類型一、菌落原位雜交（colonyinsituhybridization）二、斑點雜交（dotblot）三、southern印跡雜交（southernblot）四、northern印跡雜交（northernblot）五、組織原位雜交（tissueinsituhybridization）第三章核酸探針的種類、標(biāo)記及檢測第一節(jié)核酸探針的種類dna探針cdna探針rna探針寡核苷酸探針第二節(jié)核酸探針的標(biāo)記和檢測放射性同位素非放射性核酸探針第四章核酸分子雜交實驗因素的優(yōu)化探針選擇標(biāo)記方法濃度雜交率雜交最適溫度雜交的嚴(yán)格性反應(yīng)時間雜交促進劑第五章斑點雜交第六章southern印跡雜交第一節(jié)southern印跡雜交的基本原理一、dna從凝膠到膜上的轉(zhuǎn)移方法二、southern雜交膜三、核酸探針的標(biāo)記第二節(jié)southern印跡法的基本過程一、dna樣品的酶切和電泳二、準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)移的凝膠三、dna從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物四、探針標(biāo)記五、雜交六、洗膜七、雜交結(jié)果的檢測八、雜交膜的重復(fù)使用九、注意事項十、雜交嚴(yán)謹性第七章northern印跡雜交第八章原位雜交第九章菌落原位雜交第十章dna芯片技術(shù)基本概念變性/復(fù)性：分子雜交：異源互補的核苷酸序列通過Walson-Crick堿基配對形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子的過程稱為分子雜交。分子雜交技術(shù)：凝膠電泳分離待測DNA、RNA、Pr并轉(zhuǎn)移固定到支持物或結(jié)合物上，然后與探針/抗體雜交分析。探針(Probe)：已知序列的標(biāo)記單鏈核酸片斷，用于檢測與其互補的待測核酸。BasepairingoccursinduplexDNAandalsoinintra-andinter-molecularinteractionsinsingle-strandedRNA(orDNA).基本概念原位雜交（Insituhybridization,ISH）：菌落原位雜交(ColonyISH)組織原位雜交(TissueISH)：胚胎原位雜交(EmbryoISH)：斑點/狹縫雜交(Dot/slotblot)：基本概念Bio-chip（生物芯片）DNAchip/microarrayGenechip/microarrayOligonucleotidemicroarraycDNAchipProteinchipmicroRNAchipLab-on-chip（芯片實驗室）分子子雜雜交交技技術(shù)術(shù)生物物大大分分子子的的印印跡跡雜雜交交技技術(shù)術(shù)分子子雜雜交交技技術(shù)術(shù)定義義：：凝膠膠電電泳泳分離離待待測測DNA、、RNA、、Pr并并轉(zhuǎn)移移固固定定到結(jié)結(jié)合合物物上上，，然然后后與與探探針針/抗抗體體雜交交分分析析原理理：：核核酸酸變變復(fù)復(fù)性性（（序序列列互互補補））/抗抗原原-抗抗體體基本本工工藝藝：：凝膠膠電電泳泳（（原原位位處處理理））樣品品轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移及及固固定定雜交交分分析析（（免免疫疫結(jié)結(jié)合合分分析析））分子子雜雜交交技技術(shù)術(shù)1969，，Insituhybridization（（ISH））1975，，Southern，，Southernblot:DNA1977，，Alwine，，Northernblot：：RNA1979，，Towbin，，Westernblot：：Pr1982，，Reinher，，Easternblot：：Pr(IEF)分子子雜雜交交技技術(shù)術(shù)探探針針探針針基基本本條條件件（（特特點點））標(biāo)記記物物（（32p,35S,125I,Digoxigenin,FITC））單鏈鏈核核酸酸（（ssDNA，，sscDNA(更更常常用用)）高特特異異性性（（~500bp））標(biāo)記記物物穩(wěn)穩(wěn)定定靈靈敏敏，，檢檢測測方方便便安安全全分子子雜雜交交技技術(shù)術(shù)探探針針探針針的的種種類類DNAprobe（（基基因因copy數(shù)數(shù)、、病病原原基基因因診診斷斷））cDNAprobe（基基因因表表達達等等最最常常用用））RNAprobe（（ISH））Oligonuleotide-probe（（25~50bp；；基基因因診診斷斷，，SNP分分析析、、測測序序、、點點突突變變檢檢測測））分子子雜雜交交技技術(shù)術(shù)探探針針探針針標(biāo)標(biāo)記記物物放射射性性標(biāo)標(biāo)記記物物（（[α-*N]-dNTP））32p(14d)、35S(87d)、、3H(12y)、、125I(60d)非放放射射性性標(biāo)標(biāo)記記物物半抗抗原原：：生生物物素素、、地高高辛辛熒光光素素：：異異硫硫氰氰酸酸熒熒光光素素（（FITC）分子子雜雜交交技技術(shù)術(shù)探探針針-32P-dNTP結(jié)構(gòu)A、G、C或TNHHPP32POOOOOOHOHOHHOOOHHHHOCH2分子雜交交技術(shù)探探針分子雜交交技術(shù)探探針探針標(biāo)記記隨機引物物法缺口平移移法(DNaseIandDNA聚聚合酶I)末端標(biāo)記記法堿性磷酸酸酶-T4多核核苷酸激激酶[γ-32p]-ATP標(biāo)記DNA/RNA-5′′末端轉(zhuǎn)移移酶（poly(N*)n））T4DNA聚合合酶/Klenow片片斷（（粘末端端補平））分子雜交交技術(shù)探探針探針純化化乙醇沉淀淀法凝膠過濾濾法（（G-50Spincolumn）分子雜交交技術(shù)——印跡印跡（轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜）支支持物：：硝酸纖維維素膜（（NC膜膜）尼龍膜N+-nylon（（DNA/RNA）中性膜PVDF膜（westernblot））分子雜交交技術(shù)——印跡印跡（轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜）方方法：毛細管虹虹吸轉(zhuǎn)移移法真空轉(zhuǎn)移移法電轉(zhuǎn)移法法分子雜交交技術(shù)——印跡濕濾紙緩沖液濾紙橋凝膠硝酸纖維素膜吸水紙玻璃板支持臺容器重物毛細管虹虹吸轉(zhuǎn)移移法分子雜交交技術(shù)——印跡尼龍膜凝膠濾紙海綿凝膠支持夾緩沖液電極+–濾紙電極電轉(zhuǎn)移法法分子雜交交技術(shù)——印跡真空轉(zhuǎn)移移法-1h分子雜交交技術(shù)——印跡真空轉(zhuǎn)移移裝置分子雜交交技術(shù)——印跡Westernblot(SDS及轉(zhuǎn)膜膜系統(tǒng))分子雜交交技術(shù)——影響因因素離子強度度(高-消消除靜電電斥力-利于雜雜交)溫度（低于Tm20-25℃））有機試劑劑（去離離子甲酰酰胺）-降低Tm樣品/探探針分子子的大小小和復(fù)雜雜程度洗滌條件件（高嚴(yán)謹性性，洗去去非特異異性結(jié)合合探針））支持物添加物（吸附DNA探針針，使DNA接接觸面增增大）#預(yù)雜雜交為減少探探針與廣廣泛存在在的非互互補核酸酸的非特特異性結(jié)結(jié)合，雜雜交前用用封閉物物將這些些非特異異位點封封閉。變性的非非特異性性DNA：常用用鮭魚精精子DNA或小小牛胸腺腺DNA。當(dāng)與與濾膜一一起孵育育后，除除濾膜上上已吸附附樣品DNA的的區(qū)域外外，它們們可被吸吸附到所所有其它它區(qū)域，，使整個個背景覆覆蓋一層層。由于于它們與與探針無無同源性性，在交交雜反應(yīng)應(yīng)中可大大大減少少探針的的非特異異性結(jié)合合，使背背影清晰晰。高分子化化合物：：某些高高分子化化合物具具有封閉閉膜上非非特異位位點的能能力。一一般常用用Denhard`t溶液，，包括聚聚乙烯吡吡咯酮、、小牛血血清白蛋蛋白、聚聚蔗糖。。分子雜交交技術(shù)——基本流流程樣品及探探針制備備樣品電泳泳分離轉(zhuǎn)膜預(yù)雜交雜交洗膜分析（壓壓片、顯顯色、熒熒光觀察察等）分子雜交交技術(shù)SouthernblotDNA提提取酶切電泳/拍拍照轉(zhuǎn)膜/固固定探針制備備預(yù)雜交雜交洗膜掃磷屏分子雜交交技術(shù)UV交聯(lián)聯(lián)儀多用途254nm紫外外輻射系系統(tǒng)，主主要用于于將核酸酸交聯(lián)于于膜上。。還用于于瓊脂凝凝膠中DNA的的切割，，RecA突變變篩選，，胸腺二二聚體產(chǎn)產(chǎn)生的部部分限制制性內(nèi)切切酶消化化，UV滅菌消消除PCR污染染。另紫紫外滅菌菌-聚合合物紫外外處理。。分子雜交交技術(shù)Southernblot應(yīng)用用DNA多多態(tài)性分分析（RFLP分析/SNP/SSCP/RAPD）基因突變變檢測基因copy數(shù)數(shù)檢測重組子篩篩選DNA指指紋分析析測序分子雜交交技術(shù)Southernblot應(yīng)用用DNA指指紋分析析血跡中的的DNA分子雜交交技術(shù)Northernblot基因表達達分析mRNA長度及及半定量量分析RNA分子（TRIzol）甲醛變性電泳至膜上轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜用10xSSC轉(zhuǎn)移RNA吸附有RNA片段的膜（亞甲藍染色）帶有RNA片段的凝膠分子雜交交技術(shù)Westernblot蛋白提取取/樣品品準(zhǔn)備SDS電轉(zhuǎn)/麗麗春紅S染色封閉一抗孵育育洗滌一抗抗二抗孵育育洗膜結(jié)果觀察察/顯色色（Dig-AP/FITC）組織蛋白分子雜交交技術(shù)ISH胚胎/組組織制備備固定消化/再再固定/洗滌RNA探探針制備備封閉雜交/洗洗滌一抗/洗洗滌二抗/洗洗滌顯色(Dig-、FITC、、Cy5)抗衰老基因Klotho原位雜交圖斑馬魚krox20基因原位雜交圖3,5菱腦節(jié)分子雜交交技術(shù)FISH生物芯片片Biochip生物芯片片定義：在在斑點雜雜交基礎(chǔ)礎(chǔ)上，模模擬制備備大規(guī)模模集成電電路的基基本原理理，集成成了探針針原位合合成、照照明平板板印刷、、精密控控制、激激光共聚聚焦顯微微技術(shù)發(fā)發(fā)展來的的一門分分子生物物學(xué)技術(shù)術(shù)原理：將將大量樣樣本固定定于較小小的支持持物上，，然后與與標(biāo)記好好的待測測樣品雜雜交，再再檢測雜雜交信號號的強弱弱，從而而判斷樣樣本中待待測DNA、RNA、、Pr等等分子數(shù)數(shù)量或活活性狀態(tài)態(tài)特點：高高通量、、微型化化、集約約化、標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化等等生物芯片片生物芯片片種類微陣列芯芯片（基基因芯片片/蛋白白芯片/細胞芯芯片等））微流控芯芯片（屬屬于主動動式芯片片，如樣樣品制備備芯片、、PCR芯片、、毛細管管電泳芯芯片和色色譜芯片片等）芯片實驗驗室（以以生物芯芯片為基基礎(chǔ)的集集成化分分析系統(tǒng)統(tǒng);可可完成如如樣品制制備、試試劑輸送送、生化化反應(yīng)、、結(jié)果檢檢測、信信息處理理和傳遞遞等一系系列復(fù)雜雜工作））生物芯片片基本流程程：芯片制備備原位合成成法原位位光照蝕蝕刻微量點樣樣法樣品制備備（Sample-Cy3；Control-Cy5）分子雜交交檢測分析析（Confocus、CCD）生物芯片片原位光照照蝕刻原原理石英片氫氫化后封封閉設(shè)計11um見見方窗口口遮罩對對封閉部部分光解解將nt加加入通過過化學(xué)偶偶合連接接到晶片片上更換不同同的遮罩罩進行UV光解解加入nt進行化化學(xué)偶合合反應(yīng)重復(fù)上兩兩步可合合成所需需長度及及序列的的寡核甘甘酸生物芯