生物技術(shù)診斷制劑姓名何俊導(dǎo)師黃毓茂學(xué)號(hào)2004228044專業(yè)預(yù)防獸醫(yī)傳染病生物技術(shù)診斷制劑

隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，新型診斷技術(shù)不斷涌現(xiàn)，與之相配套的生物技術(shù)診斷制劑也應(yīng)運(yùn)而生，尤其是基于分子水平的診斷制劑發(fā)展迅猛。生物技術(shù)診斷制劑大致包括重組表達(dá)抗原（recombinantantigen）、核酸探針（nucleicacidprobe,geneprobe）、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）基因芯片（genechip）等。生物技術(shù)診斷制劑不僅特異性強(qiáng)，而且可以獲得常規(guī)方法無(wú)法制備的一些診斷制劑，或能克服常規(guī)程序制備的診斷制劑的缺陷。同時(shí)，基于生物技術(shù)制備的診斷制劑易于標(biāo)準(zhǔn)化、產(chǎn)業(yè)化。一、重組表達(dá)抗原

基因工程重組表達(dá)抗原是用DNA重組技術(shù)，將編碼特定抗原的基因插入原核或真核表達(dá)質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中使其高效表達(dá)，然后運(yùn)用生物化學(xué)分離、純化技術(shù)，提取表達(dá)產(chǎn)物等，最終制成診斷用重組表達(dá)抗原。近年來(lái)，重組表達(dá)抗原已顯示出獨(dú)特的優(yōu)越性，具有高特異性、高純度、均質(zhì)性好、重復(fù)性強(qiáng)、成本較低、并可大批量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，尤其是應(yīng)用這一制造技術(shù)獲得了常規(guī)方法無(wú)法制備的診斷抗原，如乙型肝炎病毒等一些病原體尚無(wú)法獲得純培養(yǎng)，但應(yīng)用生物技術(shù)已制備出標(biāo)準(zhǔn)的乙型肝炎各組分診斷抗原，對(duì)人獸共患病特別是高危險(xiǎn)病原體（如免疫缺陷病毒、結(jié)核分枝桿菌、炭疽桿菌等）的診斷抗原制備，應(yīng)用生物技術(shù)更是具有無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)。重組表達(dá)抗原的發(fā)展前景十分廣闊。（一）核酸電泳圖譜分析

核酸電泳圖譜是指分離純化的核酸，由于分子量的差異而在電泳中遷移速率不同，形成不同的帶型。通過(guò)帶型異同度的分析可確定生物體間的遺傳關(guān)系。質(zhì)粒圖譜分析和RNA圖譜分析都是電泳圖譜分析。1．質(zhì)粒圖譜分析質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)能自主復(fù)制的染色體外的DNA，它是耐藥性、毒力因子等特殊遺傳特性的載體。多數(shù)細(xì)菌往往含有大小和數(shù)量不等的質(zhì)粒，具有相對(duì)穩(wěn)定性，因此質(zhì)粒圖譜分析是細(xì)菌分型和流行病學(xué)的重要工具，具有診斷價(jià)值。該法簡(jiǎn)便、特異、快速、可靠，缺點(diǎn)是對(duì)一些無(wú)質(zhì)?；蛸|(zhì)粒不穩(wěn)定的菌株，以及質(zhì)粒分子量相同而核苷酸序列不同的菌株無(wú)分辨能力。2．RNA電泳圖譜分析常用的是RNA病毒圖譜分析，特別是分節(jié)段RNA病毒的電泳圖譜分析。根據(jù)不同RNA片段的分子量差異，在PAGE電泳中遷移的速率有所不同，染色后顯示出不同的電泳圖譜，可將不同的病毒或相同病毒的不同毒株的基因組加以分析比較。（二）核酸酶切圖譜分析

染色體DNA、質(zhì)粒DNA或RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄而形成的cDNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生大小不同的片段，經(jīng)瓊脂糖電泳后可形成不同的帶型，即核酸酶切圖譜，又稱DNA指紋圖譜。用相同的限制性內(nèi)切酶消化的DNA所產(chǎn)生片段的異同程度，直接反應(yīng)生物體間的遺傳關(guān)系。用不同的限制性內(nèi)切酶消化DNA可分析基因間的連鎖關(guān)系。本法可用于比較不同病原體基因組的差異，了解它們之間的遺傳關(guān)系。限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)分析（RFLP）是核酸酶切圖譜分析的延伸，它在一些細(xì)菌分子流行病學(xué)研究中顯示出重要價(jià)值，因?yàn)榧?xì)菌染色體DNA限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性是細(xì)菌基因特征的重要指標(biāo)。RFLP與核酸雜交技術(shù)聯(lián)合使用則結(jié)果更容易判斷和解釋。（三）寡核苷酸指紋圖譜分析

將純化的RNA經(jīng)一種特殊的RNA酶（通常為T1酶）消化后，產(chǎn)生許多理化特性和大小不同的寡核苷酸片段，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠雙相電泳分離后進(jìn)行放射自顯影，形成一類似指紋的圖譜，即寡核苷酸指紋圖譜。該法在RNA病毒的研究中得到了廣泛應(yīng)用，如基因組遺傳多樣性研究，同一病毒不同毒株的地理分布、歷史演變和宿主類群關(guān)系的研究，野毒株與疫苗株的比較等。（一）核酸探針制備技術(shù)基因探針的獲取1.cDNA探針：通過(guò)提取純度較高的相應(yīng)的mRNA,反轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的cDNA，再利用它與目的基因DNA相作用2.基因文庫(kù)法：將染色體DNA通過(guò)超聲波或者限制性內(nèi)切酶不完全水解，從而得到許多片段，選取長(zhǎng)度在15-20kb的片段重組到噬菌體中，經(jīng)過(guò)體外包裝，再轉(zhuǎn)錄到大腸桿菌，在固體培養(yǎng)基上可得到許多噬菌斑，然后用菌斑原位雜交篩選含有目的的基因作為探針。3.寡核苷酸探針：人工合成低于50個(gè)核苷酸的任意序列的寡核苷酸片段作為探針cDNA探針標(biāo)記：在以mRNA制備cDNA同時(shí)加入標(biāo)記的脫氧核苷酸即可。末端標(biāo)記法：在大腸桿菌T4噬菌體多聚核苷酸激酶的催化下將γp（32）ATP上的γ-磷酸連接到寡核苷酸的5’末端上。2.非放射性標(biāo)記生物素標(biāo)記探針：將生物素結(jié)合于三磷酸脫氧尿苷上，使之成為2’三磷酸脫氧尿嘧啶-5’烯丙胺生物素，這種標(biāo)記的生物素可以與另一種蛋白質(zhì)-親和素結(jié)合，親和素事先用酶標(biāo)記，在底物的作用下顯色而被檢測(cè)出來(lái)。光敏生物素標(biāo)記：光敏生物素在可見(jiàn)光（350nm）的短暫照射下，能與核苷酸堿基反應(yīng)，并牢固的結(jié)合成光敏生物素標(biāo)記探針。半抗原-抗體-酶法：將畄體半抗原地高辛甙元通過(guò)一手臂與dUPT連接，用隨機(jī)啟動(dòng)延伸法標(biāo)記DNA探針，與目的DNA雜交后，雜交分子用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)?；瘜W(xué)標(biāo)記法：用化學(xué)試劑如乙二胺交聯(lián)活化的生物素（?；?氨基戊酸-N羥基琥珀酰胺脂）或生物素酰肼取代胞嘧啶的N4氨基；用戊二醛等做交聯(lián)劑將生物素化堿性大分子歐聯(lián)在G堿基的N7位；合成的寡核苷酸可以用乙二胺交聯(lián)活化生物素與5’末端磷酸基進(jìn)行標(biāo)記。免疫標(biāo)記法抗雜交體標(biāo)記法：在雜交過(guò)程中作為探針的核酸與其互補(bǔ)的核酸能形成雜交體，雜交體本身具有一定抗原性，因而可用抗雜交體的抗體并結(jié)合帶標(biāo)記的第二抗體對(duì)雜交體進(jìn)行檢測(cè)半抗原標(biāo)記法：通過(guò)對(duì)已知核酸片段做一定的修飾，在探針的某些部位連接半抗原，探針通互補(bǔ)核酸片段雜交后，與半抗原的特異性抗體結(jié)合，再通過(guò)結(jié)合帶標(biāo)記的第二抗體對(duì)形成的雜交體進(jìn)行檢測(cè)。斑點(diǎn)雜交1、原理及步驟：提取病毒、細(xì)菌、CellDNA↓點(diǎn)樣品至膜、干燥、固定↓

探針、DNA變性、雜交↓

洗膜、放射自顯影↓結(jié)果分析

2、應(yīng)用：1）混合樣品DNA鑒定2）基因缺失檢測(cè)3）基因表達(dá)分析

2.Southern印跡雜交將DNA用限制性內(nèi)切酶酶切，然后用瓊脂糖凝膠電泳將所得DNA按分子量大小分離，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，用放射性自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測(cè)特定DNA分子的含量。應(yīng)用：克隆基因的酶切圖譜分析、基因組基因的定性和定量分析、基因突變分析及限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析。3.Northern印跡雜交

Northern印跡同Southern印跡原理步驟一樣，只是在電泳前先進(jìn)行變性原理及步驟：提取病毒、細(xì)菌、Cell總RNA↓

提純分離、變性RNA

↓

瓊脂糖凝膠電泳分離RNA↓

轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜↓

雜交檢測(cè)二.雜交反應(yīng)基本過(guò)程1.預(yù)雜交：預(yù)雜交液中常加入鮭魚(yú)精DNA，若標(biāo)記探針是cDNA或RNA，預(yù)雜交液中還需加入多聚A以阻止特異性結(jié)合,42℃4-6h或過(guò)夜。2.雜交：探針100℃變性，迅速冷卻，加入預(yù)雜交液中，42℃一天3.洗滌：2×SSC+0.1%SDS常溫洗滌兩次，1×SSC+0.1%SDS65℃洗滌兩次，每次15分鐘。4.放射自顯影或顯色反應(yīng)（檢測(cè)）使用放射性同位素標(biāo)記物，采用放射自顯影。若采用非放射性同位素標(biāo)記物，則采用顯色反應(yīng)。顯色反應(yīng)將依據(jù)偶聯(lián)的酶類而定。PCR技術(shù)1.原位PCR技術(shù)：也就是在組織細(xì)胞里進(jìn)行PCR反應(yīng)，它既能鑒定帶有靶序列的細(xì)胞，又能標(biāo)出序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，對(duì)于分子和細(xì)胞水平上研究擊斃昂的發(fā)病機(jī)理和臨床過(guò)程以及病理轉(zhuǎn)歸有重大意義。2.巢式PCR：由兩套引物和兩輪PCR組成，先對(duì)靶DNA進(jìn)行第一步擴(kuò)增，然后從第一次反應(yīng)產(chǎn)物中取出少量作為反應(yīng)模板進(jìn)行第二次擴(kuò)增，第二次引物與第一次反應(yīng)產(chǎn)物互補(bǔ)，擴(kuò)增所得即為目的產(chǎn)物。優(yōu)點(diǎn)是提高擴(kuò)增倍數(shù)和反應(yīng)準(zhǔn)確性；缺點(diǎn)是第二次擴(kuò)增交叉污染概率大。巢式PCR示意圖3.反向PCR(IPCR):反向PCR用于擴(kuò)增已知序列兩端的未知DNA片段，因此一對(duì)引物與常規(guī)PCR一樣與已知序列互補(bǔ)但是方向卻是相反的。IPCR步驟主要包括酶切、自身連接還化、擴(kuò)增和序列分析。5.多重PCR多重PCR又叫多重引物PCR或復(fù)合PCR,它是在同一反應(yīng)體系中加入兩對(duì)或兩對(duì)以上的引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核苷酸片段的PCR反應(yīng)。主要用于多種病原微生物的同時(shí)檢測(cè)和鑒定，以及同種病原微生物不同基因型鑒定和某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。PCR的應(yīng)用一：基礎(chǔ)研究基因克隆基因組測(cè)序基因突變制備單鏈模板基因功能和表達(dá)調(diào)控研究二：臨床應(yīng)用遺傳性疾病的檢測(cè)和分析腫瘤病因和發(fā)病機(jī)制研究檢測(cè)病原體三：衛(wèi)生安全食品微生物檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)動(dòng)植物檢疫其他：法醫(yī)學(xué)，環(huán)境科學(xué)研究五、基因芯片

基因芯片是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后與待測(cè)的標(biāo)記樣品中的基因按堿基配對(duì)原理進(jìn)行雜交，再通過(guò)激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的熒光信號(hào)作出比較和檢測(cè)，從而迅速得出所要的信息?；蛐酒址QDNA芯片（DNAchip）、DNA微陣列（DNAmicroarray）、寡核苷酸微芯片（oligonucleotidemicrochip）?；蛐酒鲜兰o(jì)90年代初，由美國(guó)Affymetrix公司的Fodor博士提出并開(kāi)始基因芯片技術(shù)的研究，至今，基因芯片技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)各個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用均已取得巨大突破?；蛐酒延谐醪匠尚蔚漠a(chǎn)品問(wèn)世，可應(yīng)用于基因表達(dá)譜分析、新基因的發(fā)現(xiàn)、基因突變與多態(tài)性分析、基因組文庫(kù)作圖、疾病的診斷與預(yù)測(cè)、藥物篩選，以及司法與刑偵、環(huán)境與食品衛(wèi)生監(jiān)督等?；蛐酒闹苽浼夹g(shù)（一）原位合成是指直接在芯片上用四種核苷酸合成所需探針的基因芯片制備技術(shù)，主要包括：1．原位光刻合成是由美國(guó)Affymetrix公司發(fā)展的結(jié)合了半導(dǎo)體工業(yè)的光刻技術(shù)和DNA合成技術(shù)制造高密度核酸陣列的基因芯片制備技術(shù)。2．原位噴印合成芯片原位噴印合成原理與噴墨打印類似，不過(guò)芯片噴印頭和墨盒有多個(gè)，墨盒中裝的是四種堿基等液體而不是碳粉；采用的化學(xué)原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成一致，因此不需要特殊制備的化學(xué)試劑。3．分子印章多次壓印合成根據(jù)所需微陣列，設(shè)計(jì)有凹凸的微印章，然后根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)在制備的各級(jí)印章上涂上對(duì)應(yīng)的單核苷酸；按照設(shè)計(jì)的順序?qū)⒉煌奈⒂≌轮饌€(gè)依次壓印在同一基片上，得到256×256陣開(kāi)的高密度基因芯片，其主要優(yōu)勢(shì)有：采用了平面微細(xì)加工技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)大批量生產(chǎn)；通過(guò)提高集成度，降低單個(gè)芯片的成本；可組裝大量的（104-106種）生物分子探針，獲取信息量大，效率高，特別適合于基因信息的采集；結(jié)合微機(jī)械技術(shù)，可把生物樣品的預(yù)處理、基因物質(zhì)的提取、擴(kuò)增，以及雜交后的信息檢測(cè)相集成，制備成微縮芯片。（二）合成點(diǎn)樣是指將合成好的探針、cDNA或基因組DNA通過(guò)特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片片基上。合成點(diǎn)樣技術(shù)在基因芯片尚處于實(shí)驗(yàn)研究階段時(shí)是唯一的芯片制造手段，曾一度被原位合成技術(shù)的光芒所掩蓋。隨著原位合成技術(shù)缺點(diǎn)的