第八章平面色譜法概述平面色譜法的分類與原理薄層色譜法紙色譜法應(yīng)用與示例第八章平面色譜法概述1重點掌握：1.薄層色譜法和紙色譜法原理；2.薄層色譜法常用的固定相和流動相以及選擇方法；分配系數(shù)與保留體積之間的關(guān)系；薄板種類顯色方法；3.平面色譜中比移值與分子結(jié)構(gòu)關(guān)系；4.理解各色譜類型中組分的流出順序，薄層色譜操作、定性、定量方法；正相色譜與反相色譜。重點掌握：2§1概述色譜由來1906年植物學(xué)家TswettM.植物葉片石油醚浸取液碳酸鈣柱石油醚沖洗色帶固定相流動相色譜§1概述色譜由來1906年植物學(xué)家TswettM3§1概述一.色譜法(層析法)利用各組分物理化學(xué)性質(zhì)的不同，在流動相流經(jīng)固定相時，由于各組分在兩相間的吸附、分配或其它親和力的差異而產(chǎn)生不同速度的移動，最終達到分離的目的。分離基礎(chǔ)：差速遷移

(例:賽跑)§1概述一.色譜法(層析法)4二、分類：

1．按兩相分子的聚集狀態(tài)分：流動相固定相類型液相色譜(LC)液體固體液-固色譜液體液體液-液色譜氣體固體氣-固色譜氣體液體氣-液色譜氣相色譜（GC）2．按操作形式分：平面色譜

紙色譜薄層色譜柱色譜二、分類：流動相固定相類型液5

分配色譜：利用分配系數(shù)的不同

吸附色譜：利用物理吸附性能的差異

離子交換色譜：利用離子交換原理分子排阻色譜：利用排阻作用力的不同3．按分離機制分：四大基本類型分配色譜：利用分配系數(shù)的不同3．按分離機制分：四大基6§2平面色譜法的分類與原理平面色譜法(planechromatography)是在平面上進行分離的一種色譜方法；主要包括薄層色譜法、紙色譜法和薄層電泳法。薄層色譜法:固定相鋪在玻璃板、鋁箔或塑料板上成薄層紙色譜法：以紙為載體，固定相為紙上吸附的水分，流動相為有機溶劑薄層電泳法一、平面色譜法的分類§2平面色譜法的分類與原理平面色譜法(7二、平面色譜法參數(shù)（一）定性參數(shù)-保留值(組分與固定相作用力大小)1.比移值Rf(retardationfactor；Rf)溶質(zhì)移動的距離與流動相移動距離之比圖示

Rf范圍：0<Rf<1Rf=0.2~0.8（最佳）

next二、平面色譜法參數(shù)（一）定性參數(shù)-保留值(組分與固定相作用力8L0backL1L2L0backL1L292.相對比移值Rr

參考物與被測組分在完全相同條件下展開,可以消除系統(tǒng)誤差，大大提高重現(xiàn)性和可靠性；參考物可以是后加入純物質(zhì)，也可是樣品中已知組分;相對比移值Rs與組分、參考物性質(zhì)及色譜條件有關(guān)，范圍可以大于或小于12.相對比移值Rr參考物與被測組分在完全相同條件下展開,10（二）相平衡參數(shù)1.分配系數(shù)K和容量因子kK與溫度有關(guān)分配系數(shù)K容量因子k—質(zhì)量分配系數(shù)、分配比（二）相平衡參數(shù)1.分配系數(shù)K和容量因子kK與溫度有關(guān)分配11定時展開時R’＝Rf設(shè)R’表示單位時間內(nèi)一個分子在流動相中出現(xiàn)的幾率，也可以表示組分分子在平面上移動的速度2.K、k、Rf的關(guān)系Rf＝L/L0=ut/u0t定時展開時R’＝Rf設(shè)R’表示單位時間內(nèi)123.薄層板一定，Rf只與組分性質(zhì)有關(guān)，對于極性組分，展開劑極性↑大，Rf↑大展開劑極性↓小，Rf↓小1.Rf＝1K或k=0組分在前沿Rf＝0K或k=∞組分在原點討論：2.Rf與K有關(guān)，即與組分性質(zhì)（溶解度）以及薄層板和展開劑的性質(zhì)有關(guān)，K↑大，Rf↓小3.薄層板一定，Rf只與組分性質(zhì)有關(guān)，對于極性組分，1.13（三）板效參數(shù)1、理論塔板數(shù)—色譜分離性能指標(biāo)

n=16(L/W)2

L:原點到斑點中心的距離W：組分斑點的縱向?qū)挾?、塔板高度

H=L0/n

L0：原點到展開劑前沿的距離n越大，H越小。

斑點移動距離相等時，斑點越集中即W越小，n越大。（三）板效參數(shù)1、理論塔板數(shù)—色譜分離性能指標(biāo)2、塔板高度14（四）分離參數(shù)1、分離度(resolution;R)：兩相鄰斑點中心的距離與兩斑點平均寬度的比值L1、L2:分別為原點至兩半斑點中心的距離，W1、W2斑點的寬度。R=2(L2-L1)/(W1+W2)=2d/(W1+W2)（四）分離參數(shù)1、分離度(resolution;R)：兩152.分離數(shù)(separationnumber;SN)相鄰斑點分離度為1.177時，在Rf=0(原點)到Rf=1(溶劑前沿)之間能容納的色譜斑點數(shù)。SN=L0/(b0+b1)-1b0：Rf=0組分的半峰寬；b1：Rf=1組分的半峰寬SN越大，平面的容量越大。一般薄層板的分離數(shù)為7~10，高效薄層板可達10~20。SN是衡量分離容量的重要參數(shù)。2.分離數(shù)(separationnumber;SN)161．定義：將固定相均勻涂布在表面光滑的平板上，形成薄層而進行色譜分離和分析的方法2．操作過程：鋪板→活化→點樣→展開→定位(定性)/洗脫(定量)3．分離機制：吸附*、分配*、離子交換、空間排阻4．特點；分離能力強、靈敏度高、展開時間較短、顯色方便。5．應(yīng)用：藥物雜質(zhì)檢查、純度測定、定量next§3薄層色譜法1．定義：將固定相均勻涂布在表面光滑的平板上，3．分離機制：17東南大學(xué)出版社儀器分析第二版第八章平面色譜法課件18一、主要類型（一）吸附薄層色譜

固定相為吸附劑的薄層色譜。利用吸附劑對不同組分的吸附能力差異而實現(xiàn)分離。經(jīng)過吸附、解吸、再吸附、再解吸……最后混合物得到分離。K大，Rf值小，移動慢；K小，Rf大，移動快。（二）分配薄層色譜固定相為液體，吸留在載體上的薄層色譜。利用被分離組分在固定相與流動相中的分配系數(shù)不同而被分離。常用的是反相薄層色譜法，固定相是烷基化學(xué)鍵合相，展開劑是水及與水相溶的有機溶劑。一、主要類型（一）吸附薄層色譜（二）分配薄層色譜19二、吸附薄層色譜的吸附劑與展開劑(一）吸附劑硅膠：氫鍵吸附，適合與中性和酸性物質(zhì)。硅膠H、硅膠G、硅膠F254氧化鋁：可分為中性（pH7.5)、堿性（pH9.0）和酸性（pH4.0）（二）展開劑石油醚<環(huán)己烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烷<苯<甲苯<二氯甲烷<乙醚<氯仿<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<吡啶<酸<水活性分為5級，級數(shù)越大，含水量越多，吸附能力越弱，活度越小。二、吸附薄層色譜的吸附劑與展開劑(一）吸附劑（二）展開劑活20(三)吸附劑與展開劑的選擇展開劑的選擇：根據(jù)被測組分、吸附劑和展開劑本身的極性吸附劑的選擇：根據(jù)被測物極性和吸附劑的吸附能力

被測物極性強——弱極性吸附劑被測物極性弱——強極性吸附劑圖18－3(三)吸附劑與展開劑的選擇展開劑的選擇：根據(jù)被測組分、吸附211.從被測物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)考慮：(1)分子母核相同，分子中基團極性越大分子極性越大；極性基團數(shù)目越多極性越大，吸附能力越強；(2)分子中雙鍵多，極性大吸附能力強；(3)形成分子內(nèi)氫鍵吸附能力減弱。2.吸附劑的性能：極性小的物質(zhì)選用活度大的吸附劑；極性大的物質(zhì)選擇活度小的吸附劑。3.流動相的極性(三)吸附劑與展開劑的選擇相似相溶1.從被測物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)考慮：(三)吸附劑與展開劑的選22三、操作方法制板-點樣-展開-顯色定性分析——窄條定量分析——10×20cm硅膠G——自含粘和劑硅膠H——不含粘和劑，鋪板時另加入CMC硅膠FH254——含熒光劑，254nm紫外光照發(fā)綠光硅膠FH365——含熒光劑，365nm紫外光照發(fā)光（一）薄層板的制備（二）點樣：用毛細(xì)管或微量注射器，幾微升，2~4mm（三）展開：見續(xù)頁（四）顯色方法：日光、紫外光(254、365nm)顯色劑等三、操作方法制板-點樣-展開-顯色定性分析——窄條硅膠23展開：層析缸，預(yù)飽和，防止邊緣效應(yīng)浸入展開劑深度0.51.0cm，展開至整板3/4距離,標(biāo)記。1,2樣品3標(biāo)準(zhǔn)品前沿原點

???1.5-2.0cm2.0cm123展開：層析缸，預(yù)飽和，防止邊緣效應(yīng)浸入展開劑深度0.524四、定性和定量分析定性分析——利用Rf值，與對照品的Rf值比較，同時在一塊薄層板上進行。也可采用相對比移值定性。定量分析——洗脫法，直接定量法、薄層掃描法四、定性和定量分析定性分析——利用Rf值，與對照品的Rf值比25五、高效薄層色譜法高效薄層色譜法（highperformancethinlayerchromatography；HPTLC)所用的吸附劑顆粒很小(5μm或10μm)，用噴霧法制成高效薄層板。常用的有硅膠、氧化鋁、纖維素和化學(xué)鍵合相預(yù)制薄層板。五、高效薄層色譜法高效薄層色譜法（highperforma26六、薄層掃描法薄層掃描法是用一定強度光束照射薄層上的斑點，用儀器測量照射前后光束強度的變化，從而求得物質(zhì)含量的方法。檢測方法吸收測定法和熒光測定法測量方法投射法和反射法掃描方式單波長和雙波長定量方法外標(biāo)兩點法定量六、薄層掃描法薄層掃描法是用一定強度光束照射薄層上的斑點，用27§4紙色譜法以紙做載體的色譜法，分離原理屬于液-液分配色譜法，操作與薄層法類似。選紙→點樣→展開→顯色(定性)/洗脫(定量)固定相：紙纖維吸附的水流動相：與水不互溶的有機溶劑（飽和正丁醇）分離機制：同液-液分配色譜定性參數(shù)：討論：Rf與組分性質(zhì)、流動相及溶解度有關(guān)極性組分→易保留，Rf小（流動相極性↑，Rf↑）非極性組分→易流出，Rf大（流動相極性↑，Rf↓）§4紙色譜法以紙做載體的色譜法，分離原理屬于液-液分28東南大學(xué)出版社儀器分析第二版第八章平面色譜法課件29例1:用紙色譜分離組分A、B、C，以乙醇：水：冰醋酸（7：2：1）為展開劑時，Rf值的大小順序為Rfa＞Rfb＞Rfc；若改用苯：丙酮：冰醋酸（7.5：2：0.5）為展開劑時，則Rf值的大小順序可能是（）。A．Rfc＞Rfb＞RfaB．Rfb＞Rfc＞RfaC．Rfa＞Rfc＞RfbD．Rfc＞Rfa＞Rfb答案：(A）例1:用紙色譜分離組分A、B、C，以乙醇：水：冰醋酸（7：230例2組分在固定相中的質(zhì)量為mA(g)，在流動相中的質(zhì)量為mB(g)，而該組分在固定相中的濃度為CA(g/ml)，在流動相中的濃度為CB(g/ml)，則此組分的分配系數(shù)是（）。A.mA/mBB.mB/mA

C.mA/（mA+mB）D.CA/CB

E.CB/CA答案：D例2組分在固定相中的質(zhì)量為mA(g)，在流動相中的質(zhì)量為m31

例3、三種糖類化合物，其結(jié)構(gòu)如下，若用紙色譜分離，正丁醇為流動相，應(yīng)（）Rf最大。答案：C

例3、三種糖類化合物，其結(jié)構(gòu)如下，若用紙色譜分離，正丁醇為32例4、在硅膠粘合薄層板上，用氯仿作展開劑，對某極性物質(zhì)進行分離，Rf值幾乎為0，若欲得合適的Rf值，則要改變展開劑的極性，可選用下列哪種展開劑進行試驗?()A.氯仿和環(huán)己烷B.氯仿和甲醇混和溶劑C.環(huán)己烷

答案：B例4、在硅膠粘合薄層板上，用氯仿作展開劑，對某極性物質(zhì)進行分33例5.如使用硅膠或氧化鋁為固定相，其活性越高，則活度級數(shù)（）。A．越小B．越大C．不變

答案：A例6.甲﹑乙兩化合物，經(jīng)同一TLC系統(tǒng)展開后，它們的Rf值相同，則甲乙兩者(）A.是同一物質(zhì)B.可能是同一物質(zhì)C.不是同一物質(zhì)

答案：B例5.如使用硅膠或氧化鋁為固定相，其活性越高，則活度級數(shù)34作業(yè)：p224思考題2、5、6、7作業(yè)：p224思考題2、5、6、735第八章平面色譜法概述平面色譜法的分類與原理薄層色譜法紙色譜法應(yīng)用與示例第八章平面色譜法概述36重點掌握：1.薄層色譜法和紙色譜法原理；2.薄層色譜法常用的固定相和流動相以及選擇方法；分配系數(shù)與保留體積之間的關(guān)系；薄板種類顯色方法；3.平面色譜中比移值與分子結(jié)構(gòu)關(guān)系；4.理解各色譜類型中組分的流出順序，薄層色譜操作、定性、定量方法；正相色譜與反相色譜。重點掌握：37§1概述色譜由來1906年植物學(xué)家TswettM.植物葉片石油醚浸取液碳酸鈣柱石油醚沖洗色帶固定相流動相色譜§1概述色譜由來1906年植物學(xué)家TswettM38§1概述一.色譜法(層析法)利用各組分物理化學(xué)性質(zhì)的不同，在流動相流經(jīng)固定相時，由于各組分在兩相間的吸附、分配或其它親和力的差異而產(chǎn)生不同速度的移動，最終達到分離的目的。分離基礎(chǔ)：差速遷移

(例:賽跑)§1概述一.色譜法(層析法)39二、分類：

1．按兩相分子的聚集狀態(tài)分：流動相固定相類型液相色譜(LC)液體固體液-固色譜液體液體液-液色譜氣體固體氣-固色譜氣體液體氣-液色譜氣相色譜（GC）2．按操作形式分：平面色譜

紙色譜薄層色譜柱色譜二、分類：流動相固定相類型液40

分配色譜：利用分配系數(shù)的不同

吸附色譜：利用物理吸附性能的差異

離子交換色譜：利用離子交換原理分子排阻色譜：利用排阻作用力的不同3．按分離機制分：四大基本類型分配色譜：利用分配系數(shù)的不同3．按分離機制分：四大基41§2平面色譜法的分類與原理平面色譜法(planechromatography)是在平面上進行分離的一種色譜方法；主要包括薄層色譜法、紙色譜法和薄層電泳法。薄層色譜法:固定相鋪在玻璃板、鋁箔或塑料板上成薄層紙色譜法：以紙為載體，固定相為紙上吸附的水分，流動相為有機溶劑薄層電泳法一、平面色譜法的分類§2平面色譜法的分類與原理平面色譜法(42二、平面色譜法參數(shù)（一）定性參數(shù)-保留值(組分與固定相作用力大小)1.比移值Rf(retardationfactor；Rf)溶質(zhì)移動的距離與流動相移動距離之比圖示

Rf范圍：0<Rf<1Rf=0.2~0.8（最佳）

next二、平面色譜法參數(shù)（一）定性參數(shù)-保留值(組分與固定相作用力43L0backL1L2L0backL1L2442.相對比移值Rr

參考物與被測組分在完全相同條件下展開,可以消除系統(tǒng)誤差，大大提高重現(xiàn)性和可靠性；參考物可以是后加入純物質(zhì)，也可是樣品中已知組分;相對比移值Rs與組分、參考物性質(zhì)及色譜條件有關(guān)，范圍可以大于或小于12.相對比移值Rr參考物與被測組分在完全相同條件下展開,45（二）相平衡參數(shù)1.分配系數(shù)K和容量因子kK與溫度有關(guān)分配系數(shù)K容量因子k—質(zhì)量分配系數(shù)、分配比（二）相平衡參數(shù)1.分配系數(shù)K和容量因子kK與溫度有關(guān)分配46定時展開時R’＝Rf設(shè)R’表示單位時間內(nèi)一個分子在流動相中出現(xiàn)的幾率，也可以表示組分分子在平面上移動的速度2.K、k、Rf的關(guān)系Rf＝L/L0=ut/u0t定時展開時R’＝Rf設(shè)R’表示單位時間內(nèi)473.薄層板一定，Rf只與組分性質(zhì)有關(guān)，對于極性組分，展開劑極性↑大，Rf↑大展開劑極性↓小，Rf↓小1.Rf＝1K或k=0組分在前沿Rf＝0K或k=∞組分在原點討論：2.Rf與K有關(guān)，即與組分性質(zhì)（溶解度）以及薄層板和展開劑的性質(zhì)有關(guān)，K↑大，Rf↓小3.薄層板一定，Rf只與組分性質(zhì)有關(guān)，對于極性組分，1.48（三）板效參數(shù)1、理論塔板數(shù)—色譜分離性能指標(biāo)

n=16(L/W)2

L:原點到斑點中心的距離W：組分斑點的縱向?qū)挾?、塔板高度

H=L0/n

L0：原點到展開劑前沿的距離n越大，H越小。

斑點移動距離相等時，斑點越集中即W越小，n越大。（三）板效參數(shù)1、理論塔板數(shù)—色譜分離性能指標(biāo)2、塔板高度49（四）分離參數(shù)1、分離度(resolution;R)：兩相鄰斑點中心的距離與兩斑點平均寬度的比值L1、L2:分別為原點至兩半斑點中心的距離，W1、W2斑點的寬度。R=2(L2-L1)/(W1+W2)=2d/(W1+W2)（四）分離參數(shù)1、分離度(resolution;R)：兩502.分離數(shù)(separationnumber;SN)相鄰斑點分離度為1.177時，在Rf=0(原點)到Rf=1(溶劑前沿)之間能容納的色譜斑點數(shù)。SN=L0/(b0+b1)-1b0：Rf=0組分的半峰寬；b1：Rf=1組分的半峰寬SN越大，平面的容量越大。一般薄層板的分離數(shù)為7~10，高效薄層板可達10~20。SN是衡量分離容量的重要參數(shù)。2.分離數(shù)(separationnumber;SN)511．定義：將固定相均勻涂布在表面光滑的平板上，形成薄層而進行色譜分離和分析的方法2．操作過程：鋪板→活化→點樣→展開→定位(定性)/洗脫(定量)3．分離機制：吸附*、分配*、離子交換、空間排阻4．特點；分離能力強、靈敏度高、展開時間較短、顯色方便。5．應(yīng)用：藥物雜質(zhì)檢查、純度測定、定量next§3薄層色譜法1．定義：將固定相均勻涂布在表面光滑的平板上，3．分離機制：52東南大學(xué)出版社儀器分析第二版第八章平面色譜法課件53一、主要類型（一）吸附薄層色譜

固定相為吸附劑的薄層色譜。利用吸附劑對不同組分的吸附能力差異而實現(xiàn)分離。經(jīng)過吸附、解吸、再吸附、再解吸……最后混合物得到分離。K大，Rf值小，移動慢；K小，Rf大，移動快。（二）分配薄層色譜固定相為液體，吸留在載體上的薄層色譜。利用被分離組分在固定相與流動相中的分配系數(shù)不同而被分離。常用的是反相薄層色譜法，固定相是烷基化學(xué)鍵合相，展開劑是水及與水相溶的有機溶劑。一、主要類型（一）吸附薄層色譜（二）分配薄層色譜54二、吸附薄層色譜的吸附劑與展開劑(一）吸附劑硅膠：氫鍵吸附，適合與中性和酸性物質(zhì)。硅膠H、硅膠G、硅膠F254氧化鋁：可分為中性（pH7.5)、堿性（pH9.0）和酸性（pH4.0）（二）展開劑石油醚<環(huán)己烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烷<苯<甲苯<二氯甲烷<乙醚<氯仿<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<吡啶<酸<水活性分為5級，級數(shù)越大，含水量越多，吸附能力越弱，活度越小。二、吸附薄層色譜的吸附劑與展開劑(一）吸附劑（二）展開劑活55(三)吸附劑與展開劑的選擇展開劑的選擇：根據(jù)被測組分、吸附劑和展開劑本身的極性吸附劑的選擇：根據(jù)被測物極性和吸附劑的吸附能力

被測物極性強——弱極性吸附劑被測物極性弱——強極性吸附劑圖18－3(三)吸附劑與展開劑的選擇展開劑的選擇：根據(jù)被測組分、吸附561.從被測物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)考慮：(1)分子母核相同，分子中基團極性越大分子極性越大；極性基團數(shù)目越多極性越大，吸附能力越強；(2)分子中雙鍵多，極性大吸附能力強；(3)形成分子內(nèi)氫鍵吸附能力減弱。2.吸附劑的性能：極性小的物質(zhì)選用活度大的吸附劑；極性大的物質(zhì)選擇活度小的吸附劑。3.流動相的極性(三)吸附劑與展開劑的選擇相似相溶1.從被測物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)考慮：(三)吸附劑與展開劑的選57三、操作方法制板-點樣-展開-顯色定性分析——窄條定量分析——10×20cm硅膠G——自含粘和劑硅膠H——不含粘和劑，鋪板時另加入CMC硅膠FH254——含熒光劑，254nm紫外光照發(fā)綠光硅膠FH365——含熒光劑，365nm紫外光照發(fā)光（一）薄層板的制備（二）點樣：用毛細(xì)管或微量注射器，幾微升，2~4mm（三）展開：見續(xù)頁（四）顯色方法：日光、紫外光(254、365nm)顯色劑等三、操作方法制板-點樣-展開-顯色定性分析——窄條硅膠58展開：層析缸，預(yù)飽和，防止邊緣效應(yīng)浸入展開劑深度0.51.0cm，展開至整板3/4距離,標(biāo)記。1,2樣品3標(biāo)準(zhǔn)品前沿原點

???1.5-2.0cm2.0cm123展開：層析缸，預(yù)飽和，防止邊緣效應(yīng)浸入展開劑深度0.559四、定性和定量分析定性分析——利用Rf值，與對照品的Rf值比較，同時在一塊薄層板上進行。也可采用相對比移值定性。定量分析——洗脫法，直接定量法、薄層掃描法四、定性和定量分析定性分析——利用Rf值，與對照品的Rf值比60五、高效薄層色譜法高效薄層色譜法（highperformancethinlayerchromatography；HPTLC)所用的吸附劑顆粒很小(5μm或10μm)，用噴霧法制成高效薄層板。常用的有硅膠、氧化鋁、纖維素和化學(xué)鍵合相預(yù)制薄層板。五、高效薄層色譜法高效薄層色譜法（highperforma61六、薄層掃描法薄層掃描法是用一定強度光束照射薄層上的斑點，用儀器測量照射前后光束強度的變化，從而求得物質(zhì)含量的方法。檢測方法吸收測定法和熒光測定法測量方法投射法和反射法掃描方式單波長和雙波長定量方法外標(biāo)兩點法定量六、薄層掃描法薄層掃描法是用一定強度光束照射薄層上的斑點，用62§4紙色譜法以紙做載體的色譜法，分離原理屬于液-液分配色譜法，操作與薄層法類似。選紙→點樣→展開→顯色(定性)/洗脫(定量)固定相：紙纖維吸附的水流動相：與水不互溶的有機溶劑（飽和正丁醇）分離機制：同液-液分配色譜定性參數(shù)：討論：Rf與組分性質(zhì)、流動相及溶解度有關(guān)極性組分→易保留，Rf?。鲃酉鄻O性↑，