1.原核生物基因的表達調(diào)控（1）染色體DNA特點基因結(jié)構(gòu)簡潔有效，無多余序列，必須利用少量的DNA序列充分存儲必要的遺傳信息（操縱子、重疊基因）一個復制起點（ori），一個復制終點（ter）（2）基因表達特點1種RNA聚合酶，多種σ因子，通過調(diào)控σ因子的表達來調(diào)控不同種類基因表達

E.coli有7種σ70(housekeeping),σH,σE,σS,σN,σF,σFecI轉(zhuǎn)錄與翻譯同時進行，無轉(zhuǎn)錄后加工，翻譯后加工方式簡單（酶原）啟動子的重要保守區(qū)-35、-16、-10區(qū)等，RBS序列（SD序列與起始密碼子間隔3·9個堿基）

（3）基因表達調(diào)節(jié)特點

調(diào)控層次少：酶活調(diào)節(jié)-轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)-總體調(diào)控以轉(zhuǎn)錄調(diào)控為主，簡單而快速（mRNA半衰期比蛋白質(zhì)短，重新合成RNA在能耗上也比重新合成蛋白質(zhì)少）☆☆☆1.原核生物基因的表達調(diào)控（1）染色體DNA特點☆☆☆1目的基因表達課件22.原核生物的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式主要方式有：誘導、激活、阻遏、弱化、Riboswitch調(diào)控（核糖核酸開關(guān)）（1）誘導+激活：lac操縱子的表達調(diào)控CellnumbersGlucoseLactose葡萄糖>乳糖二次生長現(xiàn)象:葡萄糖被優(yōu)先利用，被基本耗盡時，細胞開始合成有關(guān)利用乳糖的酶（生長停滯期），將乳糖運入胞內(nèi)后繼續(xù)生長。GlucoseLactoseCellnumberssugarconcentrationCataboliteRepression(alsocalledglucoserepression)★2.原核生物的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式主要方式有：誘導、激活、阻遏3底物誘導誘導物乳糖（或異乳糖）缺乏時，lacI編碼的阻遏物具有活性，和操縱基因lacO結(jié)合后關(guān)閉轉(zhuǎn)錄，起負調(diào)控作用存在誘導物乳糖（或異乳糖）時，誘導物充當輔阻遏物，和阻遏蛋白結(jié)合使其失活，轉(zhuǎn)錄起始(效率低）,在cAMP-CRP結(jié)合在DNA的前提下，高效轉(zhuǎn)錄CRP：cyclicAMPReceptorProtein是乳糖操縱子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)物（或者CAP)★底物誘導誘導物乳糖（或異乳糖）缺乏時，lacI編碼的阻遏物具4

激活葡萄糖濃度高時，細胞內(nèi)cAMP濃度很低，CRP無法被激活，即使阻遏蛋白LacI失活，操縱子也不能高表達葡萄糖濃度低造成cAMP的大量生成，從而激活CRP啟動轉(zhuǎn)錄，起正調(diào)控作用★激活葡萄糖濃度高時，細胞內(nèi)cAMP濃度很低，CRP無法被5（2）阻遏:Trp操縱子阻遏當Trp很少時，由trpR編碼的阻遏蛋白沒有活性，不能和操縱基因結(jié)合，轉(zhuǎn)錄可以起始。當Trp大量存在時，阻遏物可以和作為輔阻遏物Trp結(jié)合而被激活，然后和操縱基因結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄不能起始。Trp反饋阻遏的解除使轉(zhuǎn)錄強度提高70倍★（2）阻遏:Trp操縱子阻遏當Trp很少時，由trpR編碼6

在大腸桿菌色氨酸操縱子中在存在一種轉(zhuǎn)錄的弱化調(diào)節(jié)，弱化作用的解除可使轉(zhuǎn)錄強度升高8-10倍。轉(zhuǎn)錄的mRNA的5‘端存在一段前導鏈，通過前導鏈二級結(jié)構(gòu)的變化、色氨酰-tRNA（色氨酸）以及核糖體的翻譯來控制轉(zhuǎn)錄是否繼續(xù)進行大腸桿菌色氨酸操縱子前導鏈RNA二級結(jié)構(gòu)受到氨基酰-tRNA分子的調(diào)節(jié)：

His、Trp、Phe等氨基酸操縱子（3）弱化:Trp操縱子轉(zhuǎn)錄弱化前導鏈的特點：含有一個起始密碼子和一個終止密碼子含有兩個連續(xù)的Trp密碼子四段能形成不同二級結(jié)構(gòu)的序列，可以形成終止子結(jié)構(gòu)或抗終止子結(jié)構(gòu)(莖環(huán)）★在大腸桿菌色氨酸操縱子中在存在一種轉(zhuǎn)錄的弱化調(diào)節(jié)，弱7無四環(huán)素存在時．tTA可特異的與TetO序列結(jié)合，目的基因得以表達；T7RNA聚合酶的效率比大腸桿菌RNA聚合酶高5倍左右，它能使質(zhì)粒沿模板連續(xù)轉(zhuǎn)錄幾周，許多外源終止子都不能有效地終止它的序列，因此它可轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶有效轉(zhuǎn)錄的序列。存在誘導物乳糖（或異乳糖）時，誘導物充當輔阻遏物，和阻遏蛋白結(jié)合使其失活，轉(zhuǎn)錄起始(效率低）,在cAMP-CRP結(jié)合在DNA的前提下，高效轉(zhuǎn)錄啟動子的重要保守區(qū)-35、-16、-10區(qū)等，RBS序列（SD序列與起始密碼子間隔3·9個堿基）KOZAK是一個女科學家，她總結(jié)出在真核生物中起始密碼子兩端序列為：G/N-C/N-C/N-ANNAUGG，如GCCACCAUGG、GCCAUGAUGG時，翻譯效率最高，特別是-3位的A對翻譯效率非常重要。pUCplasmid：數(shù)百拷貝轉(zhuǎn)錄的mRNA的5‘端存在一段前導鏈，通過前導鏈二級結(jié)構(gòu)的變化、色氨酰-tRNA（色氨酸）以及核糖體的翻譯來控制轉(zhuǎn)錄是否繼續(xù)進行poly(A)加尾信號：AAUAAAGCbox：保守序列是GTGGGCGGGGCAAT，常以多拷貝形式存在-90處。（1）誘導+激活：lac操縱子的表達調(diào)控一個復制起點（ori），一個復制終點（ter）轉(zhuǎn)錄前（DNA擴增、甲基化）l噬菌體早期左向轉(zhuǎn)錄啟動子，強度比Trp啟動子高11倍。以PichiaPastoris應(yīng)用最多。FK506:一種天然免疫抑制劑肽庫與固相上的靶蛋白分子經(jīng)過一定時間孵育后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體，然后以競爭受體或酸洗脫下與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細胞后經(jīng)繁殖擴增，進行下一輪洗脫，經(jīng)過3輪～5輪的“吸附-洗脫-擴增”后，與靶分子特異結(jié)合的噬菌體得到高度富集。（1）單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)夾心融合：如麥芽糖孔蛋白(Lamb)本身具有信號肽序列及錨定于外膜的序列，在其內(nèi)部合適位點插入外源蛋白，可實現(xiàn)細胞表面展示。以PichiaPastoris應(yīng)用最多。對于同一SD序列，有翻譯所必需的最小間隔。一旦轉(zhuǎn)錄開始后，核糖體結(jié)合在前導鏈上開始翻譯，核糖體緊隨在RNA聚合酶之后移動。Trp缺乏時，由于大多數(shù)色氨酰-tRNA空載，核糖體在兩個連續(xù)的Trp密碼子處暫時停滯或移動變慢，轉(zhuǎn)錄出的前導鏈2、3區(qū)配對形成抗終止子結(jié)構(gòu)，mRNA鏈繼續(xù)隨著RNA聚合酶的移動而延長，直到轉(zhuǎn)錄出完整的產(chǎn)物。無四環(huán)素存在時．tTA可特異的與TetO序列結(jié)合，目的基因得8Trp充足時，大多數(shù)色氨酰-tRNA載有Trp，核糖體快速通過兩個連續(xù)的Trp密碼子并占據(jù)前導鏈2區(qū)的一部分，使2、3區(qū)不能配對形成抗終止子，而是3、4區(qū)配對，剛好形成終止子結(jié)構(gòu)，mRNA鏈從RNA聚合酶上脫落下來，轉(zhuǎn)錄提前終止。目的基因表達課件9前導鏈RNA直接感應(yīng)終端產(chǎn)物的濃度而改變二級結(jié)構(gòu)：

THI（B1）-box、RFN（B2）-box和B12-box維生素操縱子、嘌呤操縱子等或與其代謝相關(guān)的基因，這種調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)也稱為“Riboswitch”(ribonucleotideswitch)

（4）Riboswitch★前導鏈RNA直接感應(yīng)終端產(chǎn)物的濃度而改變二級結(jié)構(gòu)：（4）Ri10可以體外通過對隨機RNA序列的篩選得到可以感應(yīng)特定代謝物濃度的適配體（aptamer），根據(jù)該代謝物濃度變化來開關(guān)目標基因的表達可以體外通過對隨機RNA序列的篩選得到可以感應(yīng)特定代謝物濃度113.原核表達體系（1）啟動子(基本類型2類：組成型和調(diào)控型）lac啟動子最早應(yīng)用的表達系統(tǒng)，含CRP結(jié)合位點及l(fā)acO，其轉(zhuǎn)錄受CRP正調(diào)控和lacI負調(diào)控。lacUV5啟動子

Plac的突變型,能夠在沒有CAP的存在下更有效地起始轉(zhuǎn)錄，該啟動子在轉(zhuǎn)錄水平上只受lacI的調(diào)控，因而隨后得到了更廣泛采用-35-10★3.原核表達體系（1）啟動子(基本類型2類：組成型和調(diào)控型12tac啟動子/trc啟動子

trp啟動子-35區(qū)和lacUV5-10區(qū)、lacO區(qū)雜合,啟動強度更高（約比PlacUV5高1個數(shù)量級,比trp啟動子高3倍），適合于高表達系統(tǒng)。tacI(-20為界限）tacII(-11為界，下游為人工合成的46bp片段）

trc啟動子和tacI類似受IPTG誘導啟動子的問題：無誘導物存在時本底表達高（甚至有一些基因不加誘導物時表達水平更恰當）

采用lacI突變基因：lacIq，突變后導致阻遏蛋白表達量增加tac啟動子/trc啟動子受IPTG誘導啟動子的問題：無13T7噬菌體啟動子只有T7RNA聚合酶才能使其啟動，故可以使克隆基因獨自得到表達。T7RNA聚合酶的效率比大腸桿菌

RNA聚合酶高5倍左右，它能使質(zhì)粒沿模板連續(xù)轉(zhuǎn)錄幾周，許多外源終止子都不能有效地終止它的序列，因此它可轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶有效轉(zhuǎn)錄的序列。這個系統(tǒng)可以高效表達其他系統(tǒng)不能有效表達的基因，但要注意用這種啟動子時宿主中必須含有T7RNA聚合酶，如BL21(DE3)菌株問題：表達強度超強，如何控制？實現(xiàn)誘導表達？利用lacUV5啟動子控制T7RNA聚合酶基因的表達，實現(xiàn)誘導在T7啟動子下游加上數(shù)個lacO序列，使其變?yōu)檎T導啟動子。PBAD

啟動子

PBAD

啟動子受阿拉伯糖誘導，無誘導物時本底表達低，啟動子效率較高。另外隨著誘導物濃度增加，啟動表達的細胞比例增加（而轉(zhuǎn)錄強度并不增加），即對單個細胞而言表達狀態(tài)只有“0”和“1”

PL啟動子l噬菌體早期左向轉(zhuǎn)錄啟動子，強度比Trp啟動子高11倍。PL啟動子受控于溫敏阻遏物cIts857。在低溫(30℃)時，cIts857阻遏蛋白可阻遏其轉(zhuǎn)錄。在高溫(45℃)時，cIts857失活，啟動子轉(zhuǎn)錄。適合于表達對大腸桿菌有毒的基因產(chǎn)物，缺點是溫度轉(zhuǎn)換也可誘導熱休克基因，其中有一些熱休克基因編碼蛋白酶。另外不利于大規(guī)模生產(chǎn)的應(yīng)用（升溫慢）。T7噬菌體啟動子PBAD啟動子PL啟動子14大腸桿菌典型的SD序列為“AAGGA”，枯草芽孢桿菌為“GGAGG”，一般來說，mRNA與核糖體16SrRNA(3′-AUUCCUCCA-5′).的結(jié)合程度越強，翻譯的起始效率就越高，

（2）RBS序列與起始密碼子在間隔相同的情況下，UAAGGAGG的SD序列比AAGGA的SD序列能使蛋白質(zhì)的產(chǎn)量提高3~6倍；對于同一SD序列，存在一最佳的間隔。AAGGA的間隔為5-7個核苷酸，而UAAGGAGG的間隔為4-8個核苷酸；對于同一SD序列，有翻譯所必需的最小間隔。AAGGA的最小間隔為5個核苷酸，而UAAGGAGG的最小間隔約為4個核苷酸，以保證起始密碼子剛好位于核糖體P位。大腸桿菌中的起始tRNA分子可以同時識別AUG、GUG和UUG三種起始密碼子，但識別頻率并不相同，通常GUG為AUG的50%，而UUG只及AUG的25%。在枯草芽孢桿菌中，多數(shù)基因的起始密碼子為AUG，為起始密碼子的最優(yōu)選擇。從AUG開始的前幾個密碼子堿基序列也至關(guān)重要，這一序列不能與mRNA的5’端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則會嚴重干擾mRNA在核糖體上的準確定位★大腸桿菌典型的SD序列為“AAGGA”，枯草芽孢桿菌為“G15E.coliB.subtilis原核生物中普遍存在重疊基因，而且重疊基因之間具有翻譯偶聯(lián)現(xiàn)象：即兩個基因的翻譯存在固定的計量學關(guān)系，機理主要有兩種：

核糖體移碼或滑動（40bp以內(nèi)），即同一核糖體翻譯重疊基因

mRNA形成二級結(jié)構(gòu)，上游基因的mRNA序列將下游基因的SD序列掩蔽，只有上游基因翻譯后才能破壞二級結(jié)構(gòu)而暴露出下游基因的SD序列，核糖體才能結(jié)合進行下游基因翻譯。核糖體與mRNA結(jié)合穩(wěn)定性在剛開始翻譯時較差，遇到二級結(jié)構(gòu)可能會影響翻譯效率。而在蛋白質(zhì)鏈從核糖體中延伸出來后（約10個殘基）穩(wěn)定性較強，通常遇到強度大的二級結(jié)構(gòu)也不會影響翻譯。E.coli原核生物中普遍存在重疊基因，而且重疊基因之間具有16（3）終止子表達的基因末端的終止子非常重要，可以避免RNA聚合酶的通讀而合成不必要的RNA序列。通讀后多余的RNA序列可能會形成不利于基因表達的二級結(jié)構(gòu)通讀會影響下游基因的轉(zhuǎn)錄，對于質(zhì)粒，還會影響其復制。

通常需要在表達載體的多克隆位點下游加上強終止子，對于T7啟動子這樣的強啟動子，甚至需要加2-3個連續(xù)的終止子以防止通讀。同理，也需要防止核糖體“通讀”而產(chǎn)生不必要的蛋白質(zhì)，一般在表達載體下游連續(xù)加上數(shù)個終止密碼子(UAAU是E.coli中最有效的轉(zhuǎn)錄終止序列)。（4）密碼子偏愛性在基因受體菌中表達基因供體菌中與密碼子對應(yīng)的tRNA基因根據(jù)受體菌的密碼子偏愛性進行序列優(yōu)化后重新合成外源基因（3）終止子表達的基因末端的終止子非常重要，可以避免RNA聚17（5）表達策略對于蛋白質(zhì)產(chǎn)品：采用高拷貝載體、誘導性強啟動子、高效RBS序列，以保證目的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量（或低拷貝載體上串聯(lián)多個基因）對于代謝物產(chǎn)品：由于表達的蛋白起到催化劑的作用，其量要適中，不能耗費大量碳氮源和能量去合成過量催化劑，既要避免過大的代謝負擔，也要避免底物的浪費。大量研究表明采用中低拷貝數(shù)載體（<20~30），中等強度啟動子效果較好，也可在染色體上整合進行表達，啟動子為強啟動子生產(chǎn)代謝物時通常要表達數(shù)個、甚至數(shù)十個基因，這些基因之間表達水平的穩(wěn)定和協(xié)調(diào)（拷貝數(shù)、啟動子和RBS強度的優(yōu)化）對于菌株的生產(chǎn)性能至關(guān)重要。MiniF質(zhì)粒:1~2拷貝pSC101:~5拷貝pACYC（p15A復制子）:15~20拷貝pBR322（ColE1復制子）:40~55拷貝pUCplasmid：數(shù)百拷貝★（5）表達策略對于蛋白質(zhì)產(chǎn)品：MiniF質(zhì)粒:1~218能和CTF（識別CATT的轉(zhuǎn)錄因子）相結(jié)合即使是原核基因，過量表達也會形成包涵體，原因可能為表達量過大，產(chǎn)物來不及正確折疊就發(fā)生聚集。轉(zhuǎn)錄前（DNA擴增、甲基化）VpEcR：融合蛋白，包含EcR的DNA結(jié)合區(qū)和VP16的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)這個系統(tǒng)可以高效表達其他系統(tǒng)不能有效表達的基因，但要注意用這種啟動子時宿主中必須含有T7RNA聚合酶，如BL21(DE3)菌株與能與親和層析柱上配基特異結(jié)合的“親和手柄”相融合，利于產(chǎn)物純化轉(zhuǎn)錄時先和其它轉(zhuǎn)錄激活因子（基本轉(zhuǎn)錄因子）相結(jié)合，再和聚合酶結(jié)合tet:500-fold轉(zhuǎn)錄后（mRNA拼接）lacUV5啟動子噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達而表達，同時,外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術(shù)。lacUV5啟動子TheFUSfocalpointwasmaintainedatthecenteroftemperatureisocontoursthroughoutthehyeprthermiaprocedure.TheFUSfocalpointwasmaintainedatthecenteroftemperatureisocontoursthroughoutthehyeprthermiaprocedure.靜息子：類似于減弱子，但對基因表達起完全抑制作用，造成基因沉默。通過控制溫度高低可實現(xiàn)基因表達水平的精細調(diào)節(jié)與能與親和層析柱上配基特異結(jié)合的“親和手柄”相融合，利于產(chǎn)物純化ThesoybeanheatshockpromoterGmhsp17.以PichiaPastoris應(yīng)用最多。（2）tet、lac－反式激活蛋白系統(tǒng)(off)殘留于細胞中的四環(huán)素難于清除、細胞吸收不平衡融合蛋白技術(shù)策略：外源基因連接到融合的蛋白的C端,不必另外設(shè)計SD序列,同時宿主蛋白N端的存在使得外源基因的表達較容易;外源蛋白常被宿主細胞的蛋白酶降解,當外源蛋白與宿主蛋白的部分序列融合后,會減低宿主細胞對產(chǎn)物的降解和宿主外膜蛋白融合，有利于在細胞表面表達（展示），對于底物利用、毒物降解、重金屬吸附等有關(guān)蛋白表達有利。和宿主信號肽融合，實現(xiàn)蛋白的胞外分泌（或分泌至周質(zhì)空間)，有利于避免蛋白酶降解、有利于蛋白產(chǎn)品的純化利用融合蛋白技術(shù)將藥物和能與病灶特異性結(jié)合的配基融合在一起構(gòu)成融合蛋白,目的蛋白可特異性的與靶細胞結(jié)合并將藥物導向病灶殺傷、殺死腫瘤細胞達到治療目的。與能與親和層析柱上配基特異結(jié)合的“親和手柄”相融合，利于產(chǎn)物純化缺點：由于融合序列的感染，有可能會影響外源蛋白的正常折疊，可以在兩者之間加入特殊蛋白酶識別的氨基酸序列，融合表達后酶切產(chǎn)品，去掉融合的非天然序列。

親和手柄酶切序列外源基因★能和CTF（識別CATT的轉(zhuǎn)錄因子）相結(jié)合融合蛋白技術(shù)策略：19可溶表達和包涵體表達真核基因在原核細胞中表達易形成包涵體，主要原因為缺乏翻譯后修飾導致折疊錯誤。即使是原核基因，過量表達也會形成包涵體，原因可能為表達量過大，產(chǎn)物來不及正確折疊就發(fā)生聚集。以包涵體形式表達的外源目的產(chǎn)物不具有物理活性,必須溶解包涵體進行復性,才能得到具有生物活性的蛋白。在通常情況下,包涵體的表達具有可避免產(chǎn)物被蛋白酶降解,包涵體表達的目的蛋白常在大腸桿菌中高效表達,目的蛋白的純化相對容易,能得到純度較高的目的蛋白,另外可以避免毒性蛋白的毒性。如果表達的蛋白質(zhì)用于結(jié)構(gòu)研究,則需可溶性表達，一般需降低表達量、同時表達分子伴侶（大多為熱激蛋白，HSP,heatshockingprotein），以有利于蛋白正確折疊、溶解。包涵體就是指由于蛋白的空間構(gòu)象與原來不符，如折疊不對，導致的溶解性降低，就會聚集到一起，形成包涵體?！锟扇鼙磉_和包涵體表達真核基因在原核細胞中表達易形成包涵體，主20大腸桿菌GroEL-GroES復合體。它由兩個堆疊的環(huán)和一個帽子結(jié)構(gòu)組成，其中環(huán)結(jié)構(gòu)由GroEL蛋白組成，在圖中以藍色和綠色表示；帽子結(jié)構(gòu)位于分子的一端，由GroES組成，在圖中以紅色和黃色表示。從分子俯視圖可以看出，由7個GroEL蛋白組成的環(huán)結(jié)構(gòu)的中央有一個蛋白質(zhì)大小的空穴。未折疊的蛋白質(zhì)就是進入這個空穴，并在其中完成折疊。分子伴侶是指細胞內(nèi)一類能介導其他蛋白正確裝配,其自身卻不是具有功能的最終裝配產(chǎn)物組成成分的物質(zhì)大腸桿菌GroEL-GroES復合體。它由兩個堆疊的環(huán)和一個21（6）表達載體

表達系統(tǒng)親和手柄抗原序列蛋白酶位點可變區(qū)多克隆位點保證表達分純定性定量分析切割融合序列正確讀碼插入片段BglII★（6）表達載體表達系統(tǒng)親和手柄抗原序列22常用的抗原序列：凝血酶，腸激酶，Xa因子常用的蛋白酶：常用的抗原序列：凝血酶，腸激酶，Xa因子常用的蛋白酶：234.真核細胞表達體系基因組特點：基因組規(guī)模大（109)，有充分的遺傳物質(zhì)，能形成各種特殊的基因結(jié)構(gòu)（內(nèi)含子，高度重復序列），單基因為主。組蛋白+DNA，形成核小體，進一步壓縮成致密的異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。普遍存在甲基化修飾。

基因表達調(diào)控特點：調(diào)控層次多而復雜：轉(zhuǎn)錄前（DNA擴增、甲基化）轉(zhuǎn)錄（增強子）轉(zhuǎn)錄后（mRNA拼接）翻譯（翻譯因子的磷酸化、轉(zhuǎn)鐵蛋白等）翻譯后（蛋白質(zhì)糖基化等修飾）對遺傳信息傳遞的準確性和穩(wěn)定性更有利轉(zhuǎn)錄依然是真核生物基因表達調(diào)控的主要環(huán)節(jié)4.1真核細胞基因表達特點☆☆4.真核細胞表達體系基因組特點：基因組規(guī)模大（109)，有充24啟動子特點：

有三種不同的RNA聚合酶，因此也有三種不同的啟動子，其中以啟動子Ⅱ最為復雜，和原核的啟動子有很多不同：有多種元件：TATA框，GC框，CATT框，OCT等，起到控制轉(zhuǎn)錄效率和選擇起始位點的作用結(jié)構(gòu)不恒定。有的有多種框盒，有的只有TATA框和GC框，如SV40早期基因啟動子。它們的位置、序列、距離和方向都不完全相同，有的有遠距離的調(diào)控元件存在，如增強子；不直接和RNApol結(jié)合。轉(zhuǎn)錄時先和其它轉(zhuǎn)錄激活因子（基本轉(zhuǎn)錄因子）相結(jié)合，再和聚合酶結(jié)合酶的種類存在功能對抑制物的敏感性RNA聚合酶Ⅰ核仁合成rRNA前體不敏感RNA聚合酶Ⅱ核質(zhì)合成mRNA前體及大多數(shù)snRNA低濃度敏感RNA聚合酶Ⅲ核質(zhì)合成5SrRNA前體、tRNA前體及其他的核和胞質(zhì)小RNA前體高濃度敏感★啟動子特點：有三種不同的RNA聚合酶，因此也有三種25上游元件：CAATbox：保守序列是GGCTCAATCT，一般位于上游-75--80bp左右，控制轉(zhuǎn)錄起始活性。能和CTF（識別CATT的轉(zhuǎn)錄因子）相結(jié)合GCbox：保守序列是GTGGGCGGGGCAAT，常以多拷貝形式存在-90處。它的作用也是控制轉(zhuǎn)錄效率。核心元件：

TATAT85A97T93A85A63A83A50，常在起始位點的上游-25左右，相當于原核的-10序列，對轉(zhuǎn)錄起始正確定位，控制轉(zhuǎn)錄效率。

轉(zhuǎn)錄起始位點附近的啟始子（initiator，Inr）Py2CAPy5構(gòu)成，位于-3～+5，可能提供RNApolⅡ識別位點。

遠端調(diào)控區(qū)：增強子，其特點是：具有遠距離效應(yīng)，常在上游-200bp處，即使相距十幾Kb也能發(fā)揮作用無方向性，無論在靶基因的上游，下游或內(nèi)部都可發(fā)揮增強轉(zhuǎn)錄作用順式調(diào)節(jié)，只調(diào)節(jié)同一染色體的靶基因，而對其它染色體上基因無作用無物種和基因的特異性，可以接到異源基因上發(fā)揮作用；具有組織特異性，如抗體基因的增強子只有在B淋巴細胞中才起作用。其作用和DNA構(gòu)象有關(guān),有的增強子可以對外部信號產(chǎn)生反應(yīng)，如熱/激素等II類啟動子一般由核心元件和上游元件組成。★上游元件：CAATbox：保守序列是GGCTCAATCT，26減弱子，在某些基因的上游遠端或下游遠端具有負調(diào)節(jié)序列，其作用不受距離和方向的影響，叫做減弱子。上游激活序列（upstreamactivatingseguencesUASs）UASs是酵母中遠上游序列類似于增強子。它僅影響轉(zhuǎn)錄程度，對位點選擇不起作用。和增強子不同的是它有方向性，不能在啟動子的下游起作用。它結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子是GCN4和GAL4，識別位點為ATGACTCAT。靜息子：類似于減弱子，但對基因表達起完全抑制作用，造成基因沉默?；?通用）轉(zhuǎn)錄因子識別TATA或者Inr，RNA聚合酶II再和基本轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復合體，在轉(zhuǎn)錄激活蛋白的作用下，復合體起始轉(zhuǎn)錄。初級轉(zhuǎn)錄本經(jīng)過剪切、拼接、5‘端加帽和3’端加尾成為成熟的可翻譯的mRNA減弱子，在某些基因的上游遠端或下游遠端具有負調(diào)節(jié)序列，其作用27目的基因表達課件28pBR322（ColE1復制子）:40~55拷貝以轉(zhuǎn)錄調(diào)控為主，簡單而快速（mRNA半衰期比蛋白質(zhì)短，重新合成RNA在能耗上也比重新合成蛋白質(zhì)少）這個系統(tǒng)可以高效表達其他系統(tǒng)不能有效表達的基因，但要注意用這種啟動子時宿主中必須含有T7RNA聚合酶，如BL21(DE3)菌株前導鏈RNA二級結(jié)構(gòu)受到氨基酰-tRNA分子的調(diào)節(jié)：噬菌體展示技術(shù)的局限性（3）弱化:Trp操縱子轉(zhuǎn)錄弱化該轉(zhuǎn)錄因子可和銅離子或銀離子結(jié)合而改變?yōu)榫哂修D(zhuǎn)錄活性的構(gòu)象前導鏈RNA二級結(jié)構(gòu)受到氨基酰-tRNA分子的調(diào)節(jié)：hsp70Bpromoter:inductionratiosupto800-foldhumanhsp70B’promoter：inductionratiosupto8000-fold.只有T7RNA聚合酶才能使其啟動，故可以使克隆基因獨自得到表達。轉(zhuǎn)錄前（DNA擴增、甲基化）理想誘導表達系統(tǒng)的特點四環(huán)素自身的藥物動力學性質(zhì)會影響系統(tǒng)對基因表達快速、精確、通過突變TetR的四個氨基酸殘基(Glu71Lys，Asp95Asn，Leu101Ser，Gly102Asp)得到了r-TetR,它不能識別其特異的DNA靶序列(TetO)，當有強力霉素存在時，r-TetR才可與TetO結(jié)合啟動轉(zhuǎn)錄humanhsp70B’promoter：inductionratiosupto8000-fold.這個系統(tǒng)可以高效表達其他系統(tǒng)不能有效表達的基因，但要注意用這種啟動子時宿主中必須含有T7RNA聚合酶，如BL21(DE3)菌株殘留于細胞中的四環(huán)素難于清除、細胞吸收不平衡FK506、RU486誘導系統(tǒng)它結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子是GCN4和GAL4，識別位點為ATGACTCAT。lacI基因表達的改造：可持續(xù)大量在宿主中表達，終止高拷貝的啟動子的轉(zhuǎn)錄，減少本底表達在通常情況下,包涵體的表達具有可避免產(chǎn)物被蛋白酶降解,包涵體表達的目的蛋白常在大腸桿菌中高效表達,目的蛋白的純化相對容易,能得到純度較高的目的蛋白,另外可以避免毒性蛋白的毒性。轉(zhuǎn)錄與翻譯同時進行，無轉(zhuǎn)錄后加工，翻譯后加工方式簡單（酶原）E.一個復制起點（ori），一個復制終點（ter）coli有7種σ70(housekeeping),σH,σE,σS,σN,σF,σFecIMiniF質(zhì)粒:1~2拷貝KOZAK序列NNNPuNNATGG無四環(huán)素存在時．tTA可特異的與TetO序列結(jié)合，目的基因得以表達；其作用和DNA構(gòu)象有關(guān),有的增強子可以對外部信號產(chǎn)生反應(yīng)，如熱/激素等來源于哺乳動物細胞，應(yīng)用于植物細胞轉(zhuǎn)錄的mRNA的5‘端存在一段前導鏈，通過前導鏈二級結(jié)構(gòu)的變化、色氨酰-tRNA（色氨酸）以及核糖體的翻譯來控制轉(zhuǎn)錄是否繼續(xù)進行mRNA形成二級結(jié)構(gòu)，上游基因的mRNA序列將下游基因的SD序列掩蔽，只有上游基因翻譯后才能破壞二級結(jié)構(gòu)而暴露出下游基因的SD序列，核糖體才能結(jié)合進行下游基因翻譯。真核基因在原核細胞中表達易形成包涵體，主要原因為缺乏翻譯后修飾導致折疊錯誤。與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動物細胞，不會發(fā)生超糖基化。響應(yīng)時間：數(shù)十秒～數(shù)十分鐘但該系統(tǒng)展示的數(shù)目為平均1個分子/噬菌體，這表明外源蛋白質(zhì)或多肽可能干擾了λ噬菌體的尾部裝配。humanhsp70B’promoter：inductionratiosupto8000-fold.His、Trp、Phe等氨基酸操縱子（3）弱化:Trp操縱子轉(zhuǎn)錄弱化（1）染色體DNA特點TATAT85A97T93A85A63A83A50，常在起始位點的上游-25左右，相當于原核的-10序列，對轉(zhuǎn)錄起始正確定位，控制轉(zhuǎn)錄效率。pBR322（ColE1復制子）:40~55拷貝在通常295‘端甲基化的帽子為核糖體結(jié)合位點，和其40S亞基發(fā)生作用，40S亞基結(jié)合后沿鏈滑動到AUG處，此時核糖體組裝完整（加上60S亞基），開始翻譯。除此之外，一些mRNA（真核病毒和少數(shù)真核基因）在起始密碼子上游還有IRES位點（internalribosomeentrysites，內(nèi)部核糖體進入位點）。這類RNA序列能折疊成類似于起始tRNA的結(jié)構(gòu)，從而介導核糖體與RNA結(jié)合（40S亞基P位點，起始蛋白質(zhì)翻譯）

不同于原核生物的SD序列，IRES序列長度變化很大，從9bp到數(shù)百bp長，IRES的存在可以很方便的構(gòu)建人工的真核操縱子，不同翻譯強度的IRES序列，也為不同基因的表達協(xié)調(diào)提供了可選的元件。如果第一個ATG周圍的序列符合KOZAK序列（NNNPuNNATGG),小亞基將會在此駐留較長的時間，從而更有利于組裝成完整的核糖體，使翻譯效率提高

★5‘端甲基化的帽子為核糖體結(jié)合位點，和其40S亞基發(fā)生作用，30KOZAK是一個女科學家，她總結(jié)出在真核生物中起始密碼子兩端序列為：G/N-C/N-C/N-ANNAUGG，如GCCACCAUGG、GCCAUGAUGG時，翻譯效率最高，特別是-3位的A對翻譯效率非常重要。該序列被后人稱為Kozak序列，并被應(yīng)用于表達載體的構(gòu)建中。Kozak序列為統(tǒng)計規(guī)律，第4位的偏好堿基為G，AUG的5’端約15bp范圍的側(cè)翼序列內(nèi)不含堿基T。真核基因表達時通常在AUG前需設(shè)計GCCACC的kozak序列，或使用基因上游序列自帶的kozak序列，避免核糖體出現(xiàn)leakyscanKOZAK序列NNNPuNNATGG★KOZAK是一個女科學家，她總結(jié)出在真核生物中起始密碼子兩端314.2真核誘導表達體系對于組成型表達系統(tǒng)，常用來源于病毒的啟動子和增強子，或者看家基因的啟動子（如gapA/GAPDH的啟動子）如SV40病毒早期啟動子和增強子、Rouse肉瘤病毒基因組長末端重復序列—LTR(RSV)、人類巨細胞病毒等(CMV)。poly(A)加尾信號：AAUAAA真核表達載體含有兩類組件：原核生物中使用的組件(包括復制子、抗性篩選基因和多克隆位點等)和真核宿主細胞中表達所需的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件（啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終止和加poly-A信號序列、mRNA剪接信號(內(nèi)含子兩側(cè))序列、能在宿主細胞中復制或增殖的序列以及藥物抗性基因等）4.2真核誘導表達體系對于組成型表達系統(tǒng)，常用來源于病毒的啟32無誘導物存在時表達水平低:既本底表達水平低或無泄漏誘導物存在時表達水平很高，且表達水平易受誘導物控制啟動子系統(tǒng)不干擾宿主細胞的正常生理活動,系統(tǒng)不影響宿主中其它基因的表達，不易引起免疫識別誘導物易進入細胞，半衰期短，不易在體內(nèi)殘留理想誘導表達系統(tǒng)的特點內(nèi)源誘導啟動子熱激啟動子、金屬硫蛋白啟動子等重組誘導系統(tǒng)

lac、tet阻遏蛋白系統(tǒng)激素類誘導系統(tǒng)

FK506、RU486誘導系統(tǒng)無誘導物存在時表達水平低:既本底表達水平低或無泄漏理想誘導表33(1)熱激（誘導）啟動子的機理(2)常用的熱激啟動子：

熱激啟動子熱激轉(zhuǎn)錄因子heatshockfactor1(HSF1)：負責熱激啟動子的轉(zhuǎn)錄熱激元件heatshockelements(HSEs)：HSF1特異結(jié)合在DNA上的序列熱激（誘導）啟動子一般含有2～4個熱激元件和一個TATA區(qū)常溫下HSF1為單體，高溫條件下變?yōu)橛姓{(diào)節(jié)活性的三聚體，并和HSEs特異結(jié)合而啟動轉(zhuǎn)錄Drosophilahsp70

Humanhsp70ThesoybeanheatshockpromoterGmhsp17.5-E★(1)熱激（誘導）啟動子的機理熱激啟動子熱激轉(zhuǎn)錄因子hea34誘導機理的普遍性

在真核細胞中普遍存在熱激系統(tǒng)，HSF保守性高，不必額外表達轉(zhuǎn)錄因子基因表達快速高效

hsp70Bpromoter:inductionratiosupto800-foldhumanhsp70B’promoter：inductionratiosupto8000-fold.

響應(yīng)時間：數(shù)十秒～數(shù)十分鐘基因表達控制方便，對宿主細胞無傷害通過控制溫度高低可實現(xiàn)基因表達水平的精細調(diào)節(jié)對基因表達的時間控制和空間控制

非常適合基因療法：腺病毒作為載體攜帶熱激啟動子控制的治療基因感染正常細胞和癌細胞電磁輻射或聚焦超聲波技術(shù)局部加熱癌組織(3)熱激啟動子的特點★誘導機理的普遍性(3)熱激啟動子的特點★35一個實例：一個實例：36CouplingFUS(FocusedUltrasound)withMR(magneticresonance)temperaturemappingCouplingFUS(FocusedUltrasoun37(A)Temperatureimageobtainedattheendofthe3minheat-shock,superimposedontheanatomicalimagewithayellowbrokenlinesurroundingthetumor.TheFUSfocalpointwasmaintainedatthecenteroftemperatureisocontoursthroughoutthehyeprthermiaprocedure.(B)Opticalviewoftheskinandtumorareafollowingheat-shockwithayellowbrokenlinesurroundingthetumor(A)Temperatureimageobtained38(1)金屬硫蛋白（metallothioneins）啟動子

Metallothioneins(MT)：一類富含半胱氨酸的低分子量金屬結(jié)合蛋白，能幫助細胞抵抗重金屬的毒性。

MT啟動子的強度受到重金屬濃度的調(diào)節(jié)Theyeastcopper-MTsystem:

組成型表達的ace1基因,編碼金屬應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子該轉(zhuǎn)錄因子可和銅離子或銀離子結(jié)合而改變?yōu)榫哂修D(zhuǎn)錄活性的構(gòu)象

Cu-ACE1結(jié)合到金屬硫蛋白啟動子上啟動轉(zhuǎn)錄。(2)糖皮質(zhì)激素誘導啟動子

糖皮質(zhì)激素與糖皮質(zhì)激素受體（也是一種轉(zhuǎn)錄因子）結(jié)合，使受體結(jié)合在啟動子的糖皮質(zhì)激素響應(yīng)元件上，從而啟動轉(zhuǎn)錄化學物質(zhì)誘導啟動子(1)金屬硫蛋白（metallothioneins）啟動子化39甲醇酵母表達系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的酵母表達系統(tǒng)。以PichiaPastoris

應(yīng)用最多。表達載體中含有甲醇酵母醇氧化酶基因1(AOX1)，在該基因的啟動子(PAXOI)作用下，外源基因得以誘導表達。PAXOI

是一個強誘導型啟動子，在以葡萄糖或甘油為碳源時，表達受到抑制，而在以甲醇為唯一碳源時啟動子可被誘導激活，甲醇酵母一般先在含甘油的培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)至高濃度。再以甲醇為碳源，誘導表達外源蛋白。這樣可以大大提高表達產(chǎn)量。利用甲醇酵母表達外源性蛋白質(zhì)其產(chǎn)量往往可達1~10克/L級，效率遠高于其他系統(tǒng)與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動物細胞，不會發(fā)生超糖基化。缺點：一般需很長時間才能達到誘導峰值水平，而甲醇是高毒性、高危險性化工產(chǎn)品，使得實驗操作過程中存在不小的危害性。且不宜于食品等蛋白生產(chǎn)（3）甲醇誘導系統(tǒng)甲醇酵母表達系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的酵母表達系統(tǒng)。以Pich40lacI基因表達的改造：可持續(xù)大量在宿主中表達，終止高拷貝的啟動子的轉(zhuǎn)錄，減少本底表達啟動子的改造：即被宿主識別又具有阻遏蛋白結(jié)合位點（序列）（1）真核宿主中的lac、tet阻遏蛋白系統(tǒng)(on)阻遏蛋白的毒性誘導物的毒性lac:50-foldtet:500-fold重組誘導系統(tǒng)

——lac、tet阻遏蛋白系統(tǒng)★lacI基因表達的改造：可持續(xù)大量在宿主中表達，終止高拷貝的41（2）tet、lac－反式激活蛋白系統(tǒng)(off)融合蛋白：將TetR或LacI蛋白與反式激活蛋白相連啟動子的改造：含多個TetR或LacI結(jié)合區(qū)（O區(qū)）誘導效率很高，但細胞需長期置于含四環(huán)素或IPTG的培養(yǎng)基中培養(yǎng)來阻止轉(zhuǎn)錄，誘導時不便捷、誘導響應(yīng)時間較長。tettransactivatorgene（2）tet、lac－反式激活蛋白系統(tǒng)(off)融合蛋白：42tTA：由阻遏蛋白TetR與單純皰疹病毒VP16蛋白羧基末端的一段轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合而成，tTA位于調(diào)節(jié)質(zhì)粒上，其表達受人巨細胞病毒啟動子IE(PhCMV)的調(diào)控。反應(yīng)質(zhì)粒中含有目的基因，其上游為人巨細胞病毒的最小啟動子(minimalCMVpromoter，PCMV)，啟動子上游為四環(huán)素響應(yīng)元件(tet—responsiveelement，TRE)。TRE包含7個正向重復的操縱基因(tetO)，可以和TetR（或tTA)結(jié)合。無四環(huán)素存在時．tTA可特異的與TetO序列結(jié)合，目的基因得以表達；當有四環(huán)素時(0．1g／m1)存在時，tTA與TetO分離，基因轉(zhuǎn)錄被終止。

VP16蛋白：可促進真核細胞的基本轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在啟動子上的一種轉(zhuǎn)錄因子。最小啟動子：單靠自身序列無法使轉(zhuǎn)錄進行的啟動子，需要其他轉(zhuǎn)錄因子（如一些上游元件或增強子等）的幫助才能正常啟動。即基本轉(zhuǎn)錄因子自身無法有效啟動轉(zhuǎn)錄。例：雙質(zhì)粒Tet-off基因表達系統(tǒng)CaMV35Sminimalpromoter：[-60,-46]~+1，缺少-90區(qū)tTA：由阻遏蛋白TetR與單純皰疹病毒VP16蛋白羧基末端43存在誘導物乳糖（或異乳糖）時，誘導物充當輔阻遏物，和阻遏蛋白結(jié)合使其失活，轉(zhuǎn)錄起始(效率低）,在cAMP-CRP結(jié)合在DNA的前提下，高效轉(zhuǎn)錄對基因表達的時間控制和空間控制PL啟動子受控于溫敏阻遏物cIts857。通過突變TetR的四個氨基酸殘基(Glu71Lys，Asp95Asn，Leu101Ser，Gly102Asp)得到了r-TetR,它不能識別其特異的DNA靶序列(TetO)，當有強力霉素存在時，r-TetR才可與TetO結(jié)合啟動轉(zhuǎn)錄而在蛋白質(zhì)鏈從核糖體中延伸出來后（約10個殘基）穩(wěn)定性較強，通常遇到強度大的二級結(jié)構(gòu)也不會影響翻譯。tTA：由阻遏蛋白TetR與單純皰疹病毒VP16蛋白羧基末端的一段轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合而成，tTA位于調(diào)節(jié)質(zhì)粒上，其表達受人巨細胞病毒啟動子IE(PhCMV)的調(diào)控。5‘端甲基化的帽子為核糖體結(jié)合位點，和其40S亞基發(fā)生作用，40S亞基結(jié)合后沿鏈滑動到AUG處，此時核糖體組裝完整（加上60S亞基），開始翻譯。其作用和DNA構(gòu)象有關(guān),有的增強子可以對外部信號產(chǎn)生反應(yīng)，如熱/激素等pBR322（ColE1復制子）:40~55拷貝熱激轉(zhuǎn)錄因子heatshockfactor1(HSF1)：負責熱激啟動子的轉(zhuǎn)錄lacI基因表達的改造：可持續(xù)大量在宿主中表達，終止高拷貝的啟動子的轉(zhuǎn)錄，減少本底表達（3）弱化:Trp操縱子轉(zhuǎn)錄弱化（3）弱化:Trp操縱子轉(zhuǎn)錄弱化熱激元件heatshockelements(HSEs)：HSF1特異結(jié)合在DNA上的序列啟動子的改造：含多個TetR或LacI結(jié)合區(qū)（O區(qū)）誘導物易進入細胞，半衰期短，不易在體內(nèi)殘留(2)糖皮質(zhì)激素誘導啟動子利用融合蛋白技術(shù)將藥物和能與病灶特異性結(jié)合的配基融合在一起構(gòu)成融合蛋白,目的蛋白可特異性的與靶細胞結(jié)合并將藥物導向病灶殺傷、殺死腫瘤細胞達到治療目的。CRP：cyclicAMPReceptorProtein是乳糖操縱子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)物（或者CAP)AAGGA的間隔為5-7個核苷酸，而UAAGGAGG的間隔為4-8個核苷酸；一個復制起點（ori），一個復制終點（ter）被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，以利于靶分子的識別和結(jié)合。（3）反tet、lac-反式激活蛋白系統(tǒng)(on)通過突變TetR的四個氨基酸殘基(Glu71Lys，Asp95Asn，Leu101Ser，Gly102Asp)得到了r-TetR,它不能識別其特異的DNA靶序列(TetO)，當有強力霉素存在時，r-TetR才可與TetO結(jié)合啟動轉(zhuǎn)錄誘導效率較高、使用便捷、誘導響應(yīng)時間短存在誘導物乳糖（或異乳糖）時，誘導物充當輔阻遏物，和阻遏蛋白44重組誘導系統(tǒng)

（1）類固醇的異種運用以四環(huán)素類藥物作為調(diào)節(jié)物的調(diào)控系統(tǒng)的缺點：

殘留于細胞中的四環(huán)素難于清除、細胞吸收不平衡四環(huán)素自身的藥物動力學性質(zhì)會影響系統(tǒng)對基因表達快速、精確、高效的控制類固醇（ecdysteroid）誘導系統(tǒng)在誘導物的清除和藥物動力學方面都有較大的優(yōu)勢

類固醇是親脂性化合物，可快速有效的進入各種組織細胞，半衰期短，不易在體內(nèi)殘留，是一種較為理想的基因表達誘導物異種類固醇的運用不會激活宿主細胞的內(nèi)源信號途徑重組誘導系統(tǒng)

（1）類固醇的異種運用45例1：蛻皮激素（ecdysone）誘導表達系統(tǒng)蛻皮激素受體蛋白EcR和超氣孔蛋白USP在蛻皮激素存在時形成二聚體，其和啟動子上游的蛻皮激素響應(yīng)元件（EcREX4）結(jié)合后啟動轉(zhuǎn)錄類維生素X受體幕黎甾酮/蛻皮激素

VpEcR：融合蛋白，包含EcR的DNA結(jié)合區(qū)和VP16的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)超氣孔蛋白（USP)蛻皮激素受體（EcR)來源于昆蟲，應(yīng)用于哺乳動物細胞例1：蛻皮激素（ecdysone）誘導表達系統(tǒng)蛻皮激素受體46花椰菜35Spromoter的－49～＋9區(qū)例2：腎上腺（糖）皮質(zhì)激素glucocorticoid誘導系統(tǒng)在植物中的應(yīng)用

對于植物中的基因表達應(yīng)用，該系統(tǒng)簡單、并且無多效性（pleiotropiceffects）inplants.酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合域糖皮質(zhì)激素受體蛋白的激素結(jié)合域VP16反式激活蛋白的轉(zhuǎn)錄激活域糖皮質(zhì)激素控制GVG嵌合轉(zhuǎn)錄因子和DNA的結(jié)合：無激素GVG構(gòu)象不利于GAL4結(jié)合域和UAS結(jié)合，反之，可以結(jié)合來源于哺乳動物細胞，應(yīng)用于植物細胞誘導效率低：約100倍GVG融合體：表達元件：花椰菜35Spromoter的－49～＋9區(qū)例2：腎上47雌激素三苯氧胺

真核細胞中一些轉(zhuǎn)錄因子的活性受到熱激蛋白的影響，通過誘導物(雌激素）使轉(zhuǎn)錄因子由無活性形式變?yōu)橛谢钚缘男问?，雌激素的誘導：雌激素與受體蛋白結(jié)合后改變其構(gòu)象，使受體蛋白與Hsp分離而具有轉(zhuǎn)錄激活作用。雌激素真核細胞中一些轉(zhuǎn)錄因子的活性受到48RU486：人孕酮拮抗物（替代孕酮誘導）hPRB891：人孕酮受體，可和孕酮及RU486，HSP90結(jié)合融合轉(zhuǎn)錄因子GALVP的構(gòu)建：GAL4DNA結(jié)合區(qū)域+VP16轉(zhuǎn)錄激活區(qū)＋hPRB891配體結(jié)合域無RU486時，GALVP單體與HSP90蛋白結(jié)合，不能開啟轉(zhuǎn)錄

加入RU486時，GALVP與其結(jié)合——脫離HSP90——二聚化——與插入到最小啟動子上游的GAL4響應(yīng)元件結(jié)合，開啟轉(zhuǎn)錄

例3：RU486誘導系統(tǒng)RU486：人孕酮拮抗物（替代孕酮誘導）例3：RU486誘49（2）化學誘導的二聚作用

——FK506調(diào)控系統(tǒng)FK506:一種天然免疫抑制劑FKBP12:FK506-bindingprotein，

FK1012:FK506的人工同源二聚體構(gòu)建兩種融合蛋白：1.GAL4DNA結(jié)合區(qū)域+FKBP12，稱為GF3；2.VP16轉(zhuǎn)錄激活區(qū)+FKBP12+SV40大T抗原的核酸定位序列，稱為NF3V1由于FK1012和FK506與FKBP12的結(jié)合存在竟爭關(guān)系，可以通過添加FK1012來激活轉(zhuǎn)錄，添加FK506來終止轉(zhuǎn)錄誘導響應(yīng)時間慢：約10h誘導物需人工合成誘導效率低：約10倍，有GF3-GF3和NFEV1-NFEV1的干擾。即一種親免素，可與免疫抑制劑結(jié)合的蛋白（2）化學誘導的二聚作用——FK506調(diào)控系統(tǒng)FK5050改進的FK506誘導系統(tǒng)構(gòu)建2種融合蛋白：GAL4DNA結(jié)合區(qū)域+FKBP12，稱為GF3（定位）；2.VP16轉(zhuǎn)錄激活區(qū)+親環(huán)素（激活轉(zhuǎn)錄）12添加FK506和環(huán)胞霉素A,的異源二聚體(起連接中介作用）改進的FK506誘導系統(tǒng)12添加FK506和環(huán)胞霉素A,51

噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達而表達，同時,外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術(shù)。

5.蛋白體外展示技術(shù)

5.1噬菌體展示技術(shù)5.2細菌展示技術(shù)5.3酵母展示技術(shù)5.1噬菌體展示技術(shù)噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到52被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，以利于靶分子的識別和結(jié)合。肽庫與固相上的靶蛋白分子經(jīng)過一定時間孵育后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體，然后以競爭受體或酸洗脫下與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細胞后經(jīng)繁殖擴增，進行下一輪洗脫，經(jīng)過3輪～5輪的“吸附-洗脫-擴增”后，與靶分子特異結(jié)合的噬菌體得到高度富集。到目前為止，已開發(fā)出了單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、λ噬菌體展示系統(tǒng)、T4噬菌體展示系統(tǒng)等數(shù)種噬菌體展示系統(tǒng)。（1）單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)

PIII展示系統(tǒng):PIII是病毒的次要外殼蛋白，位于病毒顆粒的尾端，是噬菌體感染大腸埃希菌所必須的。每個病毒顆粒都有3個～5個拷貝PⅢ蛋白，其在結(jié)構(gòu)上可分為N1、N2和CT3個功能區(qū)域.PⅢ有2個位點可供外源序列插入:

信號肽SgⅢ和N1之間，保留了完整的PⅢ蛋白，噬菌體仍有感染性；直接與PⅢ蛋白的CT結(jié)構(gòu)域相連，則噬菌體喪失感染性，這時重組噬菌體的感染性由輔助噬菌體表達的完整PⅢ蛋白來提供。★被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，以利53PⅧ及其他展示系統(tǒng)：PⅧ是絲狀噬菌體的主要外殼蛋白，位于噬菌體外側(cè)，C端與DNA結(jié)合，N端伸出噬菌體外，每個病毒顆粒有2700個左右PⅧ拷貝。PⅧ的N端附近可融合五肽，但不能融合更長的肽鏈，因為較大的多肽或蛋白會造成空間障礙，影響噬菌體裝配，使其失去感染力。有輔助噬菌體參與時，可提供野生型PⅧ蛋白，降低價數(shù)，此時可融合較大大多肽甚至抗體片段。（2)λ噬菌體展示系統(tǒng)

PV展示系統(tǒng):PV蛋白組裝成尾部管狀部分（32個盤狀結(jié)構(gòu)，每個盤由6個PV亞基組成）。PV的C端的折疊結(jié)構(gòu)域（非功能區(qū)）可供外源序列插入或替換。PV系統(tǒng)已成功展示了有活性的大分子蛋白β-半乳糖苷酶（465kD）和植物外源凝血素BPA（120kD）等。λ噬菌體在在胞內(nèi)裝配，故可以展示難以分泌的肽或蛋白質(zhì)。但該系統(tǒng)展示的數(shù)目為平均1個分子/噬菌體，這表明外源蛋白質(zhì)或多肽可能干擾了λ噬菌體的尾部裝配。

D蛋白展示系統(tǒng)：D蛋白封閉λ噬菌體頭部，可作為外源序列融合的載體，該系統(tǒng)優(yōu)點：D蛋白呈突出狀分布，利于融合蛋白和配體結(jié)合?？梢酝瑫r提供野生型D蛋白和融合D蛋白，通過控制兩者表達強度來調(diào)節(jié)比例，達到單價展示的效果。這對于展示那些可以對噬菌體裝配造成損害的蛋白質(zhì)時特別有用?！颬Ⅷ及其他展示系統(tǒng)：PⅧ是絲狀噬菌體的主要外殼蛋白，位于噬菌54（3）T4噬菌體展示系統(tǒng)

T4噬菌體展示系統(tǒng)是20世紀90年代中期建立起來的一種新的展示系統(tǒng)。它的顯著特點是能夠?qū)煞N性質(zhì)完全不同的外源多肽或蛋白質(zhì)，分別與T4衣殼表面上的外殼蛋白SOC（9kD）和HOC（40kD）融合而直接展示于T4噬菌體的表面。

T4噬菌體是在宿主細胞內(nèi)裝配，不需通過分泌途徑，因而可展示各種大小的多肽或蛋白質(zhì)，很少受到限制。

SOC與HOC蛋白的存在與否，并不影響T4的生存和繁殖。SOC和HOC在噬菌體組裝時可優(yōu)于DNA的包裝而裝配于衣殼的表面，事實上，在DNA包裝被抑制時，T4是雙鏈DNA噬菌體中唯一能夠在體內(nèi)產(chǎn)生空衣殼的噬菌體（SOC和HOC也同時組裝）。因此，在用重組T4做疫苗時，它能在空衣殼表面展示目的抗原，這種缺乏DNA的空衣殼疫苗，在生物安全性方面具有十分光明的前景。該系統(tǒng)和噬菌體系統(tǒng)均可以體外包裝實現(xiàn)展示，因此，可用于構(gòu)建人工多酶體系（比如一條途徑中的多個酶展示于同一個病毒表面），多功能疫苗（多種抗原決定簇展示于同一病毒表面），超級酶（一個病毒展示數(shù)百上千個酶分子）★（3）T4噬菌體展示系統(tǒng)該系統(tǒng)和噬菌體系統(tǒng)均可以體外包55噬菌體展示技術(shù)的局限性

在噬菌體展示過程中必須經(jīng)過細菌轉(zhuǎn)化、噬菌體包裝，有的展示系統(tǒng)還要經(jīng)過跨膜分泌過程，這就大大限制了所建庫的容量和分子多樣性。目前，常用的噬菌體展示文庫中含有不同序列分子的數(shù)量一般限制在109。不是所有的序列都能在噬菌體中獲得很好的表達，因為有些蛋白質(zhì)功能的實現(xiàn)需要折疊、轉(zhuǎn)運、膜插入和絡(luò)合。由于噬菌體展示系統(tǒng)依賴于細胞內(nèi)基因的表達，所以，一些對細胞有毒性的分子如生物毒素分子，很難得到有效表達和展示。噬菌體展示技術(shù)的局限性565.2細菌展示技術(shù)細菌表面展示技術(shù)是利用基因工程手段將某一蛋白質(zhì)或短肽段(靶蛋白)與原核微生物外膜蛋白、脂蛋白、表面附屬結(jié)構(gòu)亞單位如鞭毛、菌毛以融合蛋白的形式呈現(xiàn)在細胞表面。外源蛋白與載體蛋白序列融合方式有C端融合、N端融合和夾心融合。C端融合：如脂蛋白一外膜蛋白A(Lpp-OmpA嵌合體)系統(tǒng)其OmpA的N端錨定在外膜；N端融合：如免疫球蛋白A蛋白酶家族中的一些成員含有自動轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)，其C端錨定在細胞外膜，適于N端融合；夾心融合：如麥芽糖孔蛋白(Lamb)本身具有信號肽序列及錨定于外膜的序列，在其內(nèi)部合適位點插入外源蛋白，可實現(xiàn)細胞表面展示。5.2細菌展示技術(shù)細菌表面展示技術(shù)是利用基因工程手段將某一571.原核生物基因的表達調(diào)控（1）染色體DNA特點基因結(jié)構(gòu)簡潔有效，無多余序列，必須利用少量的DNA序列充分存儲必要的遺傳信息（操縱子、重疊基因）一個復制起點（ori），一個復制終點（ter）（2）基因表達特點1種RNA聚合酶，多種σ因子，通過調(diào)控σ因子的表達來調(diào)控不同種類基因表達

E.coli有7種σ70(housekeeping),σH,σE,σS,σN,σF,σFecI轉(zhuǎn)錄與翻譯同時進行，無轉(zhuǎn)錄后加工，翻譯后加工方式簡單（酶原）啟動子的重要保守區(qū)-35、-16、-10區(qū)等，RBS序列（SD序列與起始密碼子間隔3·9個堿基）

（3）基因表達調(diào)節(jié)特點

調(diào)控層次少：酶活調(diào)節(jié)-轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)-總體調(diào)控以轉(zhuǎn)錄調(diào)控為主，簡單而快速（mRNA半衰期比蛋白質(zhì)短，重新合成RNA在能耗上也比重新合成蛋白質(zhì)少）☆☆☆1.原核生物基因的表達調(diào)控（1）染色體DNA特點☆☆☆58（2）阻遏:Trp操縱子阻遏當Trp很少時，由trpR編碼的阻遏蛋白沒有活性，不能和操縱基因結(jié)合，轉(zhuǎn)錄可以起始。當Trp大量存在時，阻遏物可以和作為輔阻遏物Trp結(jié)合而被激活，然后和操縱基因結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄不能起始。Trp反饋阻遏的解除使轉(zhuǎn)錄強度提高70倍★（2）阻遏:Trp操縱子阻遏當Trp很少時，由trpR編碼59

在大腸桿菌色氨酸操縱子中在存在一種轉(zhuǎn)錄的弱化調(diào)節(jié)，弱化作用的解除可使轉(zhuǎn)錄強度升高8-10倍。轉(zhuǎn)錄的mRNA的5‘端存在一段前導鏈，通過前導鏈二級結(jié)構(gòu)的變化、色氨酰-tRNA（色氨酸）以及核糖體的翻譯來控制轉(zhuǎn)錄是否繼續(xù)進行大腸桿菌色氨酸操縱子前導鏈RNA二級結(jié)構(gòu)受到氨基酰-tRNA分子的調(diào)節(jié)：

His、Trp、Phe等氨基酸操縱子（3）弱化:Trp操縱子轉(zhuǎn)錄弱化前導鏈的特點：含有一個起始密碼子和一個終止密碼子含有兩個連續(xù)的Trp密碼子四段能形成不同二級結(jié)構(gòu)的序列，可以形成終止子結(jié)構(gòu)或抗終止子結(jié)構(gòu)(莖環(huán)）★在大腸桿菌色氨酸操縱子中在存在一種轉(zhuǎn)錄的弱化調(diào)節(jié)，弱60Trp充足時，大多數(shù)色氨酰-tRNA載有Trp，核糖體快速通過兩個連續(xù)的Trp密碼子并占據(jù)前導鏈2區(qū)的一部分，使2、3區(qū)不能配對形成抗終止子，而是3、4區(qū)配對，剛好形成終止子結(jié)構(gòu)，mRNA鏈從RNA聚合酶上脫落下來，轉(zhuǎn)錄提前終止。目的基因表達課件61前導鏈RNA直接感應(yīng)終端產(chǎn)物的濃度而改變二級結(jié)構(gòu)：

THI（B1）-box、RFN（B2）-box和B12-box維生素操縱子、嘌呤操縱子等或與其代謝相關(guān)的基因，這種調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)也稱為“Riboswitch”(ribonucleotideswitch)

（4）Riboswitch★前導鏈RNA直接感應(yīng)終端產(chǎn)物的濃度而改變二級結(jié)構(gòu)：（4）Ri62目的基因表達課件63誘導機理的普遍性

在真核細胞中普遍存在熱激系統(tǒng)，HSF保守性高，不必額外表達轉(zhuǎn)錄因子基因表達快速高效

hsp70Bpromoter:inductionratiosupto800-foldhumanhsp70B’promoter：inductionratiosupto8000-fold.

響應(yīng)時間：數(shù)十秒～數(shù)十分鐘基因表達控制方便，對宿主細胞無傷害通過控制溫度高低可實現(xiàn)基因表達水平的精細調(diào)節(jié)對基因表達的時間控制和空間控制

非常適合基因療法：腺病毒作為載體攜帶熱激啟動子控制的治療基因感染正常細胞和癌細胞電磁輻射或聚焦超聲波技術(shù)局部加熱癌組織(3)熱激啟動子的特點★誘導機理的普遍性(3)熱激啟動子的特點★64humanhsp70B’promoter：inductionratiosupto8000-fold.它結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子是GCN4和GAL4，識別位點為ATGACTCAT。原核生物基因的表達調(diào)控含有兩個連續(xù)的Trp密碼子pUCplasmid：數(shù)百拷貝根據(jù)受體菌的密碼子偏愛性進行序列優(yōu)化后重新合成外源基因Cu-ACE1結(jié)合到金屬硫蛋白啟動子上啟動轉(zhuǎn)錄。響應(yīng)時間：數(shù)十秒～數(shù)十分鐘THI（B1）-box、RFN（B2）-box和B12-box維生素操縱子、嘌呤操縱子等或與其代謝相關(guān)的基因，這種調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)也稱為“Riboswitch”(ribonucleotideswitch)(1)熱激（誘導）啟動子的機理GAL4DNA結(jié)合區(qū)域+FKBP12，稱為GF3；（2)λ噬菌體展示系統(tǒng)在枯草芽孢桿菌中，多數(shù)基因的起始密碼子為AUG，為起始密碼子的最優(yōu)選擇。與能與親和層析柱上配基特異結(jié)合的“親和手柄”相融合，利于產(chǎn)物純化GAL4DNA結(jié)合區(qū)域+FKBP12，稱為GF3；分子伴侶是指細胞內(nèi)一類能介導其他蛋白正確裝配,其自身卻不是具有功能的最終裝配產(chǎn)物組成成分的物質(zhì)表達的基因末端的終止子非常重要，可以避免RNA聚合酶的通讀而合成不必要的RNA序列。從AUG開始的前幾個密碼子堿基序列也至關(guān)重要，這一序列不能與mRNA的5’端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則會嚴重干擾mRNA在核糖體上的準確定位PⅧ的N端附近可融合五肽，但不能融合更長的肽鏈，因為較大的多肽或蛋白會造成空間障礙，影響噬菌體裝配，使其失去感染力。殘留于細胞中的四環(huán)素難于清除、細胞吸收不平衡當Trp大量存在時，阻遏物可以和作為輔阻遏物Trp結(jié)合而被激活，然后和操縱基因結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄不能起始。lacI基因表達的改造：可持續(xù)大量在宿主中表達，終止高拷貝的啟動子的轉(zhuǎn)錄，減少本底表達啟動子的改造：即被宿主識別又具有阻遏蛋白結(jié)合位點（序列）（1）真核宿主中的lac、tet阻遏蛋白系統(tǒng)(on)阻遏蛋白的毒性誘導物的毒性lac:50-foldtet:500-fold重組誘導系統(tǒng)

——lac、tet阻遏蛋白系統(tǒng)★humanhsp70B’promoter：induct651.原核生物基因的表達調(diào)控（1）染色體DNA特點基因結(jié)構(gòu)簡潔有效，無多余序列，必須利用少量的DNA序列充分存儲必要的遺傳信息（操縱子、重疊基因）一個復制起點（ori），一個復制終點（ter）（2）基因表達特點1種RNA聚合酶，多種σ因子，通過調(diào)控σ因子的表達來調(diào)控不同種類基因表達

E.coli有7種σ70(housekeeping),σH,σE,σS,σN,σF,σFecI轉(zhuǎn)錄與翻譯同時進行，無轉(zhuǎn)錄后加工，翻譯后加工方式簡單（酶原）啟動子的重要保守區(qū)-35、-16、-10區(qū)等，RBS序列（SD序列與起始密碼子間隔3·9個堿基）

（3）基因表達調(diào)節(jié)特點

調(diào)控層次少：酶活調(diào)節(jié)-轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)-總體調(diào)控以轉(zhuǎn)錄調(diào)控為主，簡單而快速（mRNA半衰期比蛋白質(zhì)短，重新合成RNA在能耗上也比重新合成蛋白質(zhì)少）☆☆☆1.原核生物基因的表達調(diào)控（1）染色體DNA特點☆☆☆66目的基因表達課件672.原核生物的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式主要方式有：誘導、激活、阻遏、弱化、Riboswitch調(diào)控（核糖核酸開關(guān)）（1）誘導+激活：lac操縱子的表達調(diào)控CellnumbersGlucoseLactose葡萄糖>乳糖二次生長現(xiàn)象:葡萄糖被優(yōu)先利用，被基本耗盡時，細胞開始合成有關(guān)利用乳糖的酶（生長停滯期），將乳糖運入胞內(nèi)后繼續(xù)生長。GlucoseLactoseCellnumberssugarconcentrationCataboliteRepression(alsocalledglucoserepression)★2.原核生物的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式主要方式有：誘導、激活、阻遏68底物誘導誘導物乳糖（或異乳糖）缺乏時，lacI編碼的阻遏物具有活性，和操縱基因lacO結(jié)合后關(guān)閉轉(zhuǎn)錄，起負調(diào)控作用存在誘導物乳糖（或異乳糖）時，誘導物充當輔阻遏物，和阻遏蛋白結(jié)合使其失活，轉(zhuǎn)錄起始(效率低）,在cAMP-CRP結(jié)合在DNA的前提下，高效轉(zhuǎn)錄CRP：cyclicAMPReceptorProtein是乳糖操縱子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)物（或者CAP)★底物誘導誘導物乳糖（或異乳糖）缺乏時，lacI編碼的阻遏物具69

激活葡萄糖濃度高時，細胞內(nèi)cAMP濃度很低，CRP無法被激活，即使阻遏蛋白LacI失活，操縱子也不能高表達葡萄糖濃度低造成cAMP的大量生成，從而激活CRP啟動轉(zhuǎn)錄，起正調(diào)控作用★激活葡萄糖濃度高時，細胞內(nèi)cAMP濃度很低，CRP無法被70（2）阻遏:Trp操縱子阻遏當Trp很少時，由trpR編碼的阻遏蛋白沒有活性，不能和操縱基因結(jié)合，轉(zhuǎn)錄可以起始。當Trp大量存在時，阻遏物可以和作為輔阻遏物Trp結(jié)合而被激活，然后和操縱基因結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄不能起始。Trp反饋阻遏的解除使轉(zhuǎn)錄強度提高70倍★（2）阻遏:Trp操縱子阻遏當Trp很少時，由trpR編碼71

在大腸桿菌色氨酸操縱子中在存在一種轉(zhuǎn)錄的弱化調(diào)節(jié)，弱化作用的解除可使轉(zhuǎn)錄強度升高8-10倍。轉(zhuǎn)錄的mRNA的5‘端存在一段前導鏈，通過前導鏈二級結(jié)構(gòu)的變化、色氨酰-tRNA（色氨酸）以及核糖體的翻譯來控制轉(zhuǎn)錄是否繼續(xù)進行大腸桿菌色氨酸操縱子前導鏈RNA二級結(jié)構(gòu)受到氨基酰-tRNA分子的調(diào)節(jié)：

His、Trp、Phe等氨基酸操縱子（3）弱化:Trp操縱子轉(zhuǎn)錄弱化前導鏈的特點：含有一個起始密碼子和一個終止密碼子含有兩個連續(xù)的Trp密碼子四段能形成不同二級結(jié)構(gòu)的序列，可以形成終止子結(jié)構(gòu)或抗終止子結(jié)構(gòu)(莖環(huán)）★在大腸桿菌色氨酸操縱子中在存在一種轉(zhuǎn)錄的弱化調(diào)節(jié)，弱72無四環(huán)素存在時．tTA可特異的與TetO序列結(jié)合，目的基因得以表達；T7RNA聚合酶的效率比大腸桿菌RNA聚合酶高5倍左右，它能使質(zhì)粒沿模板連續(xù)轉(zhuǎn)錄幾周，許多外源終止子都不能有效地終止它的序列，因此它可轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶有效轉(zhuǎn)錄的序列。存在誘導物乳糖（或異乳糖）時，誘導物充當輔阻遏物，和阻遏蛋白結(jié)合使其失活，轉(zhuǎn)錄起始(效率低）,在cAMP-CRP結(jié)合在