第六章基因工程的基本技術第六章基因工程的基本技術1優(yōu)選第六章基因工程的基本技術優(yōu)選第六章基因工程的基本技術核酸提取技術凝膠電泳技術PCR技術核酸雜交技術DNA測序技術主要內容核酸提取技術主要內容第一節(jié)、第二節(jié)前章節(jié)已介紹第一節(jié)、第二節(jié)第三節(jié)PCR技術第三節(jié)PCR技術第三節(jié)PCR技術PCR基本原理基本過程與反應體系PCR引物設計的原則PCR產物質量的影響因素PCR的種類第三節(jié)PCR技術PCR基本原理中文名稱：聚合酶鏈式反應1、PCR原理：

變性溫度下，DNA雙鏈變性雙螺旋解開成單鏈DNA，在退火溫度中人工合成的特異引物根據堿基互補配對原則與單鏈DNA特異結合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸溫度下不同的脫氧核苷酸按照堿基互補配對原則在引物的引導下合成與模板DNA互補的新鏈，實現DNA的擴增。技術3：PCR技術(polymerasechainreaction)中文名稱：聚合酶鏈式反應1、PCR原理：變性PCR操作流程94℃50℃72℃PCR操作流程94℃50℃72℃2、

PCR反應過程：變性：DNA雙鏈變?yōu)閱捂?；退火：引物與模板結合；延伸：合成互補鏈；上述過程通過PCR儀的程序設計及自動運作完成。2、PCR反應過程：變性：DNA雙鏈變?yōu)閱捂?；上述過程RealTimeSequencingbySynthesis以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。(6)PCR反應程序設定1979年，等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉移到硝酸纖維素濾膜或其他化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法。Roche/454硫酸二甲酯（DMS）足跡RunningPAGE(7Murea)6%~20%一次測序反應一般可讀出600～800bp，若待測序的DNA片斷較大，則需從多處不同的位置引導測序反應。5ˊ32PGTCATGTGCT根據毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉移并結合在適當的濾膜上，然后通過同標記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA印跡雜交技術。3、PCR反應體系：5小時的運行當中可獲得40多萬個讀長(200bp)，讀取超過1億個堿基信息(100MB)。PCR產物質量的影響因素1980NobelPrizeChemical(polymerasechainreaction)FSangerWGilbert利用Southern印跡法可進行克隆基因的酶切、圖譜分析、基因組中某一基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性片斷長度多態(tài)性分析（RFLP）等。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。5ˊ32PGTCATGTG5AAATCGTCGTCATCTAAAATACGAATACGTTGAAAGTGGGTAAG3這種同一泳道的分離避免了泳道間差異對測序的影響。DNaseⅠ足跡實驗是一類用于檢測與特定蛋白質結合的DNA序列的部位及特性的專門的實驗技術。引物的3’端嚴防錯配。同探針同源雜交的基因DNA片段2007年推出了通量更大，讀長更長，準確性更高的第二代基因組測序系統(tǒng)——GenomeSequencerFLXSystem(GSFLX)Primersannealing退火：引物與模板結合；利用Southern印跡法可進行克隆基因的酶切、圖譜分析、基因組中某一基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性片斷長度多態(tài)性分析（RFLP）等。酶降解,反應體系得以再生Roche/454(6)PCR反應程序設定3、斑點印跡雜交（dotblotting）特定化學試劑可對堿基進行特異性修飾5ˊ32PG原理：通過實時檢測PCR每一個循環(huán)擴增產物相對應的熒光信號，來實現對起始模板進行定量及定性的分析。Keytechnique(3)模板：主要考慮純度及使用量廣義概念的定量PCR技術是指以外參或內參為標準，通過對PCR終產物的分析或PCR過程的監(jiān)測，進行PCR起始模板量的定量。3、PCR反應體系：體系成分：模板DNA、引物、Taq酶(熱穩(wěn)定性)、dNTP、反應緩沖液（Mg2+ 、BSA、Tween20、DTT、Tris.cl）

。RealTimeSequencingbySynthe1）、引物（寡聚核苷酸）一般成對出現，長度為15-30個核苷酸；

使用濃度：0.1-0.5uM，高達1uM；引物設計原則：G+C含量45-55%；Tm值高于55；引物特異性；引物擴增跨度；是否形成引物二聚體引物的3’端嚴防錯配。1）、引物（寡聚核苷酸）一般成對出現，長度為15-30個核2）、模板DNA：

基因組DNA、質粒DNA、其它DNA片段；

質量要求：不高3）、Taq酶(熱穩(wěn)定性)：常規(guī)酶高保真酶：ExTaqLaTaq酶4）、反應緩沖液成分：

BSA、Tween20、DTT、明膠保護酶作用

Tris.cl提供緩沖作用2）、模板DNA：以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。沒有聚合的dNTP、反應過剩的dNTP應用甲基化保護作用進行的體內足跡實驗退火：引物與模板結合；2005年底，羅氏診斷公司和454公司推出了——GenomeSequencer20System(GS20)此方法有很高的敏感性和特異性，可進一步從分子水平來探討細胞的功能表達及其調節(jié)機制。5ˊ32PGTCAT可以間接的闡明體內發(fā)生DNA與蛋白質之間的相互作用。⑤進行聚合反應，DNA新生鏈延長，當摻入ddNTP時，聚合反應終止。根據已知序列擴增兩側序列的方法。影響：酶的活性、引物-模板退火、特異性。用途：分析基因組中某個基因的拷貝數或分析基因的轉錄表達豐度。3’AGCTCGTAGCATGCATCGATGCATGCTAGCAT5’upto400,000reads/run利用Southern印跡法可進行克隆基因的酶切、圖譜分析、基因組中某一基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性片斷長度多態(tài)性分析（RFLP）等。6l(2U/50l)G+C含量45-55%；(3)模板：主要考慮純度及使用量已成為當今細胞生物學、分子生物學研究的重要手段。（b）加入的超量競爭DNA與探針DNA競爭結合同一種蛋白質，阻滯條帶消失；原理：DNA與蛋白的結合導致了電泳時遷移率的降低。又叫DNA遷移率變動實驗（DNAmobilityshiftassay），是在80年代初期出現的用于在體外研究DNA與蛋白質相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術。Endingreaction

4、影響PCR產量、質量的因素：(1)

Taq酶：常用1-2.5U/反應（25uL）

濃度低，擴增產物不夠；

濃度高，非特異性擴增增加；酶的活性；(2)

dNTP的濃度：常用100-200μmol/L，不能低于20μmol/L，特異性、保真性；以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，(3)模板：主要考慮純度及使用量對純度要求不高，但含有酚、氯仿等雜質則難以成功。使用量從幾個ng到100ng；(4)引物濃度：

0.1-0.5μmol/L之間，過多則非特異擴增增加，形成引物二聚體；(5)

Mg2+濃度：常用0.5-2.5mmol/L；影響：酶的活性、引物-模板退火、特異性。(3)模板：主要考慮純度及使用量(6)

PCR反應程序設定1）變性溫度和時間：要求變性徹底，但要考慮酶的半衰期：92.5℃（2小時）95℃（40min）97℃（5min）94℃變性比較徹底，酶的半衰期也不短。2）引物退火溫度Tm與時間；

Tm值由引物ATGC數決定每A、T計為2℃，G、C計為4℃，時間一般為40秒到60秒3）引物延伸溫度與時間：

72℃最佳，30-100nt/s，也有用68℃如LaTaq4）循環(huán)數：25-35cycles之間，過多則非特異擴增增加；平臺效應。(6)PCR反應程序設定1）變性溫度和時間：以普通PCR50lreactionsolution為例)10PCRbuffer25mMMgCl2dNTPMixture(10mMeach)primer1（10M)primer2(10M)Taqpolymerase(5U/l)DNAtemplate(0.1g/l)ddH2Ototal5l(1)4l(2mM)1l(0.1mM)1l(0.2M)1l(0.2M)0.6l(2U/50l)1l36.5l50l5、PCR例子（Exampleofreactionsolution）反應體系配置：以普通PCR50lreactionsolution

PCRthermalprogram94C94CTm72C72C4C1min30sec30sec1min5Cendless30cycles循環(huán)數HeatdenaturationHeatdenaturePrimersannealingExtensionLastextensionEndingreactionTa:annealingtemperature設計的反應程序相應作用PCRthermalprogram94C1min306、PCR的種類RT-PCR特異PCR錨定PCR反向PCR套式PCR不對稱PCR長程PCR鍋柄PCR免疫PCRRAPD定量PCR原位PCR6、PCR的種類RT-PCR特異PCR錨定PCR反向PCR套

F

R（1）特異PCR

擴增所用的引物是特異的，擴出的產物也是特定的。

（2）RT-PCR：是一類以mRNA為最初模板的基因的擴增。AAAAAAAAAA5`CAPTTTTTTTTTTTFR（1）特異PCR（2）RT-PCR：AAA（3）反向PCR：根據已知序列擴增兩側序列的方法。已知序列未知序列未知序列酶切酶切引物2引物1此PCR操作過程：酶切基因組DNA連接環(huán)化目的DNA用引物1和引物2組合擴增出側翼序列（3）反向PCR：已知序列未知序列未知序列酶切酶切引物2引（4）定量PCR廣義概念的定量PCR技術是指以外參或內參為標準，通過對PCR終產物的分析或PCR過程的監(jiān)測，進行PCR起始模板量的定量。狹義的定量PCR技術是指用外標法（熒光雜交探針保證特異性）通過監(jiān)測PCR過程（監(jiān)測擴增效率）達到精確定量起始模板數的目的，同時以內對照有效排除假陰性結果（擴增效率為零）。用途：分析基因組中某個基因的拷貝數或分析基因的轉錄表達豐度。（4）定量PCR廣義概念的定量PCR技術是指以外參或內參為標指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

實時熒光定量PCR技術指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整

原理：通過實時檢測PCR每一個循環(huán)擴增產物相對應的熒光信號，來實現對起始模板進行定量及定性的分析。初始模板量X0的對數值與C(T)值之間呈線性關系：logX0=-log(1+Ex)*Ct+logN

原理：通過實時檢測PCR每一個循環(huán)擴增產物相對應的熒ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04閾值線Ct值Ct值Ct值的定義

在熒光定量PCR技術中，有一個很重要的概念——Ct值。C代表Cycle，t代表thresholdCt值的含義是：每個反應管內的熒光信號開始由本底進入指數增長階段時到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數（如后圖所示）ThresholdlineC(t)valueC(t)

PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold=10′SDcycle6-15

熒光域值（threshold）的設定

PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，

研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。Ct值與起始模板的關系ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04閾值線Ct值Ct值

研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數熒光信號如何產生？1、SYBRGreen12、Molecular

Beacons3、TaqMan相關內容見《分子生物學》熒光信號如何產生？1、SYBRGreen1相關內容見《分原理：用于擴增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分別用多聚dC和已知的序列作為引物進行PCR擴增。錨定PCR主要用于分析具有可變末端的DNA序列原理：用于擴增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一原理：用不等量的一對引物，PCR擴增后產生大量的單鏈DNA(SSDNA).這對引物分別稱為非限制引物與限制性引物，其比例一般為50～100∶1.在PCR反應的最初10～15個循環(huán)中，其擴增產物主要是雙鏈DNA，但當限制性引物(低濃度引物)消耗完后，非限制性引物(高濃度引物)引導的PCR就會產生大量的單鏈DNA.不對稱PCR不對稱PCR主要為測序制備ss-DNA，尤為用cDNA經不對稱PCR進行DNA序列分析是研究真核DNA外顯子的好方法。原理：用不等量的一對引物，PCR擴增后產生大量的單鏈DNA(直接或間接特異性識別4種堿基5ˊ32PG廣義概念的定量PCR技術是指以外參或內參為標準，通過對PCR終產物的分析或PCR過程的監(jiān)測，進行PCR起始模板量的定量。（c）競爭DNA與探針DNA分別結合不同的蛋白質，出現同（a）一樣的阻滯條帶。沒有聚合的dNTP、反應過剩的dNTP所依據的原理是，帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當它們混合在一起時，其相應的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結構。應用甲基化保護作用進行的體內足跡實驗DNaseⅠ足跡實驗是一類用于檢測與特定蛋白質結合的DNA序列的部位及特性的專門的實驗技術。用引物1和引物2組合擴增出側翼序列在進行核酸印跡轉移的時：指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。核酸雜交常用幾種膜的性能比較PCR產物質量的影響因素根據毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉移并結合在適當的濾膜上，然后通過同標記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA印跡雜交技術。Sanger雙脫氧鏈終止法Maxam-Gilbert化學分析法核酸印跡轉移：將核酸樣品轉移到固體支持膜上。ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶第四節(jié)核酸雜交（印跡）技術直接或間接特異性識別4種堿基第四節(jié)核酸雜交（印跡）技術本節(jié)內容印跡基本原理與過程DNA印跡（Southernblotting）RNA印跡（Northernblotting）斑點雜交原位雜交蛋白質/DNA、蛋白質/RNA雜交技術westernblotting（Pr）本節(jié)內容印跡基本原理與過程核酸分子雜交技術是在1968年由華盛頓卡內基學院（CavnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事發(fā)明的。所依據的原理是，帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當它們混合在一起時，其相應的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結構。核酸分子雜交（DNA/DNAorDNA/RNA）技術

雜交分子：彼此退火的核酸來自不同的生物有機體，而形成的雙鏈分子；作用：DNA/DNA的雜交作用檢測特定生物有機體之間的親源關系；DND/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片斷中某種特定基因的位置。核酸分子雜交技術是在1968年由華盛頓卡內基學院（Cavne核酸雜交常用幾種膜的性能比較核酸雜交常用幾種膜的性能比較

1.核酸印跡轉移：將核酸樣品轉移到固體支持膜上。利用的是毛細管作用

2.印跡雜交：將具有核酸印跡的濾膜同帶有標記的DNA/RNA進行雜交。尼龍膜或硝酸纖維素膜雜交的步驟1.核酸印跡轉移：將核酸樣品轉移到固體支持膜上。利用根據毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉移并結合在適當的濾膜上，然后通過同標記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA印跡雜交技術。由于它是由E.Southern于1975年首先設計出來的，故又叫SouthernDNA印跡轉移技術。1、DNA印跡雜交根據毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉移并結（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片Southern凝膠轉移雜交技術過程在進行核酸印跡轉移的時：要將以轉好的硝酸纖維素膜在80度下烘烤1～2小時；紫外線交聯法，將DNA分子上的部分胸腺嘧啶殘基同尼龍膜表面的帶正電荷的氨基基團之間進行交聯。利用Southern印跡法可進行克隆基因的酶切、圖譜分析、基因組中某一基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性片斷長度多態(tài)性分析（RFLP）等。（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸1979年，等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉移到硝酸纖維素濾膜或其他化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法。由于這種方法與DNA印跡雜交技術十分類似，又稱為Northernblotting。2、RNA印跡技術（Northernblotting）應用：Northern雜交技術應用于特定性狀基因在mRNA水平上的動態(tài)表達研究。應用于定位克隆中尋找新基因，尋找染色體特定區(qū)域的表達序列是大多數人類遺傳疾病連鎖分析和定位克隆的主要限速步驟，Northern雜交作為尋找這些序列的有效方法，有助于這些疾病候選基因的篩選；1979年，等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉移到硝酸斑點印跡雜交是在Southern印跡雜交的基礎上發(fā)展的一種的快速檢測特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸雜交技術。是指將待測的DNA變性后點加在硝酸纖維素膜（或尼龍膜,NC膜）上，用已標記的探針進行雜交，洗膜(除去未接合的探針)，放射自顯影，判斷是否有雜交及其雜交強度，主要用于基因缺失或拷貝數改變的檢測。3、斑點印跡雜交（dotblotting）斑點印跡雜交是在Southern印跡雜交的基礎上發(fā)展的一種的也叫原位雜交，是指把菌落或噬菌斑轉移到硝酸纖維素膜上，使溶菌的DNA同濾膜原位結合，帶有DNA的濾膜烘干后，與放射性同位素標記特異的DNA或RNA探針雜交。應用：鑒定重組子。4、菌落雜交意義：用原位雜交技術，可在原位研究細胞合成某種多肽或蛋白質的基因表達。此方法有很高的敏感性和特異性，可進一步從分子水平來探討細胞的功能表達及其調節(jié)機制。已成為當今細胞生物學、分子生物學研究的重要手段。也叫原位雜交，是指把菌落或噬菌斑轉移到硝酸纖維素膜上，使溶菌③引物先同單鏈模板復性。可以間接的闡明體內發(fā)生DNA與蛋白質之間的相互作用。已成為當今細胞生物學、分子生物學研究的重要手段?？梢蚤g接的闡明體內發(fā)生DNA與蛋白質之間的相互作用。5ˊ32PGTCATGT2、PCR反應過程：5AAATCGTCGTCATCTAAAATACGAATACGTTGAAAGTGGGTAAG35ˊ32PG5、蛋白質/DNA、蛋白質/RNA雜交技術Maxam-Gilbert化學分析法同探針同源雜交的基因DNA片段2005年底，羅氏診斷公司和454公司推出了——GenomeSequencer20System(GS20)廣義概念的定量PCR技術是指以外參或內參為標準，通過對PCR終產物的分析或PCR過程的監(jiān)測，進行PCR起始模板量的定量。Thresholdline變性：DNA雙鏈變?yōu)閱捂?；Keytechnique5ˊ32PGTCATGTGCTA退火：引物與模板結合；檢測重組體克隆的菌落雜交技術③引物先同單鏈模板復性。檢測重組體克隆的菌落雜交技術5、蛋白質/DNA、蛋白質/RNA雜交技術凝膠阻滯實驗（Gelretardationassay）又叫DNA遷移率變動實驗（DNAmobilityshiftassay），是在80年代初期出現的用于在體外研究DNA與蛋白質相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術。它具有簡單、快捷等優(yōu)點，也是當前被選作分離純化特定DNA結合蛋白質的一種典型的實驗方法。原理：DNA與蛋白的結合導致了電泳時遷移率的降低。5、蛋白質/DNA、蛋白質/RNA雜交技術凝膠阻滯實驗（Ge應用：不僅可以用來鑒定在特殊類型細胞的提取物中，是否存在與某一特定DNA片斷結合的蛋白質分子而且可以研究發(fā)生此中結合之精確的DNA序列的特異性。（加入超量的非標記競爭DNA）?？梢蚤g接的闡明體內發(fā)生DNA與蛋白質之間的相互作用。用具有已知轉錄因子結合位點的競爭DNA，可檢測蛋白是否屬于此類轉錄因子在競爭DNA的已知轉錄因子結合位點上，引入突變可評估突變對競爭DNA性能及其轉錄因子結合的影響。凝膠阻滯實驗（Gelretardationassay）應用：凝膠阻滯實驗（Gelretardationassa在凝膠阻滯實驗中競爭DNA與探針DNA之間的競爭作用（a）沒有加入競爭DNA的正常的凝膠阻滯實驗，探針DNA與特異蛋白質結合，出現阻滯條帶；（b）加入的超量競爭DNA與探針DNA競爭結合同一種蛋白質，阻滯條帶消失；（c）競爭DNA與探針DNA分別結合不同的蛋白質，出現同（a）一樣的阻滯條帶。凝膠阻滯實驗（Gelretardationassay）

凝膠阻滯實驗能揭示在體內發(fā)生的DNA與蛋白質之間的相互作用的有關信息，但無法確定兩者結合的準確部位。而DNaseⅠ足跡實驗可以解決這個問題在凝膠阻滯實驗中競爭DNA與探針DNA之間的競爭作用凝膠阻滯DNaseⅠ足跡實驗是一類用于檢測與特定蛋白質結合的DNA序列的部位及特性的專門的實驗技術。足跡實驗的一個明顯優(yōu)點是，可以形象地展示出一種特殊的蛋白質因子同特定DNA片段之間的結合區(qū)域。DNaseⅠ足跡實驗（footprintingassay）如果使用較大的DNA片段，通過足跡實驗便可確定其中不同的核苷酸序列與不同蛋白質因子之間的結合單位的分布狀況。如同凝膠阻滯實驗一樣，我們也可以加入非標記的競爭DNA序列，來消除特定的“足跡”，并據此測定其核苷酸序列的特異性。DNaseⅠ足跡實驗是一類用于檢測與特定蛋白質結合的DNA序在凝膠阻滯實驗中競爭DNA與探針DNA之間的競爭作用已成為當今細胞生物學、分子生物學研究的重要手段。TTTTTTTTTTT每個反應產物用不同顏色的熒光標記進行區(qū)分，再用計算機將經過熒光探頭的不同顏色順序轉變成測序信息。4kindofdRhodamine中文名稱：聚合酶鏈式反應核酸印跡轉移：將核酸樣品轉移到固體支持膜上。Heatdenaturation2005Sep15;437(7057):326-7Eghold,M.Keytechnique2）引物退火溫度Tm與時間；指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。10PCRbuffer3、PCR反應體系：特定化學試劑可對堿基進行特異性修飾Thresholdlineprimer2(10M)C反應：在NaCl存在時，只有C才能與肼發(fā)生反應，隨后被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。5ˊ32PGTCATGTGCTAdNTPMixture(10mMeach)Chemiluminescencedetectioninpicotiterplates原理：DMS能使裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化，而六氫吡啶會對甲基化的G殘基作特異的化學切割。而與蛋白結合的DNA片斷上的G殘基不會被DMS甲基化，從而避開了六氫吡啶的切割作用。于是在DNA片斷的序列中，不存在具這些G殘基末端的DNA片斷，出現了空白區(qū)。硫酸二甲酯（DMS）足跡與DNA酶足跡法類似的技術，但不用DNA酶來分解未被蛋白質結合保護的DNA部分，而是用硫酸二甲酯(DMS)來使未受保護的DNA甲基化，DNA可以在甲基化位置被化學降解，DNA分子上與蛋白質緊密結合區(qū)內的堿基不能被DMS甲基化。在凝膠阻滯實驗中競爭DNA與探針DNA之間的競爭作用原理：D甲基化干擾實驗（methyltioninterferenceassay）根據DMS能夠使G殘基甲基化，而六氫吡啶又能夠特異切割甲基化的G殘基這一原理，設計出了另一種研究DNA與蛋白質相互作用的實驗方法，即甲基化干擾實驗。這種技術可以檢測靶DNA中特異G殘基的優(yōu)先甲基化對而后的蛋白質結合作用究竟會有什么效應，從而更加詳細地揭示DNA與蛋白質之間相互作用的模式。主要局限性：它只能使G殘基甲基化。盡管如此，它仍不愧為足跡實驗的一種有效的補充手段，可以鑒定足跡區(qū)段中DNA與蛋白質相互作用的精確位置。甲基化干擾實驗（methyltioninterferenc應用甲基化保護作用進行的體內足跡實驗應用甲基化保護作用進行的體內足跡實驗6、Westernblotting原理:與Southern或Northern雜交方法類似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。過程：經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。應用：該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。6、Westernblotting原理:與Southern第五節(jié)DNA測序技術第五節(jié)DNA測序技術本節(jié)內容Maxam-Gilbert化學分析法Sanger雙脫氧鏈終止法新發(fā)展的DNA雜交測序法本節(jié)內容Maxam-Gilbert化學分析法BasicprincipleCleavagesatspecificbases(6)PCR反應程序設定DNAtemplate(0.（b）加入的超量競爭DNA與探針DNA競爭結合同一種蛋白質，阻滯條帶消失；同探針同源雜交的基因DNA片段onaverage250bases/readPyrosequencing454Sequencing核酸分子雜交（DNA/DNAorDNA/RNA）技術GenomeSequencerFLX用引物1和引物2組合擴增出側翼序列在競爭DNA的已知轉錄因子結合位點上，引入突變可評估突變對競爭DNA性能及其轉錄因子結合的影響。紫外線交聯法，將DNA分子上的部分胸腺嘧啶殘基同尼龍膜表面的帶正電荷的氨基基團之間進行交聯。Roche/4543、斑點印跡雜交（dotblotting）C代表Cycle，t代表threshold酶降解,反應體系得以再生斑點印跡雜交是在Southern印跡雜交的基礎上發(fā)展的一種的快速檢測特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸雜交技術。蛋白質/DNA、蛋白質/RNA雜交技術10PCRbufferChemiluminescencedetectioninpicotiterplatespublished:ProcNatlAcadSciUSA,vol741980NobelPrizeChemicalFSangerWGilbertBasicprinciplepublished:PrMaxam-GilbertDNAsequencingbychemicaldegradation化學降解法Maxam-GilbertDNAsequencingb1.Basicprinciple特定化學試劑可對堿基進行特異性修飾在修飾堿基處(5‘或3’)打斷磷酸二酯鍵直接或間接特異性識別4種堿基生成起始于固定起點和終止于特定堿基的一組核苷酸片段1.Basicprinciple特定化學試劑可對堿基進行G反應：DMS使鳥嘌呤的7位氮原子甲基化，其后斷開第8位碳原子和第9位氮原子間的化學鍵，哌啶置換了被修飾鳥嘌呤與核糖的結合。G+A反應：甲酸使嘌呤環(huán)上的氮原子質子化，削弱了腺嘌呤脫氧核糖核苷酸和鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸中的糖苷鍵，然后哌啶置換了嘌呤。T+C反應：肼斷開了嘧啶環(huán)，產生的堿基片段能被哌啶所置換。C反應：在NaCl存在時，只有C才能與肼發(fā)生反應，隨后被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。G反應：DMS使鳥嘌呤的7位氮原子甲基化，其后斷開第8位碳2.Procedure

TemplatesChemicalreaction

adefinedDNArestrictionfragmentradioactivelylabeledatoneendwith32PRunningPAGE(7Murea)6%~20%CleavagesatspecificbasesAutoradiography2.ProcedureTemplates第六章基因工程的基本技術參考課件5ˊ

32P-GTCATGTGCTAG5ˊ

32PGTCATGTGCTA5ˊ

32PGTCATGTGCT5ˊ

32PGTCATGTGC5ˊ

32PGTCATGTG5ˊ

32PGTCATGT5ˊ

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32PGTCAT5ˊ

32PGTCA5ˊ

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32PG從下到上依次讀出DNA片段的核苷酸序列5ˊ32P-GTCATGTGCTAG5ˊ32P體系成分：模板DNA、引物、Taq酶(熱穩(wěn)定性)、dNTP、反應緩沖液（Mg2+ 、BSA、Tween20、DTT、Tris.dNTPMixture(10mMeach)5、蛋白質/DNA、蛋白質/RNA雜交技術硫酸二甲酯（DMS）足跡在競爭DNA的已知轉錄因子結合位點上，引入突變可評估突變對競爭DNA性能及其轉錄因子結合的影響。核酸雜交常用幾種膜的性能比較CATCGTACGTAGCATCGTACGTA(3)模板：主要考慮純度及使用量2）引物退火溫度Tm與時間；2、PCR反應過程：Thresholdline5、蛋白質/DNA、蛋白質/RNA雜交技術引物的3’端嚴防錯配。CATCGTACGTA5ˊ32PGTCATGTGCT指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。甲基化干擾實驗（methyltioninterferenceassay）退火：引物與模板結合；5ˊ32PGTCATGT足跡實驗的一個明顯優(yōu)點是，可以形象地展示出一種特殊的蛋白質因子同特定DNA片段之間的結合區(qū)域。dideoxy-mediatedchain-terminationmethodBiologicalmethod體系成分：模板DNA、引物、Taq酶(熱穩(wěn)定性)、dNTPDNA聚合酶能夠用單鏈DNA作為模板，合成準確的DNA互補鏈；該酶能夠用2‘，3’--雙脫氧核苷三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3‘-末端，從而終止其延伸反應。在DNA測序反應中，加入模板DNA，引物（特異性引物），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一種ddNTP。（常用Klenow大片段，無5‘→3’外切酶活性）DNAsynthesiswillbeterminated

whenaddNTPisintegratedSanger雙脫氧鏈終止法的基本原理DNA聚合酶能夠用單鏈DNA作為模板，合成準確的DNA互補鏈已成為當今細胞生物學、分子生物學研究的重要手段。(polymerasechainreaction)5ˊ32PGChemicalreaction在競爭DNA的已知轉錄因子結合位點上，引入突變可評估突變對競爭DNA性能及其轉錄因子結合的影響。和ATP則迅速被反應體系中的三磷酸腺苷雙磷酸C:dNTP+ddCTP3、PCR反應體系：(polymerasechainreaction)1980NobelPrizeChemicalRoche/454Primerwalking2、PCR反應過程：2007年推出了通量更大，讀長更長，準確性更高的第二代基因組測序系統(tǒng)——GenomeSequencerFLXSystem(GSFLX)CATCGTACGTAG5ˊ32PGTCATGT⑤進行聚合反應，DNA新生鏈延長，當摻入ddNTP時，聚合反應終止。2007年推出了通量更大，讀長更長，準確性更高的第二代基因組測序系統(tǒng)——GenomeSequencerFLXSystem(GSFLX)3’AGCTCGTAGCATGCATCGATGCATGCTAGCAT5’dATP,dCTP,dGTP,dTTPddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTPCATCGTACATCGTACGTAGCATCGTACCATCGTACGCATCGTACGTCATCGTACGTATemplateCATCGTACGTAGCprimer已成為當今細胞生物學、分子生物學研究的重要手段。3’AGCTA:dNTP+ddATPG:dNTP+ddGTPC:dNTP+ddCTPT:dNTP+ddTTPGATC5AAATCGTCGTCATCTAAAATACGAATACGTTGAAAGTGGGTAAG3A:dNTP+ddATPG:dNTP+ddGTP測序步驟①用M13噬菌體做載體獲得單鏈DNA模板，克隆并擴增待測DNA片段，使其變性。②選擇一條與DNA單鏈互補的短鏈引物，將引物用放射性同位素標記。③引物先同單鏈模板復性。④在四個反應管中分別加入待測DNA單鏈模板、互補引物分子、四種的dNTP、DNA聚合酶(Klenow酶)以及不同的ddNTP。⑤進行聚合反應，DNA新生鏈延長，當摻入ddNTP時，聚合反應終止。⑥在聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠中電泳。⑦根據X底片對凝膠曝光所顯的條帶位置，讀出DNA序列。測序步驟①用M13噬菌體做載體獲得單鏈DNA模板，克隆并擴第六章基因工程的基本技術參考課件5ˊ

32P-GTCATGTGCTAG5ˊ

32PGTCATGTGCTA5ˊ

32PGTCATGTGCT5ˊ

32PGTCATGTGC5ˊ

32PGTCATGTG5ˊ

32PGTCATGT5ˊ

32PGTCATG5ˊ

32PGTCAT5ˊ

32PGTCA5ˊ

32PGTC5ˊ

32PGT5ˊ

32PG從下到上依次讀出DNA片段的核苷酸序列5ˊ32P-GTCATGTGCTAG5ˊ32P新發(fā)展的DNA測序技術新發(fā)展的DNA測序技術DNA自動測序儀的應用實現了凝膠電泳、初始數據獲取、堿基閱讀等步驟自動化。自動測序儀的設計原理是采用熒光標記DNA片段，并用激光激活的熒光探測系統(tǒng)，檢測序列反應的分離產物，讀出電泳條帶所示的堿基順序。分離產物有兩種基本方法：單熒光標記四泳道分離和四熒光標記的單泳道分離。

特點DNA自動測序儀的應用實現了凝膠電泳、初始數據獲取、堿基閱讀測序原理ABI公司（美國應用生物系統(tǒng)公司）發(fā)展的四標記單泳道法是用4種不同的熒光標記物標記4個反應的引物，4個反應在一個泳道中電泳分離。每個反應產物用不同顏色的熒光標記進行區(qū)分，再用計算機將經過熒光探頭的不同顏色順序轉變成測序信息。這種同一泳道的分離避免了泳道間差異對測序的影響。測序原理ABI公司（美國應用生物系統(tǒng)公司）發(fā)展的四標記單泳道ddGTPddATPddTTPddCTPKeytechniqueLabelingddNTPwith4kindofdRhodamine

EachdRhodaminegivedifferentcolorddGTPddATPddTTPddCTPKeytechni2.測序步驟2.測序步驟A:dNTP+ddATPG:dNTP+ddGTPC:dNTP+ddCTPT:dNTP+ddTTPA:dNTP+ddATPG:dNTP+ddGTP第六章基因工程的基本技術參考課件計算機排序5ˊ計算機排序5ˊ第六章基因工程的基本技術參考課件Strategy

for

sequencingaDNAfragment1.Primerwalking2.RandomclonesStrategyforsequencingaD1.PrimerwalkingSynthesizingoligo-nucleotides一次測序反應一般可讀出600～800bp，若待測序的DNA片斷較大，則需從多處不同的位置引導測序反應。1.PrimerwalkingSynthesizing2.Randomclones對于更大的目標片段：一次測序反應一般可讀出600～800bp，若待測序的DNA片斷非常大，則可以將目標片段打斷，然后進行隨機克隆，構建能夠覆蓋其全長的文庫，然后對這些文庫進行測序，獲得一系列打斷的片段序列，最后通過拼接獲得全長序列。2.Randomclones對于更大的目標片段：一次測第六章基因工程的基本技術參考課件SolexaSOLiD新一代高通量測序技術SolexaSOLiD新一2005年底，羅氏診斷公司和454公司推出了——GenomeSequencer20System(GS20)2007年推出了通量更大，讀長更長，準確性更高的第二代基因組測序系統(tǒng)——GenomeSequencerFLXSystem(GSFLX)454基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統(tǒng)2005年底，羅氏診斷公司和454公司推出了——GenomeRoche/454:GenomeSequencerFLXRealTimeSequencingbySynthesisChemiluminescencedetectioninpicotiterplatesAmplification:emulsionPCRPyrosequencingupto400,000reads/runonaverage250bases/readupto100Mb/runRoche/454GenomeSequencerFLX100Mb/runRoche/454:GenomeSequencerPyrosequencing454SequencingGenomesequencinginmicrofabricatedhigh-densitypicolitrereactorsMargulies,M.Eghold,M.etal.Nature.2005Sep15;437(7057):326-7Pyrosequencing454Sequencin第六章基因工程的基本技術參考課件1）樣品種類：GSFLX系統(tǒng)支持各種不同來源的樣品序列測定：包括基因組DNA，PCR產物，BAC，cDNA，小分子RNA等等。2）樣品DNA打斷：樣品被打斷成300－800bp的片段；3）銜接子連接：將A和B接頭（3’和5’端具有特異性）連接到DNA片段上。接頭也將在后繼的純化，擴增和測序步驟中用到。1）樣品種類：GSFLX系統(tǒng)支持各種不同來源的樣品序列測定4）一條DNA片段＝一個磁珠：接頭使成百上千條DNA片段結合到它們自己唯一的磁珠上，此磁珠被單個油水混合小滴包被后，在這個小滴里進行獨立的擴增，而沒有其他的競爭性或者污染性序列的影響；整個DNA片段進行平行擴增。5）一個磁珠＝一條讀長：經過PCR擴增后，每個磁珠上的DNA片段擁有了成千上萬個相同的拷貝。經過富集以后，這些片段仍然和磁珠結合在一起，隨后就可以放入到PicoTiterPlate板中供后繼測序使用了。6）數據讀取和分析工具：GSFLX系統(tǒng)在7.5小時的運行當中可獲得40多萬個讀長(200bp)，讀取超過1億個堿基信息(100MB)。4）一條DNA片段＝一個磁珠：接頭使成百上千條DNA片段結合第六章基因工程的基本技術參考課件ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶沒有聚合的dNTP、反應過剩的dNTP和ATP則迅速被反應體系中的三磷酸腺苷雙磷酸酶降解,反應體系得以再生沒有聚合的dNTP、反應過剩的dNTPAsectionofPyrosequencingreadsAsectionofPyrosequencingre第六章基因工程的基本技術第六章基因工程的基本技術89優(yōu)選第六章基因工程的基本技術優(yōu)選第六章基因工程的基本技術核酸提取技術凝膠電泳技術PCR技術核酸雜交技術DNA測序技術主要內容核酸提取技術主要內容第一節(jié)、第二節(jié)前章節(jié)已介紹第一節(jié)、第二節(jié)第三節(jié)PCR技術第三節(jié)PCR技術第三節(jié)PCR技術PCR基本原理基本過程與反應體系PCR引物設計的原則PCR產物質量的影響因素PCR的種類第三節(jié)PCR技術PCR基本原理中文名稱：聚合酶鏈式反應1、PCR原理：

變性溫度下，DNA雙鏈變性雙螺旋解開成單鏈DNA，在退火溫度中人工合成的特異引物根據堿基互補配對原則與單鏈DNA特異結合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸溫度下不同的脫氧核苷酸按照堿基互補配對原則在引物的引導下合成與模板DNA互補的新鏈，實現DNA的擴增。技術3：PCR技術(polymerasechainreaction)中文名稱：聚合酶鏈式反應1、PCR原理：變性PCR操作流程94℃50℃72℃PCR操作流程94℃50℃72℃2、

PCR反應過程：變性：DNA雙鏈變?yōu)閱捂?；退火：引物與模板結合；延伸：合成互補鏈；上述過程通過PCR儀的程序設計及自動運作完成。2、PCR反應過程：變性：DNA雙鏈變?yōu)閱捂?；上述過程RealTimeSequencingbySynthesis以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。(6)PCR反應程序設定1979年，等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉移到硝酸纖維素濾膜或其他化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法。Roche/454硫酸二甲酯（DMS）足跡RunningPAGE(7Murea)6%~20%一次測序反應一般可讀出600～800bp，若待測序的DNA片斷較大，則需從多處不同的位置引導測序反應。5ˊ32PGTCATGTGCT根據毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉移并結合在適當的濾膜上，然后通過同標記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA印跡雜交技術。3、PCR反應體系：5小時的運行當中可獲得40多萬個讀長(200bp)，讀取超過1億個堿基信息(100MB)。PCR產物質量的影響因素1980NobelPrizeChemical(polymerasechainreaction)FSangerWGilbert利用Southern印跡法可進行克隆基因的酶切、圖譜分析、基因組中某一基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性片斷長度多態(tài)性分析（RFLP）等。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。5ˊ32PGTCATGTG5AAATCGTCGTCATCTAAAATACGAATACGTTGAAAGTGGGTAAG3這種同一泳道的分離避免了泳道間差異對測序的影響。DNaseⅠ足跡實驗是一類用于檢測與特定蛋白質結合的DNA序列的部位及特性的專門的實驗技術。引物的3’端嚴防錯配。同探針同源雜交的基因DNA片段2007年推出了通量更大，讀長更長，準確性更高的第二代基因組測序系統(tǒng)——GenomeSequencerFLXSystem(GSFLX)Primersannealing退火：引物與模板結合；利用Southern印跡法可進行克隆基因的酶切、圖譜分析、基因組中某一基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性片斷長度多態(tài)性分析（RFLP）等。酶降解,反應體系得以再生Roche/454(6)PCR反應程序設定3、斑點印跡雜交（dotblotting）特定化學試劑可對堿基進行特異性修飾5ˊ32PG原理：通過實時檢測PCR每一個循環(huán)擴增產物相對應的熒光信號，來實現對起始模板進行定量及定性的分析。Keytechnique(3)模板：主要考慮純度及使用量廣義概念的定量PCR技術是指以外參或內參為標準，通過對PCR終產物的分析或PCR過程的監(jiān)測，進行PCR起始模板量的定量。3、PCR反應體系：體系成分：模板DNA、引物、Taq酶(熱穩(wěn)定性)、dNTP、反應緩沖液（Mg2+ 、BSA、Tween20、DTT、Tris.cl）

。RealTimeSequencingbySynthe1）、引物（寡聚核苷酸）一般成對出現，長度為15-30個核苷酸；

使用濃度：0.1-0.5uM，高達1uM；引物設計原則：G+C含量45-55%；Tm值高于55；引物特異性；引物擴增跨度；是否形成引物二聚體引物的3’端嚴防錯配。1）、引物（寡聚核苷酸）一般成對出現，長度為15-30個核2）、模板DNA：

基因組DNA、質粒DNA、其它DNA片段；

質量要求：不高3）、Taq酶(熱穩(wěn)定性)：常規(guī)酶高保真酶：ExTaqLaTaq酶4）、反應緩沖液成分：

BSA、Tween20、DTT、明膠保護酶作用

Tris.cl提供緩沖作用2）、模板DNA：以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。沒有聚合的dNTP、反應過剩的dNTP應用甲基化保護作用進行的體內足跡實驗退火：引物與模板結合；2005年底，羅氏診斷公司和454公司推出了——GenomeSequencer20System(GS20)此方法有很高的敏感性和特異性，可進一步從分子水平來探討細胞的功能表達及其調節(jié)機制。5ˊ32PGTCAT可以間接的闡明體內發(fā)生DNA與蛋白質之間的相互作用。⑤進行聚合反應，DNA新生鏈延長，當摻入ddNTP時，聚合反應終止。根據已知序列擴增兩側序列的方法。影響：酶的活性、引物-模板退火、特異性。用途：分析基因組中某個基因的拷貝數或分析基因的轉錄表達豐度。3’AGCTCGTAGCATGCATCGATGCATGCTAGCAT5’upto400,000reads/run利用Southern印跡法可進行克隆基因的酶切、圖譜分析、基因組中某一基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性片斷長度多態(tài)性分析（RFLP）等。6l(2U/50l)G+C含量45-55%；(3)模板：主要考慮純度及使用量已成為當今細胞生物學、分子生物學研究的重要手段。（b）加入的超量競爭DNA與探針DNA競爭結合同一種蛋白質，阻滯條帶消失；原理：DNA與蛋白的結合導致了電泳時遷移率的降低。又叫DNA遷移率變動實驗（DNAmobilityshiftassay），是在80年代初期出現的用于在體外研究DNA與蛋白質相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術。Endingreaction

4、影響PCR產量、質量的因素：(1)

Taq酶：常用1-2.5U/反應（25uL）

濃度低，擴增產物不夠；

濃度高，非特異性擴增增加；酶的活性；(2)

dNTP的濃度：常用100-200μmol/L，不能低于20μmol/L，特異性、保真性；以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，(3)模板：主要考慮純度及使用量對純度要求不高，但含有酚、氯仿等雜質則難以成功。使用量從幾個ng到100ng；(4)引物濃度：

0.1-0.5μmol/L之間，過多則非特異擴增增加，形成引物二聚體；(5)

Mg2+濃度：常用0.5-2.5mmol/L；影響：酶的活性、引物-模板退火、特異性。(3)模板：主要考慮純度及使用量(6)

PCR反應程序設定1）變性溫度和時間：要求變性徹底，但要考慮酶的半衰期：92.5℃（2小時）95℃（40min）97℃（5min）94℃變性比較徹底，酶的半衰期也不短。2）引物退火溫度Tm與時間；

Tm值由引物ATGC數決定每A、T計為2℃，G、C計為4℃，時間一般為40秒到60秒3）引物延伸溫度與時間：

72℃最佳，30-100nt/s，也有用68℃如LaTaq4）循環(huán)數：25-35cycles之間，過多則非特異擴增增加；平臺效應。(6)PCR反應程序設定1）變性溫度和時間：以普通PCR50lreactionsolution為例)10PCRbuffer25mMMgCl2dNTPMixture(10mMeach)primer1（10M)primer2(10M)Taqpolymerase(5U/l)DNAtemplate(0.1g/l)ddH2Ototal5l(1)4l(2mM)1l(0.1mM)1l(0.2M)1l(0.2M)0.6l(2U/50l)1l36.5l50l5、PCR例子（Exampleofreactionsolution）反應體系配置：以普通PCR50lreactionsolution

PCRthermalprogram94C94CTm72C72C4C1min30sec30sec1min5Cendless30cycles循環(huán)數HeatdenaturationHeatdenaturePrimersannealingExtensionLastextensionEndingreactionTa:annealingtemperature設計的反應程序相應作用PCRthermalprogram94C1min306、PCR的種類RT-PCR特異PCR錨定PCR反向PCR套式PCR不對稱PCR長程PCR鍋柄PCR免疫PCRRAPD定量PCR原位PCR6、PCR的種類RT-PCR特異PCR錨定PCR反向PCR套

F

R（1）特異PCR

擴增所用的引物是特異的，擴出的產物也是特定的。

（2）RT-PCR：是一類以mRNA為最初模板的基因的擴增。AAAAAAAAAA5`CAPTTTTTTTTTTTFR（1）特異PCR（2）RT-PCR：AAA（3）反向PCR：根據已知序列擴增兩側序列的方法。已知序列未知序列未知序列酶切酶切引物2引物1此PCR操作過程：酶切基因組DNA連接環(huán)化目的DNA用引物1和引物2組合擴增出側翼序列（3）反向PCR：已知序列未知序列未知序列酶切酶切引物2引（4）定量PCR廣義概念的定量PCR技術是指以外參或內參為標準，通過對PCR終產物的分析或PCR過程的監(jiān)測，進行PCR起始模板量的定量。狹義的定量PCR技術是指用外標法（熒光雜交探針保證特異性）通過監(jiān)測PCR過程（監(jiān)測擴增效率）達到精確定量起始模板數的目的，同時以內對照有效排除假陰性結果（擴增效率為零）。用途：分析基因組中某個基因的拷貝數或分析基因的轉錄表達豐度。（4）定量PCR廣義概念的定量PCR技術是指以外參或內參為標指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

實時熒光定量PCR技術指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整

原理：通過實時檢測PCR每一個循環(huán)擴增產物相對應的熒光信號，來實現對起始模板進行定量及定性的分析。初始模板量X0的對數值與C(T)值之間呈線性關系：logX0=-log(1+Ex)*Ct+logN

原理：通過實時檢測PCR每一個循環(huán)擴增產物相對應的熒ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04閾值線Ct值Ct值Ct值的定義

在熒光定量PCR技術中，有一個很重要的概念——Ct值。C代表Cycle，t代表thresholdCt值的含義是：每個反應管內的熒光信號開始由本底進入指數增長階段時到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數（如后圖所示）ThresholdlineC(t)valueC(t)

PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold=10′SDcycle6-15

熒光域值（threshold）的設定

PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，

研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。Ct值與起始模板的關系ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04閾值線Ct值Ct值

研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數熒光信號如何產生？1、SYBRGreen12、Molecular

Beacons3、TaqMan相關內容見《分子生物學》熒光信號如何產生？1、SYBRGreen1相關內容見《分原理：用于擴增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分別用多聚dC和已知的序列作為引物進行PCR擴增。錨定PCR主要用于分析具有可變末端的DNA序列原理：用于擴增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一原理：用不等量的一對引物，PCR擴增后產生大量的單鏈DNA(SSDNA).這對引物分別稱為非限制引物與限制性引物，其比例一般為50～100∶1.在PCR反應的最初10～15個循環(huán)中，其擴增產物主要是雙鏈DNA，但當限制性引物(低濃度引物)消耗完后，非限制性引物(高濃度引物)引導的PCR就會產生大量的單鏈DNA.不對稱PCR不對稱PCR主要為測序制備ss-DNA，尤為用cDNA經不對稱PCR進行DNA序列分析是研究真核DNA外顯子的好方法。原理：用不等量的一對引物，PCR擴增后產生大量的單鏈DNA(直接或間接特異性識別4種堿基5ˊ32PG廣義概念的定量PCR技術是指以外參或內參為標準，通過對PCR終產物的分析或PCR過程的監(jiān)測，進行PCR起始模板量的定量。（c）競爭DNA與探針DNA分別結合不同的蛋白質，出現同（a）一樣的阻滯條帶。沒有聚合的dNTP、反應過剩的dNTP所依據的原理是，帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當它們混合在一起時，其相應的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結構。應用甲基化保護作用進行的體內足跡實驗DNaseⅠ足跡實驗是一類用于檢測與特定蛋白質結合的DNA序列的部位及特性的專門的實驗技術。用引物1和引物2組合擴增出側翼序列在進行核酸印跡轉移的時：指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。核酸雜交常用幾種膜的性能比較PCR產物質量的影響因素根據毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉移并結合在適當的濾膜上，然后通過同標記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA印跡雜交技術。Sanger雙脫氧鏈終止法Maxam-Gilbert化學分析法核酸印跡轉移：將核酸樣品轉移到固體支持膜上。ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶第四節(jié)核酸雜交（印跡）技術直接或間接特異性識別4種堿基第四節(jié)核酸雜交（印跡）技術本節(jié)內容印跡基本原理與過程DNA印跡（Southernblotting）RNA印跡（Northernblotting）斑點雜交原位雜交蛋白質/DNA、蛋白質/RNA雜交技術westernblotting（Pr）本節(jié)內容印跡基本原理與過程核酸分子