CMA芯片技術(shù)應用于輔助生殖植入前/產(chǎn)前/產(chǎn)后

先天性疾病診斷的初步應用

浙江大學醫(yī)學院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院1CMA芯片技術(shù)應用于輔助生殖植入前/產(chǎn)前/產(chǎn)后

先天性疾病診出生缺陷出生時就有外表的、內(nèi)部的結(jié)構(gòu)異常或功能異常我國出生缺陷率達5.6%每年新增出生缺陷約90萬例日益成為突出的公共衛(wèi)生問題和社會問題2出生缺陷出生時就有外表的、內(nèi)部的結(jié)構(gòu)異常或功能異常2出生缺陷出生缺陷遺傳因素環(huán)境因素（理、化、生物因素、生活方式）遺傳+環(huán)境因素染色體異常（所有新生兒中，染色體異常占0.92%，多為新發(fā)而非遺傳）單基因突變（多為孟德爾遺傳，少數(shù)為新發(fā)）3出生缺陷出生缺陷遺傳因素環(huán)境因素（理、化、生物因素、生活方式出生缺陷干預----關(guān)注生殖全程高危人群目標人群產(chǎn)前診斷孕前診斷不孕人群精子產(chǎn)后先天性疾病診斷卵子+胚胎胎兒新生兒、兒童4出生缺陷干預----關(guān)注生殖全程高危人群產(chǎn)前診斷孕前診斷不孕對胚胎或卵子行卵裂球或極體活檢，作染色體和/或基因?qū)W檢測，將無疾病胚胎植入子宮妊娠，并出生正常子代的技術(shù)輔助生殖與遺傳學技術(shù)相結(jié)合的一種產(chǎn)前診斷方法關(guān)鍵點是建立單細胞遺傳診斷技術(shù)孕前診斷-----植入前遺傳學診斷技術(shù)

(preimplantationGeneticDiagnosis,PGD)5對胚胎或卵子行卵裂球或極體活檢，作染色體和/或基因?qū)W檢測，將染色體疾病的診斷在人類染色體研究歷史上,研究者一直致力于利用可視化的顯微鏡分析染色體的完整性除了非整倍體，染色體微缺失、重復、擴增和等基因組DNA失衡是導致胎兒發(fā)育遲緩、畸形、死胎、流產(chǎn)和其他先天性疾病的內(nèi)在原因6染色體疾病的診斷在人類染色體研究歷史上,研究者一直致力于利用是目前較為成熟的遺傳性疾病診斷技術(shù)傳統(tǒng)核型分析技術(shù)絨毛活檢取材孕中期羊膜腔穿刺羊水細胞培養(yǎng)染色體核型分析對非整倍體和重大染色體結(jié)構(gòu)異常診斷的準確率達到99%7是目前較為成熟的遺傳性疾病診斷技術(shù)傳統(tǒng)核型分析技術(shù)絨毛活檢取局限性材料受限，需要新鮮的組織、血樣進行活細胞培養(yǎng)不能分辨長度在10Mb以下染色體片斷的缺失、增加或易位染色體亞端粒區(qū)域異常診斷率較低單細胞分析

高分辨率分析8局限性材料受限，需要新鮮的組織、血樣進行活細胞培養(yǎng)單細胞分析熒光原位雜交技術(shù)（fluorescentin-situhybridization，F(xiàn)ISH)可對相應位點的缺失、重復、易位及多倍體等染色體異常作出診斷提高了染色體異常的診斷精度FISH探針能同時與分裂期染色體或間期核染色絲特異雜交----無需細胞培養(yǎng)，可用于單細胞分析Chromosome13q13-14Chromosome21q21熒光標記的DNA探針中期分裂相間期細胞核9熒光原位雜交技術(shù)（fluorescentin-situhFISH局限性只能對有限的位點進行檢測FISH依賴于探針的設計，檢測不明原因的病例難度較大對植入前胚胎的檢測，缺乏覆蓋全基因組檢測的能力10FISH局限性只能對有限的位點進行檢測10

Metaphasechromosomesblastomerenormal11normal22der11der22Reciprocaltranslocationt(11;22)(q25;q12)Metaphasechromosomesblastomerenormal13normal14der13-14Robertsoniantranslocationder(13;14)(q10;q10)FISHforstructuralaberrations2-colourFISH3-colourFISH11Metaphasechromosomesblast比較基因組雜交（comparativegenomichybridization,CGH)1：1混合雜交于同個正常男性中期分裂相Cot-1DNA雙色熒光強度比分析

正常DNA

病人DNAGainLossLOSSGain12比較基因組雜交（comparativegenomich1：1混合雜交于芯片（BAC.Oligoarray，SNP)Cot-1DNA計算機掃描，數(shù)據(jù)分析

病人DNA

正常DNAGainLoss微陣列比較基因組雜交技術(shù)（ArrayComparativegenomichybridization，aCGH)131：1混合雜交于芯片（BAC.Oligoarray，SNP)1414aCGH優(yōu)勢結(jié)合了基因芯片和傳統(tǒng)CGH的優(yōu)點更高的分辨率：G-顯帶的分辨率：10Mb

傳統(tǒng)CGH:5-10MbArrayCGH:100kb檢測基因組的拷貝數(shù)變化，可對染色體非整倍體、微缺失或微重復或其他不平衡的染色體異常檢測能夠?qū)θ旧w異常進行精確定位結(jié)合全基因擴增技術(shù)，可以進行胚胎全染色體組的檢測------PGS/PGD15aCGH優(yōu)勢結(jié)合了基因芯片和傳統(tǒng)CGH的優(yōu)點151616用于檢測CNV的染色體芯片（CMA)在下列情況應作為一線檢測手段非已知綜合癥的多發(fā)畸形非綜合癥型的發(fā)育遲緩/智力低下孤獨癥譜系疾病進一步明確發(fā)育遲緩、語言發(fā)育落后和其他尚不明確遺傳學病因的癥狀對于一些CMA檢出不平衡的病例，建議用細胞遺傳/FISH進行確認，同時對父母進行臨床遺傳評估和咨詢17用于檢測CNV的染色體芯片（CMA)在下列情況應作為一線檢測TheAmericanJournalofHumanGenetics86,749–764,May14,201021698例不明原因發(fā)育遲緩、低智，孤獨癥，多發(fā)畸形芯片（CMA)檢測：診斷率15%-20%核型分析：診斷率僅3%

發(fā)育障礙和智力低下等先天疾病首選CMA18TheAmericanJournalofHuman截止2011年，智力低下的arrayCGH研究論文就達4370篇1919CMA技術(shù)平臺Affymetrix芯片平臺

產(chǎn)前、產(chǎn)后檢測Bluegenome芯片平臺植入前胚胎檢測20CMA技術(shù)平臺Affymetrix芯片平臺BluegenoCMA的應用在輔助生殖臨床上進行全染色體范圍的非整倍體篩查在反復自然流產(chǎn)原因分析補充產(chǎn)前診斷的一個重要手段在智力低下、發(fā)育遲緩和體征多種畸形兒童致病原因分析在兒童自閉癥原因分析21CMA的應用在輔助生殖臨床上進行全染色體范圍的非整倍體篩查2高齡產(chǎn)婦復植入失敗復發(fā)性早期流產(chǎn)嚴重的男性不育癥父母為平衡易位、倒位攜帶者非整倍體是輔助生殖低妊娠率和高流產(chǎn)率的主要因素，PGS的目的是識別整倍體的正常胚胎轉(zhuǎn)移，以實現(xiàn)增加懷孕的機會CMA植入前胚胎遺傳學篩查/診斷適應人群22高齡產(chǎn)婦CMA植入前胚胎遺傳學篩查/診斷適應人群22CMA產(chǎn)前診斷適應人群希望更全面、更準確的了解胎兒染色體情況，以排除出生缺陷的可能性（生長發(fā)育遲緩，智力低下、自閉癥等原因）胎兒B超檢查發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常，但染色體核型分析正常者羊水染色體核型分析已發(fā)現(xiàn)異常，但無法確定異常染色體的確切位置或來源者胎兒發(fā)現(xiàn)新發(fā)的染色體相互易位，需進一步排除微缺失者23CMA產(chǎn)前診斷適應人群希望更全面、更準確的了解胎兒染色體情況CMA檢測先天性疾病的適應癥不同程度的智力低下生長發(fā)育遲緩、語言發(fā)育遲緩面容異常內(nèi)臟器官（如心臟、腎臟、生殖器）畸形認知/精神/行為問題（如多動癥、自閉癥）24CMA檢測先天性疾病的適應癥不同程度的智力低下24截止12年10月，共收病人233例

植入前診斷病例7例

難免流產(chǎn)流產(chǎn)物分析121例

產(chǎn)前診斷病例50例

產(chǎn)后先天性疾病診斷55例CMA檢測病例25截止12年10月，共收病人233例

植入前診斷病例7例

難植入前診斷病例反復流產(chǎn)反復IVF失敗父母為平衡易位攜帶者產(chǎn)前診斷病例新發(fā)平衡易位胎兒，排除染色體微缺失父母為平衡易位攜帶者B超診斷結(jié)構(gòu)異常胎兒：腦部結(jié)構(gòu)異常、先心、腎增大、單臍動脈、羊水過多、淋巴水囊瘤產(chǎn)后診斷自閉癥腦發(fā)育不全/智力低下先天性心臟病26植入前診斷病例26檢測標本活檢的單個卵裂球絨毛引產(chǎn)胎兒組織羊水臍血外周血27檢測標本活檢的單個卵裂球27Transfer(FreshCycle)NormalEmbryosWGAArray-CGHArray-CGHresultsSurePlexBluegnome24SureBluegnomeBlueFuseMultiD3Cleavagestageembryo單細胞ArrayCGH過程AneuploidyScreening(PGS)PGDStructuralChromosomalAbnormalities28Transfer(FreshCycle)Nor用QIAampDNAMiniKit(QIAGEN)提取純化DNABluegnomeCytoChipFocusConstitutional芯片AffymetrixCytoScanHD&SNP6.0ReferenceDNA:NormalPromegaMale

NormalAsianMale檢測主要試劑29用QIAampDNAMiniKit(QIAGEN)提主要步驟30主要步驟30后續(xù)驗證主要方法MLPAFISHPCR多重連接探針擴增技術(shù)(MLPA)31后續(xù)驗證主要方法MLPA多重連接探針擴增技術(shù)(MLPA)3初步總結(jié)植入前診斷病例6例病人，共32個胚胎進行了arrayCGH檢測其中2例患者的所有胚胎檢測結(jié)果異常，未獲得可移植的正常胚胎4例患者得到可移植的胚胎，2例獲得成功妊娠，目前已孕30周，繼續(xù)妊娠中。32初步總結(jié)植入前診斷病例32產(chǎn)前診斷病例核型含衍生染色體的羊水標本全部檢出染色體的異常來源死胎或胚胎停育病例中46.9%檢出了染色體拷貝數(shù)增加/減少，含16,15,21，22,18號等染色體的非整倍體，染色體拷貝數(shù)增加的片段包括4q13.2-q35.2，5p15.33，5p13.33，10q11.21，19p13.3-p13.2等，。B超診斷結(jié)構(gòu)異常引產(chǎn)胎兒組織30.4%可檢出有臨床意義的染色體微缺失或微重復，其中大部分為常規(guī)染色體核型分析不易檢出的病例33產(chǎn)前診斷病例33產(chǎn)后病例37.1%檢出有臨床意義的染色體微缺失、微重復，檢出拷貝數(shù)減少的染色體片段包括15q11.2，15q13.1，5p15.33-p4.3，11p11.2，5q11.2，16q23.3等34產(chǎn)后病例34CMA芯片技術(shù)應用于輔助生殖植入前/產(chǎn)前/產(chǎn)后

先天性疾病診斷的初步應用

浙江大學醫(yī)學院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院35CMA芯片技術(shù)應用于輔助生殖植入前/產(chǎn)前/產(chǎn)后

先天性疾病診出生缺陷出生時就有外表的、內(nèi)部的結(jié)構(gòu)異?；蚬δ墚惓Ｎ覈錾毕萋蔬_5.6%每年新增出生缺陷約90萬例日益成為突出的公共衛(wèi)生問題和社會問題36出生缺陷出生時就有外表的、內(nèi)部的結(jié)構(gòu)異?；蚬δ墚惓?出生缺陷出生缺陷遺傳因素環(huán)境因素（理、化、生物因素、生活方式）遺傳+環(huán)境因素染色體異常（所有新生兒中，染色體異常占0.92%，多為新發(fā)而非遺傳）單基因突變（多為孟德爾遺傳，少數(shù)為新發(fā)）37出生缺陷出生缺陷遺傳因素環(huán)境因素（理、化、生物因素、生活方式出生缺陷干預----關(guān)注生殖全程高危人群目標人群產(chǎn)前診斷孕前診斷不孕人群精子產(chǎn)后先天性疾病診斷卵子+胚胎胎兒新生兒、兒童38出生缺陷干預----關(guān)注生殖全程高危人群產(chǎn)前診斷孕前診斷不孕對胚胎或卵子行卵裂球或極體活檢，作染色體和/或基因?qū)W檢測，將無疾病胚胎植入子宮妊娠，并出生正常子代的技術(shù)輔助生殖與遺傳學技術(shù)相結(jié)合的一種產(chǎn)前診斷方法關(guān)鍵點是建立單細胞遺傳診斷技術(shù)孕前診斷-----植入前遺傳學診斷技術(shù)

(preimplantationGeneticDiagnosis,PGD)39對胚胎或卵子行卵裂球或極體活檢，作染色體和/或基因?qū)W檢測，將染色體疾病的診斷在人類染色體研究歷史上,研究者一直致力于利用可視化的顯微鏡分析染色體的完整性除了非整倍體，染色體微缺失、重復、擴增和等基因組DNA失衡是導致胎兒發(fā)育遲緩、畸形、死胎、流產(chǎn)和其他先天性疾病的內(nèi)在原因40染色體疾病的診斷在人類染色體研究歷史上,研究者一直致力于利用是目前較為成熟的遺傳性疾病診斷技術(shù)傳統(tǒng)核型分析技術(shù)絨毛活檢取材孕中期羊膜腔穿刺羊水細胞培養(yǎng)染色體核型分析對非整倍體和重大染色體結(jié)構(gòu)異常診斷的準確率達到99%41是目前較為成熟的遺傳性疾病診斷技術(shù)傳統(tǒng)核型分析技術(shù)絨毛活檢取局限性材料受限，需要新鮮的組織、血樣進行活細胞培養(yǎng)不能分辨長度在10Mb以下染色體片斷的缺失、增加或易位染色體亞端粒區(qū)域異常診斷率較低單細胞分析

高分辨率分析42局限性材料受限，需要新鮮的組織、血樣進行活細胞培養(yǎng)單細胞分析熒光原位雜交技術(shù)（fluorescentin-situhybridization，F(xiàn)ISH)可對相應位點的缺失、重復、易位及多倍體等染色體異常作出診斷提高了染色體異常的診斷精度FISH探針能同時與分裂期染色體或間期核染色絲特異雜交----無需細胞培養(yǎng)，可用于單細胞分析Chromosome13q13-14Chromosome21q21熒光標記的DNA探針中期分裂相間期細胞核43熒光原位雜交技術(shù)（fluorescentin-situhFISH局限性只能對有限的位點進行檢測FISH依賴于探針的設計，檢測不明原因的病例難度較大對植入前胚胎的檢測，缺乏覆蓋全基因組檢測的能力44FISH局限性只能對有限的位點進行檢測10

Metaphasechromosomesblastomerenormal11normal22der11der22Reciprocaltranslocationt(11;22)(q25;q12)Metaphasechromosomesblastomerenormal13normal14der13-14Robertsoniantranslocationder(13;14)(q10;q10)FISHforstructuralaberrations2-colourFISH3-colourFISH45Metaphasechromosomesblast比較基因組雜交（comparativegenomichybridization,CGH)1：1混合雜交于同個正常男性中期分裂相Cot-1DNA雙色熒光強度比分析

正常DNA

病人DNAGainLossLOSSGain46比較基因組雜交（comparativegenomich1：1混合雜交于芯片（BAC.Oligoarray，SNP)Cot-1DNA計算機掃描，數(shù)據(jù)分析

病人DNA

正常DNAGainLoss微陣列比較基因組雜交技術(shù)（ArrayComparativegenomichybridization，aCGH)471：1混合雜交于芯片（BAC.Oligoarray，SNP)4814aCGH優(yōu)勢結(jié)合了基因芯片和傳統(tǒng)CGH的優(yōu)點更高的分辨率：G-顯帶的分辨率：10Mb

傳統(tǒng)CGH:5-10MbArrayCGH:100kb檢測基因組的拷貝數(shù)變化，可對染色體非整倍體、微缺失或微重復或其他不平衡的染色體異常檢測能夠?qū)θ旧w異常進行精確定位結(jié)合全基因擴增技術(shù)，可以進行胚胎全染色體組的檢測------PGS/PGD49aCGH優(yōu)勢結(jié)合了基因芯片和傳統(tǒng)CGH的優(yōu)點155016用于檢測CNV的染色體芯片（CMA)在下列情況應作為一線檢測手段非已知綜合癥的多發(fā)畸形非綜合癥型的發(fā)育遲緩/智力低下孤獨癥譜系疾病進一步明確發(fā)育遲緩、語言發(fā)育落后和其他尚不明確遺傳學病因的癥狀對于一些CMA檢出不平衡的病例，建議用細胞遺傳/FISH進行確認，同時對父母進行臨床遺傳評估和咨詢51用于檢測CNV的染色體芯片（CMA)在下列情況應作為一線檢測TheAmericanJournalofHumanGenetics86,749–764,May14,201021698例不明原因發(fā)育遲緩、低智，孤獨癥，多發(fā)畸形芯片（CMA)檢測：診斷率15%-20%核型分析：診斷率僅3%

發(fā)育障礙和智力低下等先天疾病首選CMA52TheAmericanJournalofHuman截止2011年，智力低下的arrayCGH研究論文就達4370篇5319CMA技術(shù)平臺Affymetrix芯片平臺

產(chǎn)前、產(chǎn)后檢測Bluegenome芯片平臺植入前胚胎檢測54CMA技術(shù)平臺Affymetrix芯片平臺BluegenoCMA的應用在輔助生殖臨床上進行全染色體范圍的非整倍體篩查在反復自然流產(chǎn)原因分析補充產(chǎn)前診斷的一個重要手段在智力低下、發(fā)育遲緩和體征多種畸形兒童致病原因分析在兒童自閉癥原因分析55CMA的應用在輔助生殖臨床上進行全染色體范圍的非整倍體篩查2高齡產(chǎn)婦復植入失敗復發(fā)性早期流產(chǎn)嚴重的男性不育癥父母為平衡易位、倒位攜帶者非整倍體是輔助生殖低妊娠率和高流產(chǎn)率的主要因素，PGS的目的是識別整倍體的正常胚胎轉(zhuǎn)移，以實現(xiàn)增加懷孕的機會CMA植入前胚胎遺傳學篩查/診斷適應人群56高齡產(chǎn)婦CMA植入前胚胎遺傳學篩查/診斷適應人群22CMA產(chǎn)前診斷適應人群希望更全面、更準確的了解胎兒染色體情況，以排除出生缺陷的可能性（生長發(fā)育遲緩，智力低下、自閉癥等原因）胎兒B超檢查發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常，但染色體核型分析正常者羊水染色體核型分析已發(fā)現(xiàn)異常，但無法確定異常染色體的確切位置或來源者胎兒發(fā)現(xiàn)新發(fā)的染色體相互易位，需進一步排除微缺失者57CMA產(chǎn)前診斷適應人群希望更全面、更準確的了解胎兒染色體情況CMA檢測先天性疾病的適應癥不同程度的智力低下生長發(fā)育遲緩、語言發(fā)育遲緩面容異常內(nèi)臟器官（如心臟、腎臟、生殖器）畸形認知/精神/行為問題（如多動癥、自閉癥）58CMA檢測先天性疾病的適應癥不同程度的智力低下24截止12年10月，共收病人233例

植入前診斷病例7例

難免流產(chǎn)流產(chǎn)物分析121例

產(chǎn)前診斷病例50例

產(chǎn)后先天性疾病診斷55例CMA檢測病例59截止12年10月，共收病人233例

植入前診斷病例7例

難植入前診斷病例反復流產(chǎn)反復IVF失敗父母為平衡易位攜帶者產(chǎn)前診斷病例新發(fā)平衡易位胎兒，排除染色體微缺失父母為平衡易位攜帶者B超診斷結(jié)構(gòu)異常胎兒：腦部結(jié)構(gòu)異常、先心、腎增大、單臍動脈、羊水過多、淋巴水囊瘤產(chǎn)后診斷自閉癥腦發(fā)育不全/智力低下先天性心臟病60植入前診斷病例26檢測標本活檢的單個卵裂球絨毛引產(chǎn)胎兒組織羊水臍血外周血61檢測標本活檢的單個卵裂球27Transfer(FreshCycle)NormalEmbryosWGAArray-CGHArray-CGHresultsSurePlexBluegnome24SureBluegnomeBlueFuseMultiD3Cleava