幾種常用細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)一、腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞(tumorcell)在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，首先癌細(xì)胞是比較容易培養(yǎng)的細(xì)胞。當(dāng)前建立的細(xì)胞系中癌細(xì)胞系是最多的。另外腫瘤對人類是威脅最大的疾病。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是研究癌變機(jī)理、抗癌藥檢測、癌分子生物學(xué)極其重要的手段。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)對闡明和解決癌癥將起著不可估量的作用。1．取材：

人腫瘤細(xì)胞來自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū)，取材時盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。取材后宜盡快進(jìn)行培養(yǎng)，如因故不能立即培養(yǎng)，可貯存于4℃中，但不宜超過24小時實(shí)體瘤手術(shù)標(biāo)本：材料越新鮮，培養(yǎng)機(jī)會越多。體腔液：離心收集癌細(xì)胞血液：2．培養(yǎng)基：腫瘤細(xì)胞對培養(yǎng)基的要求不如正常細(xì)胞嚴(yán)格，一般常用的RPMIl640、DMEM等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)。腫瘤細(xì)胞對血清的需求比正常細(xì)胞低，正常細(xì)胞培養(yǎng)不加血清不能生長，腫瘤細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長。腫瘤細(xì)胞對培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性較大，是因腫瘤細(xì)胞有自分泌（Autocrine）性產(chǎn)生促生長物質(zhì)之故。但這并不說明腫瘤細(xì)胞完全不需要這些成分。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中仍需要生長因子。3.生物學(xué)鑒定最主要的為：異體動物（以用裸鼠為上）接種成瘤、軟瓊脂培養(yǎng)、核型分析、細(xì)胞骨架和電鏡觀察生物學(xué)檢查項(xiàng)目：組織起源：形態(tài)學(xué)觀察：細(xì)胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核漿比例、染色質(zhì)和核仁大小、多少等以及細(xì)胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等細(xì)胞生長特征：檢測細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞分裂指數(shù)、倍增時間、細(xì)胞周期時間。

軟瓊脂培養(yǎng)：檢測集落形成能力。細(xì)胞核型分析：檢測核型特點(diǎn)，染色體數(shù)量、標(biāo)記染色體的有無、帶型等。動物致瘤實(shí)驗(yàn)：向異體動物體內(nèi)（皮下）接種細(xì)胞懸液，觀察成瘤能力.組織化學(xué)檢查：1.細(xì)胞種類：人肝癌細(xì)胞株

2.培養(yǎng)天數(shù)：傳代后第1天；

3.放大倍數(shù)：倒置顯微鏡

X40；

4.培養(yǎng)基種類：1640+10%胎牛血清

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述：細(xì)胞貼壁生長

1.食管癌細(xì)胞株表達(dá)MMP－2

2.培養(yǎng)的天數(shù)：2d;細(xì)胞倍增時間--24h左右；

3.放大倍速：倒置熒光顯微鏡，100倍；

4.培養(yǎng)基種類：1640+10%胎牛血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述:細(xì)胞貼壁生長；

6.目的：鑒定食管癌細(xì)胞表達(dá)MMP-2，胞漿中綠色熒光為MMP-2，細(xì)胞核紅色熒光為PI復(fù)染。1.細(xì)胞種類：人胃腫瘤細(xì)胞SGC7901細(xì)胞

2.培養(yǎng)的天數(shù)：2天；

3.放大倍速：倒置顯微鏡

X10；

4.培養(yǎng)基種類：DMEM+10%小牛血清（杭州四季青）；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述:細(xì)胞呈梭型貼壁生長

1.人成骨肉瘤細(xì)胞Saos-2細(xì)胞

2.細(xì)胞來源：美國ATCC

3.培養(yǎng)天數(shù)：傳代后24h

4.放大倍數(shù)：熒光顯微鏡40*

5.培養(yǎng)基：85%McCoy's5A+15%FBS

6.染色方法：AO

7.描述：細(xì)胞多角形，貼壁良好，鋪展面積大

1.細(xì)胞種類：B－NHL(非何杰金淋巴瘤細(xì)胞株):Daudi細(xì)胞；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：2d；

3.放大倍數(shù)：熒光顯微鏡顯微鏡

X40；Hoechst33258染色

4.培養(yǎng)基種類：1640+10%胎牛血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述:細(xì)胞呈圓形，成團(tuán)生長。

1.細(xì)胞種類：小鼠骨髓瘤細(xì)胞;sp2/0

2.培養(yǎng)的天數(shù)：復(fù)蘇后12小時；

3.放大倍速：倒置顯微鏡

X20；

4.培養(yǎng)基種類：DMEM+6%FBS；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述:細(xì)胞呈圓型或橢圓形，貼壁生長。

1.細(xì)胞種類：人纖維肉瘤細(xì)胞

2.培養(yǎng)的天數(shù)：5天；

3.放大倍速：倒置顯微鏡

X10；

4.培養(yǎng)基種類：1640+10%小牛血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述:細(xì)胞貼壁生長。

1.細(xì)胞種類：人口腔皮樣癌KB細(xì)胞株；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：3d

3.放大倍數(shù)：倒置顯微鏡高倍鏡

放大40倍；

4.培養(yǎng)基種類：1640+10%小牛血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述:貼壁生長細(xì)胞，呈不規(guī)則形狀；

BGC823：人胃腺癌細(xì)胞

培養(yǎng)條件：DMEM高糖＋10％FBS＋2mML-Glu

1.K562：人白血病細(xì)胞

2.形態(tài)：懸浮細(xì)胞、規(guī)則、圓形

3.培養(yǎng)條件：IMDM＋10％FBS＋4mML-Glu

4.每2到3天換一次液，

5.大約1x105cells/ml上皮樣細(xì)胞型成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞二、正常組織細(xì)胞的培養(yǎng)1.內(nèi)皮標(biāo)本來源：牛主動脈，牛腎上腺皮質(zhì)毛細(xì)血管，人臍靜脈等方法：血管注入膠原酶使內(nèi)皮細(xì)胞分離，然后培養(yǎng)在鋪有明膠基質(zhì)的培養(yǎng)器皿內(nèi)。如果標(biāo)本來源是毛細(xì)血管，培養(yǎng)液中需加有絲分裂劑；如果來源是大血管則不需要。1.細(xì)胞種類：ECV-304(臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株)；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：3d；

3.放大倍速：倒置顯微鏡

X100；

4.培養(yǎng)基種類：1640+10%胎牛血清；

5.狀態(tài)與特征:細(xì)胞呈梭形，貼壁生長

1.內(nèi)皮祖細(xì)胞

2.培養(yǎng)的天數(shù)：6天

3.放大倍速：倒置顯微鏡

X100；

4.培養(yǎng)基種類：EGM－2；

5.

狀態(tài)與特征:細(xì)胞呈梭形貼壁生長，排列成直線

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞：

1.細(xì)胞種類：原代內(nèi)皮細(xì)胞；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：2d;細(xì)胞倍增時間--24h左右；2－3代

3.放大倍速：倒置顯微鏡，20倍；

4.培養(yǎng)基種類：M200；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述:細(xì)胞貼壁生長；

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染GFP的熒光圖

1.細(xì)胞種類：內(nèi)皮細(xì)胞

2.培養(yǎng)的天數(shù)：培養(yǎng)4天，轉(zhuǎn)染后8小時

3.放大倍速：倒置顯微鏡

×200

4.培養(yǎng)基種類：DMEM+10％FBS培養(yǎng)；DMEM+5％FBS轉(zhuǎn)染

5.狀態(tài)與特征:貼壁生長

，細(xì)胞呈梭型，生長較快4-5天一代。

1.人微血管內(nèi)皮細(xì)胞株（HMEC-1）

2.培養(yǎng)的天數(shù)：2天

3.放大倍數(shù)：

10×光鏡

4.培養(yǎng)基種類：10％小牛血清＋DMEM培養(yǎng)基

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征：多角型或梭型，邊界清晰，大小均勻，胞核圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央，匯合后呈典型的鋪路石樣排列

1.細(xì)胞種類：貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：2W

3.放大倍速：倒置顯微鏡

200×；

4.培養(yǎng)基種類：1640+10%小牛血清（四季青）；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述:細(xì)胞高密度時呈3－6邊形鋪路石樣生長

2.成纖維細(xì)胞

結(jié)締組織細(xì)胞最容易生長，不需特殊條件，常規(guī)培養(yǎng)即可，往往統(tǒng)稱成纖維細(xì)胞，無確切分類。人，倉鼠，雞的成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)皿中長滿時呈梭形，小鼠則是條紋狀（pavement－like）。3.血細(xì)胞脫頸法處死小鼠75％酒精浸泡消毒切取股骨移入含培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中切除骨周圍肌組織固定股骨切除脛骨端21號針頭插入切除另一端將斷端置入100ml培養(yǎng)液的瓶中注射器反復(fù)吹打使骨髓全部進(jìn)入培養(yǎng)液中10ml移液器反復(fù)吹打使骨髓混入培養(yǎng)液中移入培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)箱培養(yǎng)每周更換培養(yǎng)液一次干細(xì)胞及培養(yǎng)1.干細(xì)胞(stemcell)

干細(xì)胞（Stemcell）即起源細(xì)胞。在細(xì)胞的分化過程中，細(xì)胞往往由于高度分化而完全失去了再分裂的能力，最終衰老死亡。機(jī)體在發(fā)展適應(yīng)過程中為了彌補(bǔ)這一不足，保留了一部分未分化的原始細(xì)胞。因此，干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。能自我更新和分化具自我復(fù)制的能力能在一定條件下分化成具有特定形態(tài)和功能的成熟細(xì)胞2.胚胎干細(xì)胞從囊胚期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)獲得胚胎生殖細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞都可自發(fā)分化形成三胚層的全部細(xì)胞3.成體干細(xì)胞特定的組織中能自我更新并分化成相應(yīng)組織內(nèi)具有特定功能的成熟細(xì)胞可塑性

一、干細(xì)胞的特征圓形和橢圓形，體積較小，核質(zhì)相對較大體外，扁平或圓形多細(xì)胞簇可分化特異性的表面抗原標(biāo)記造血干細(xì)胞CD34+間質(zhì)干細(xì)胞CD34+

Scal+Lin-胚胎干細(xì)胞堿性磷酸酶活性端粒酶活性較高，具分裂增殖能力

Stemcell二、干細(xì)胞的自我更新1.干細(xì)胞的增殖自我更新是干細(xì)胞最重要的生物學(xué)特征胚胎干細(xì)胞能自我更新不分化各類因子的平衡決定增殖或分化2.干細(xì)胞增殖的模式增殖分裂三種方式，即：增殖分裂、分化分裂和更新分裂。三.干細(xì)胞分化的特征1.多能性2.分化的主要形式增殖分化：更新分化：使干細(xì)胞數(shù)目相對恒定。可塑性轉(zhuǎn)分化，transdifferentiation脫分化，dedifferentiation3.復(fù)雜精細(xì)的調(diào)控環(huán)境因素細(xì)胞與細(xì)胞間的作用細(xì)胞內(nèi)部的因子轉(zhuǎn)分化脫分化早期胚胎中，具自我更新和分化潛力的細(xì)胞體內(nèi),胎兒或機(jī)體組織的細(xì)胞體外，可無限擴(kuò)增，可誘導(dǎo)分化為多種細(xì)胞來源于正常人囊胚期胚胎的內(nèi)細(xì)胞群1.特性多能性：分化形成各種胚層細(xì)胞定向誘導(dǎo)可在體外多次傳代，保持正常核型，具高水平的端粒酶活性Embryonicstemcell2.潛在醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值細(xì)胞移植治療：利用人胚胎干細(xì)胞替代病損組織藥理實(shí)驗(yàn)用人胚胎干細(xì)胞分化形成的特定細(xì)胞或細(xì)胞群，模擬體內(nèi)反應(yīng)，為提供藥物篩選模型毒素篩選細(xì)胞的基因改造工程同源重組技術(shù)改造或替換基因，誘導(dǎo)分化成所需的成熟細(xì)胞e.g治療性克隆

綿羊B乳腺細(xì)胞核易核卵融合卵綿羊C子宮多莉植入植入生產(chǎn)克隆多莉羊示意圖取出未受精卵去核電激體外胚胎發(fā)育綿羊A多莉克隆猴在哺乳動物的總生育周期內(nèi)，精子的前體細(xì)胞高度專一、不間斷地產(chǎn)生高度分化的精子1.精原干細(xì)胞的特點(diǎn)數(shù)目少，處于相對靜止?fàn)顟B(tài)包圍在支持細(xì)胞中對輻射和化學(xué)物質(zhì)的損傷有最強(qiáng)的抵抗能力可被移植并在受體內(nèi)維持精原干細(xì)胞群，分化產(chǎn)生全部與精子相關(guān)的細(xì)胞Spermatagoniastemcell2.基本特征能在長時間內(nèi)準(zhǔn)確復(fù)制，即自我更新能力能分化成成熟細(xì)胞3.分化特征不對稱分裂，即分裂為干細(xì)胞和功能細(xì)胞分化方向確定，只能分化為相應(yīng)組織的細(xì)胞可塑性如中胚層的血液干細(xì)胞能產(chǎn)生中胚層的骨骼肌，也能生成外胚層的神經(jīng)元4.主要功能維持組織細(xì)胞數(shù)量的動態(tài)平衡替代由于損傷或疾病死亡的細(xì)胞

1.造血干細(xì)胞（hematopoieticstem/progenitorcells，HSC/HPC）造血組織中的原始多能干細(xì)胞分化各種血細(xì)胞可塑性：可轉(zhuǎn)分化成神經(jīng)元、少突細(xì)胞、星形細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞Adultstemcell2)來源骨髓移植外周血細(xì)胞篩選出CD34+白細(xì)胞，含5-20%的造血干細(xì)胞臍帶血3）.主要特征未分化造血干細(xì)胞的表面標(biāo)記可被有熒光標(biāo)記的單抗識別自我更新有關(guān)因子：端粒、端粒酶活性、干細(xì)胞因子和信號分子gp130等分化有關(guān)因子凋亡維持骨髓和血液中血細(xì)胞數(shù)目Bcl-2和Steel因子可以維持干細(xì)胞生命以避免凋亡臨床應(yīng)用白血病其他血液病（如再生障礙性貧血）Adultstemcell2、間充質(zhì)干細(xì)胞能在體外增殖，也可分化為多種間充組織形成于發(fā)育中的骨髓腔，出生后附于骨髓竇內(nèi)腔面，包埋于竇狀網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞中間充質(zhì)干細(xì)胞的分離獲取骨髓抽提物分離純化的細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定純度AdultstemcellSH2、CD29，和不表達(dá)的CD45、CD34轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基培養(yǎng)密度梯度離心流式細(xì)胞儀分析表面抗原2）特性特異性表面抗原SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120A和CD124等造血干細(xì)胞表達(dá)，不在間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)的表面抗原：CD45、CD34、CD41、和CD143）臨床應(yīng)用能被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞→治療骨損傷及先天骨組織畸形病損的心臟3.神經(jīng)干細(xì)胞成體腦組織分化神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成血細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞1)來源和特征哺乳動物中側(cè)腦室的室管膜下區(qū)可在表面生長因子的作用下在體外增殖特征標(biāo)記：中間絲狀蛋白巢素蛋白分裂：不對稱分裂和對稱分裂2)臨床應(yīng)用神經(jīng)細(xì)胞移植用生長激素或營養(yǎng)因子激活體內(nèi)干細(xì)胞或是修復(fù)機(jī)制如：由神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)