第六章

微生物菌種的選育江南大學(xué)生物工程學(xué)院第六章

微生物菌種的選育江南大學(xué)生物工程學(xué)院1第一節(jié)從自然界中分離篩選菌種第一節(jié)從自然界中分離篩選菌種21、生產(chǎn)菌株來源

索取或購買自己選育用原有菌株進(jìn)行遺傳改造進(jìn)行育種向菌種保藏機(jī)構(gòu)索取、購買出發(fā)菌株進(jìn)行選從自然界中分離菌種

從自然界中分離菌種就是從自然界微生物資源中有目的、快速、準(zhǔn)確地選出所需要的菌種。1、生產(chǎn)菌株來源3

設(shè)計方案→采樣→增殖培養(yǎng)*→平板分離→篩選(初篩、復(fù)篩)→單株純種分離→性能考察(生產(chǎn)性能試驗、毒性試驗、菌種鑒定）從自然界中分離篩選菌種的一般步驟設(shè)計方案→采樣→增殖培養(yǎng)*→平板分離→篩選(初篩、復(fù)4一、采樣從自然界種采集含目的菌的樣品1. 環(huán)境條件對土樣本中微生物分布的影響營養(yǎng)環(huán)境水分溫度通風(fēng)酸堿度

一、采樣52 .采樣方法（1） 去除表層土（2） 取5-15cm土樣幾十克，裝入無菌牛皮低袋或逆料袋中3. 注意記錄：時間，地點，環(huán)境情況等樣品袋應(yīng)封好口，防止水分失去土樣應(yīng)在分離前破碎盡快分離2 .采樣方法6二.增殖培養(yǎng)（富集培養(yǎng)）適用：樣品中目的菌數(shù)量不夠多時目的：提高樣品中目的菌的數(shù)量和比例原理：通過控制營養(yǎng)成分或培養(yǎng)條件，使目的菌得以繁殖和/或非目的菌的生長受到抑制二.增殖培養(yǎng)（富集培養(yǎng)）適用：樣品中目的菌數(shù)量不夠多時71、增殖培養(yǎng)的方法

控制營養(yǎng)成分控制培養(yǎng)基pH控制培養(yǎng)溫度

熱處理——增殖芽孢細(xì)菌添加抑制劑

1、增殖培養(yǎng)的方法8三.純種分離目的：將目的菌從混雜的微生物中分離出來，獲得純培養(yǎng)1.純種分離的一般方法（1）稀釋平板法傾注平板或涂布平板（2）劃線法（3）組織分離法*

適用于分離高等真菌及植物病原菌三.純種分離目的：將目的菌從混雜的微生物中分離出來，獲得純9稀釋分離涂布平板稀釋分離涂布平板10稀釋分離傾注平板稀釋分離傾注平板112、平皿反應(yīng)快速檢出法——定性或半定量

紙片培養(yǎng)顯色法透明圈法變色圈法生長圈法抑制圈

2、平皿反應(yīng)快速檢出法——定性或半定量12瓊脂塊培養(yǎng)法篩選抗生素產(chǎn)生菌程序瓊脂塊培養(yǎng)法篩選抗生素產(chǎn)生菌程序133、厭氧性微生物的分離法（1）去除培養(yǎng)基中的溶解氧，降低Eh（2）創(chuàng)造無氧環(huán)境物理除氧空氣置換法：干燥器或厭氧培養(yǎng)罐化學(xué)除氧H2+O2→H2O(鈀作催化劑）GASPAK罐除氧：硼氫化鈉、檸檬酸，碳酸氫鈉化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生H2和CO2，H2與O2反應(yīng)生成水（3）厭氧分離（培養(yǎng)）技術(shù)高層瓊脂柱技術(shù)厭氧罐技術(shù)厭氧手套箱技術(shù)3、厭氧性微生物的分離法14GasPakGasPak15厭氧手套箱厭氧培養(yǎng)裝置厭氧手套箱厭氧培養(yǎng)裝置16四

、篩選初篩、復(fù)篩：

四、篩選17好氧培養(yǎng)好氧培養(yǎng)18五、培養(yǎng)工藝條件試驗與生產(chǎn)試驗1、搖瓶發(fā)酵條件

培養(yǎng)基組成、初始pH、通風(fēng)量（裝液量）、接種量、培養(yǎng)溫度…2、小型臺式發(fā)酵罐發(fā)酵工藝條件

溶解氧控制，pH值控制，原料添加模式，消泡劑…五、培養(yǎng)工藝條件試驗與生產(chǎn)試驗19第二節(jié)基因突變第二節(jié)基因突變20

突變（Mutation）定義：遺傳物質(zhì)核酸（DNA或病毒中的RNA）的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生了可遺傳的變化。突變是一種遺傳的狀態(tài)，是基因由于結(jié)構(gòu)發(fā)生改變從而由原來的存在狀態(tài)變?yōu)榱硪环N存在狀態(tài)，即它的等位基因。突變體：帶有突變基因的細(xì)胞或個體突變型：突變體的基因型或表型稱為突變型，和其相對的原存在狀態(tài)稱為野生型。21突變（Mutation）定義：遺傳物質(zhì)核酸（D一、突變類型按變化范圍分突變類型(一)染色體畸變（chromosomeaberration)染色體數(shù)目的變化或染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生較大片段的異常改變。

1、染色體數(shù)目的變化整倍體(euploidy)：含有完整的染色體組單倍體：haploid二倍體：diploid三倍體：triploid四倍體：tetraploid一、突變類型按變化范圍分突變類型22非整倍體aneuploidy：含有不完整狀態(tài)的染色體組，一般是指二倍體中成對染色體成員的增加或減少。單體（二倍減一，monosomicdiploid):2n-1缺體（二倍減二，nullisomicdilpoid):2n-2三體（二倍加一，trisomicdiploid):2n+1四體（二倍加二，tetrasomicdiploid):2n+2雙二倍加一（doubletrisomic）:2n+1+1部分二倍體（merodiploid）：細(xì)菌等原核生物中由一整條染色體和外來的一個染色體片段所構(gòu)成的不完整二倍體。非整倍體aneuploidy：含有不完整狀態(tài)的染色體組，一232、染色體結(jié)構(gòu)的變化缺失deletion：重復(fù)duplication：倒位inversion：易位translocation：2、染色體結(jié)構(gòu)的變化缺失deletion：24bfbf25(二)基因突變（genemutation）

----染色體局部座位內(nèi)的變化

點突變：只涉及DNA分子中一對或少數(shù)幾對堿基的改變。突變發(fā)生在一個基因范圍內(nèi)。多位點突變：突變超出一個基因范圍。1、堿基置換basereplacementDNA鏈上的某一堿基對為另一堿基對所取代。轉(zhuǎn)換transition：顛換transversion：(二)基因突變（genemutation）

26江南大學(xué)微生物課件527(3)遺傳學(xué)效應(yīng)錯義突變missensemutation：同義突變silentmutation：無義突變nonsensemutation：(3)遺傳學(xué)效應(yīng)282、移碼突變

frameshiftmutation：由于一對或少數(shù)幾對（不是三的倍數(shù)）核苷酸的插入或缺失而造成此后一系列遺傳密碼子的閱讀框發(fā)生移位錯誤的突變。2、移碼突變frameshiftmutation：由于29

PheAspGluProLeuCysThr5’-TTCGATGAGCCCTTGTGCACG-3’↓G→AmutationPheAspLysProLeuCysThr5’-TTCGATAAGCCCTTGTGCACG-3’↓C→TmutationPheAspLysProLeuCysThr5’-TTCGATAAGCCTTTGTGCACG-3’↓C→AmutationPheAspLysProLeuStopThr5’-TTCGATAAGCCCTTGTGAACG-3’PheAspGluProL30

PheAspGluProLeuCysThr5’-TTCGATGAGCCCTTGTGCACG-3’↓InsertionofAPheAspLysThrLeuValHis5’-TTCGATAAGACCCTTGTGCACG-3’

PheAspGluProL31二、按表型效應(yīng)分突變類型野生型wildtype：表現(xiàn)該物種正常表型的生物。突變型mutant：由于突變導(dǎo)致其正常的表型發(fā)生了改變的生物。形態(tài)突變型生化突變型營養(yǎng)缺陷型auxotrophicmutant

抗性突變型resistantmutant3.致死突變型4.條件致死突變型5.調(diào)節(jié)突變型二、按表型效應(yīng)分突變類型野生型wildtype：表現(xiàn)該物32三、基因突變的規(guī)律不對應(yīng)性或自發(fā)性、

隨機(jī)性、稀有性、獨(dú)立性、穩(wěn)定性、可逆性、誘變性、三、基因突變的規(guī)律不對應(yīng)性或自發(fā)性、331、自發(fā)突變的證實隨機(jī)性、不對應(yīng)性

1）波動實驗2）涂布實驗3）影印培養(yǎng)實驗1、自發(fā)突變的證實隨機(jī)性、不對應(yīng)性

1）波動實驗34波動實驗波動實驗35E.coliB抗噬菌體a的波動測驗結(jié)果培養(yǎng)皿編號培養(yǎng)皿上菌落數(shù)樣品來自同一培養(yǎng)物樣品來自不同培養(yǎng)物11446411021556200031352230042148107051565500861444253031726494000816512501920564030101347764815111071012040130191400151016017170111864019002035平均值16.751.43.311.35303.8方差15273.8694662040.8E.coliB抗噬菌體a的波動測驗結(jié)果培養(yǎng)皿編號培養(yǎng)皿上36四、突變的頻率：突變率（mutationrate）：每個細(xì)胞每一世代中發(fā)生突變的概率。世代總數(shù)=N2-N1突變率的測定：固體平板法測突變率：m=(M2-M1)/(N2-N1)液體培養(yǎng)法測突變率：m=2(M2/N2-M1/N1)/(g2-g1)液體稀釋法測突變率：P0=e-mN細(xì)胞分裂非同步性效正：突變率=ln2m=0.69m四、突變的頻率：37五、自發(fā)突變的機(jī)制環(huán)境因素的影響微生物自身產(chǎn)生的代謝物的影響轉(zhuǎn)座子所造成的插入突變DNA復(fù)制過程中偶爾發(fā)生錯誤五、自發(fā)突變的機(jī)制環(huán)境因素的影響38六、誘變劑及其誘變機(jī)制誘變是指通過人為的方法，利用物理、化學(xué)因素處理微生物而引起的突變。六、誘變劑及其誘變機(jī)制誘變是指通過人為的方法，利用物39(一)物理誘變劑1）輻射：uv，x-射線γ-射線等效應(yīng)：點突變或染色體畸變機(jī)制：直接作用和間接作用間接作用：輻射作用于染色體外物質(zhì)，產(chǎn)生具有誘變作用的物質(zhì)；直接作用：輻射直接作用于染色體，2）熱：機(jī)理復(fù)雜離子束:能量傳遞、動量交換，離子沉積與電荷積累過程(一)物理誘變劑1）輻射：uv，x-射線γ-射線等401、紫外線UV有效波長2650?，紫外燈波長2537?作用機(jī)理嘧啶二聚體、嘧啶水合物、交聯(lián)作用、DNA鏈斷裂效應(yīng)：移碼突變，堿基置換1、紫外線UV有效波長2650?，紫外燈波長253741

紫外線誘發(fā)胸苷二聚體紫外線誘發(fā)胸苷二聚體422、電離輻射：x-射線，g-射線作用機(jī)理直接作用：打斷化學(xué)鍵間接作用：通過自由基打斷化學(xué)鍵效應(yīng)：染色體畸變，堿基置換，移碼突變3、熱作用機(jī)理：脫嘌呤效應(yīng)：堿基置換，移碼突變4、離子束2、電離輻射：x-射線，g-射線43(二)化學(xué)誘變劑堿基類似物：是指其分子結(jié)構(gòu)同DNA分子中的堿基非常類似，因此能取代堿基參入到DNA分子中的一類化合物。主要誘變劑：5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤；可誘發(fā)ATGC的轉(zhuǎn)換。(二)化學(xué)誘變劑堿基類似物：是指其分子結(jié)構(gòu)同DNA分子中的44堿基類似物baseanalog5-溴尿嘧啶(5-BU，BU),5-氟尿嘧啶(5-FU，F(xiàn)U),5-氨基尿嘧啶(5-AU，AU),2-氨基嘌呤(2-AP，AP)8-氮鳥嘌呤（8-NG，NG）例：BU烯醇式：BUe，高頻出現(xiàn)，BUe≡G酮式：BUk，低頻出現(xiàn)，BUk=A堿基類似物baseanalog455-BU摻入后的摻入錯誤G≡CG≡BUeG≡CG≡BUeG≡CA=TA=BUkA:TA:BUkA:TG≡BUeA:TG≡CG≡BUeG≡C→A=T5-BU復(fù)制錯誤A:T→G≡C5-BU摻入后的摻入錯誤G≡CG≡BUeG≡462.移碼誘變劑嵌入DNA分子相鄰堿基對之間，從而有利于核苷酸的環(huán)出，因此可提高移碼突變的突變率。主要誘變劑：吖啶類化合物；溴化乙錠(ethidiumbromide)，ICR系列化合物等2.移碼誘變劑嵌入DNA分子相鄰堿基對之間，從而有利于核47部分移碼誘變劑

部分移碼誘變劑48DNA

插入劑DNA

插入劑493.化學(xué)修飾堿基的誘變劑1）烷化劑：使DNA分子的堿基發(fā)生烷化反應(yīng)，從而更容易發(fā)生錯配，是最常用的一類誘變劑。常用的有：硫酸二乙酯(DES)，甲基磺酸乙酯(EMS)，亞硝基乙基尿(NEU),亞硝基胍(NTG),乙烯亞胺(EI)等。NTG（亞硝基胍）誘變作用特強(qiáng)，作用于復(fù)制叉，可誘發(fā)多基因并發(fā)突變，被稱為超誘變劑。3.化學(xué)修飾堿基的誘變劑1）烷化劑：使DNA分子的堿基發(fā)生烷50ChemicalreactivityofbasesisresponsibleforsomeDNAlesionChemicalreactivityofbasesi51Alkylatedbases部分烷化劑和烷化堿基alkylatingagentsAlkylatedbases部分烷化劑和烷化堿基alkyl52DNA的脫嘌呤

DNA的脫嘌呤53烷化鳥嘌呤的堿基配對

烷化鳥嘌呤的堿基配對54烷化鳥嘌呤的交聯(lián)作用

烷化鳥嘌呤的交聯(lián)作用55如甲基黃酸乙脂（EMS）使G的第6位烷化，使T的第4位上烷化，結(jié)果產(chǎn)生的O-6-E-G和O-4-E-T分別和T、G配對，導(dǎo)致G∶C對轉(zhuǎn)換成A∶T對；T∶A對轉(zhuǎn)換成C∶G如甲基黃酸乙脂（EMS）562)

亞硝酸（introusacid,NA）有氧化脫氨作用，可使G第2個碳原子上的氨脫去，產(chǎn)生黃嘌呤（xanthine,x），次黃嘌呤(H)仍和C配對，故不產(chǎn)生轉(zhuǎn)換突變。但C和A脫氨后分別產(chǎn)生U和次黃嘌呤H，產(chǎn)生了轉(zhuǎn)換，使C∶G轉(zhuǎn)換成A∶T，A∶T轉(zhuǎn)換成G∶C2)亞硝酸（introusacid,NA）有氧化脫氨作573)羥胺（NH2OH）只特異地和胞嘧啶起反應(yīng)，在第4個C原子上加-OH，產(chǎn)生4-OH-C，此產(chǎn)物可以和A配對，使C∶G轉(zhuǎn)換成T∶A作用：與C反應(yīng)，造成GC→AT轉(zhuǎn)換3)羥胺（NH2OH）只特異地和胞嘧啶起反應(yīng)，在第4個C原58七、DNA損傷的修復(fù)1、光復(fù)活作用photoreactivation

七、DNA損傷的修復(fù)1、光復(fù)活作用photoreactiv592、切補(bǔ)修復(fù)excisionrepair（暗復(fù)活）2、切補(bǔ)修復(fù)excisionrepair（暗復(fù)活）60第三節(jié)

誘變育種第三節(jié)

誘變育種61一、誘變育種的一般步驟出發(fā)菌株↓純化、活化、同步培養(yǎng)培養(yǎng)液↓離心收集細(xì)胞、洗滌，制備均一的菌懸液（玻璃株打散、過濾）單細(xì)胞或單孢子懸液↓活菌計數(shù)，誘變預(yù)備試驗誘變處理↓活細(xì)胞計數(shù)，致死率計算中間培養(yǎng)(后培養(yǎng))↓平板分離↓變異率計算初篩→復(fù)篩→保藏及擴(kuò)大試驗一、誘變育種的一般步驟出發(fā)菌株62（一） 出發(fā)菌株的選擇1. 出發(fā)菌株的類型2. 對誘變劑的敏感性具有特定生產(chǎn)性狀的可能性：要盡量選擇單倍體，單核細(xì)胞（孢子)（一） 出發(fā)菌株的選擇1. 出發(fā)菌株的類型63（二）菌懸液的制備

細(xì)胞的生長狀態(tài)2.菌懸液的均一性：3.菌懸液細(xì)胞濃度酵母、霉菌孢子：106~107個/ml細(xì)菌、放線菌孢子：108個/ml4.菌懸液介質(zhì)：（二）菌懸液的制備細(xì)胞的生長狀態(tài)64（三）誘變處理

1.誘變劑的選擇對于低產(chǎn)或野生菌，uv線往往是首選，烷化劑等也是常用的誘變劑；對于經(jīng)多次誘變處理的菌株，常需要強(qiáng)輻射進(jìn)行處理。堿基置換易回復(fù)，染色體畸變、移碼等不易回復(fù)細(xì)胞的透性和生理狀態(tài)經(jīng)常變換誘變劑或復(fù)合處理（三）誘變處理1.誘變劑的選擇652.劑量選擇最適劑量因誘變劑的類型、出發(fā)菌株及其生理狀態(tài)的不同而不同。亞硝基胍在低死亡率劑量時突變率較高，而uv則在高致死率時才有較高的突變率。高產(chǎn)菌株在低劑量時效果較好，而對多核細(xì)胞處理劑量不宜過低。質(zhì)量性狀宜選用高劑量。經(jīng)多次誘變處理已鈍化的菌株可用一次高劑量處理來激活2.劑量選擇663處理方法單一誘變劑處理;復(fù)合處理乙烯亞胺與紫外線復(fù)合誘變處理結(jié)果

1-對照；2-乙烯亞胺（濃度1:7000）；3,5,7,9-紫外線；4,6,8,10-乙烯亞胺加紫外線

紫外線的劑量（erg/mm2）：3,4-2000；5,6-4000；7,8-6000；9,10-10000

3處理方法乙烯亞胺與紫外線復(fù)合誘變處理結(jié)果1-對照；67X-射線的照射劑量與亞熱帶鏈霉菌白霉素高產(chǎn)菌株39#變異的關(guān)系

形態(tài)突變型

負(fù)突變型

正突變型

X-射線的照射劑量與亞熱帶鏈霉菌白霉素高產(chǎn)菌株39#變異的關(guān)68紫外線照射劑量與龜裂鏈霉菌土霉素高產(chǎn)菌株293#變異的關(guān)系

紫外線照射劑量與龜裂鏈霉菌土霉素高產(chǎn)菌株293#變異的關(guān)系69（四）后培養(yǎng)目的使突變基因純合并表達(dá)，消除表型延遲。

后培養(yǎng)培養(yǎng)基：營養(yǎng)要求豐富，酪素水解液(或蛋白胨)可提供大量氨基酸，酵母膏可提供各種生長因子。（四）后培養(yǎng)目的使突變基因純合并表達(dá)，消除表型延遲。70（五）變異菌株的分離及篩選

篩選：包括初篩，復(fù)篩和終篩等。明確篩選目標(biāo)：產(chǎn)量突變還是其它突變型；產(chǎn)量準(zhǔn)備提高多少等；一次誘變目標(biāo)不要太高制定篩選方案：篩選準(zhǔn)備分幾步；篩選采用的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件；每一步準(zhǔn)備篩選多少菌株；每一步準(zhǔn)備采用的分析方法等。（五）變異菌株的分離及篩選篩選：包括初篩，復(fù)篩和終篩等。71誘變育種工作中應(yīng)注意的問題安全問題：各種誘變劑幾乎都有致癌作用，因此在操作中應(yīng)時刻注意安全問題：個人安全和環(huán)境安全。個人安全：操作時注意防護(hù)，不同誘變劑要求不同防護(hù)方法，如γ-射線輻射防護(hù)要求較高，uv要求較低，而化學(xué)誘變劑則要求不與身體有關(guān)部位直接接觸；環(huán)境安全：所用物品要經(jīng)解毒處理；液體經(jīng)解毒或充分稀釋才可以排放。要養(yǎng)成良好的工作習(xí)慣：如仔細(xì)觀察細(xì)微的形態(tài)變化、要詳實記錄菌株的誘變史和誘變譜系。誘變育種技術(shù)要和其他育種手段相結(jié)合。誘變育種由于其篩選的盲目性，突變的不定向性，工作量十分大，因此要對整個工作進(jìn)行合理的設(shè)計并結(jié)合新技術(shù)提高其工作效率。誘變育種工作中應(yīng)注意的問題安全問題：各種誘變劑幾乎都有致癌作72二

、營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）突變株：是指喪失了合成一種或多種必需生長因子能力的菌株，它們只能在補(bǔ)充了相應(yīng)的生長因子的培養(yǎng)基上才能正常生長。二

、營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）73營養(yǎng)缺陷型突變株的用途

科研上：研究代謝途徑；基因重組的遺傳標(biāo)記菌種；AA、堿基、維生素生物測定的試驗菌種生產(chǎn)上：發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸，核苷酸的生產(chǎn)菌種；生產(chǎn)菌株雜交育種的親本進(jìn)行遺傳標(biāo)記營養(yǎng)缺陷型突變株的用途科研上：74完全培養(yǎng)基CompleteMedium（CM）含有滿足某微生物的所有營養(yǎng)缺陷型和野生型菌株生長所需營養(yǎng)物質(zhì)的天然或半合成培養(yǎng)基。基本培養(yǎng)基MinimalMedium（MM）：不含生長因子僅能滿足某微生物的野生型菌株生長需要的最低成分合成培養(yǎng)基。補(bǔ)充培養(yǎng)基SupplementedMedium(SM)：補(bǔ)充了一種或數(shù)種生長因子，以滿足某微生物的特定的營養(yǎng)缺陷型生長的培養(yǎng)基，其中的生長因子多是通過直接添加AA、堿基或維生素而提供。完全培養(yǎng)基CompleteMedium（CM）75(一)篩選方法

后培養(yǎng)淘汰野生型檢出缺陷型鑒定缺陷型(一)篩選方法后培養(yǎng)761、淘汰野生型原理：限制營養(yǎng)成分使缺陷型細(xì)胞生長受抑制，野生型細(xì)胞在生長過程中被殺死或生長后被除去方法：抗生素法：菌絲過濾法：適用于絲狀真菌差別殺菌：

1、淘汰野生型原理：限制營養(yǎng)成分使缺陷型細(xì)胞生長受抑制，野生77抗生素淘汰野生型饑餓培養(yǎng)：培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)離心、洗滌后，懸浮于無氮基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2小時，耗盡細(xì)胞內(nèi)氮源，防止加抗生素后的“誤殺”；加抗生素處理：加入等體積的2N基本培養(yǎng)基（兩倍濃度氮源的基本培養(yǎng)基），同時加入抗生素，培養(yǎng)一定時間，野生型細(xì)胞由于生長而被殺死，缺陷型細(xì)胞處于休止?fàn)顟B(tài)而得以保留。制霉菌素可用于處理酵母菌和霉菌。注意：培養(yǎng)基應(yīng)添加滲透壓穩(wěn)定劑而制成高滲培養(yǎng)基，可避免由于細(xì)胞破裂而給缺陷型提供營養(yǎng)物質(zhì)。抗生素淘汰野生型饑餓培養(yǎng)：培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)離心、洗滌后，懸浮于無氮782、檢出缺陷型1）限量補(bǔ)充法2）夾層培養(yǎng)法3）逐個檢出法4）影印培養(yǎng)法2、檢出缺陷型1）限量補(bǔ)充法793、鑒定缺陷型----生長譜法大類的鑒定：營養(yǎng)因子：A、酪素水解液（AA混合物）B、水溶性維生素混合液C、酵母核酸水解液（堿基）D、酵母膏水溶液制備平板：缺陷型菌經(jīng)CM液體培養(yǎng)后，離心洗滌，制成107~108個/ml菌懸液。取0.1ml涂布至MM平板上ABCD3、鑒定缺陷型----生長譜法ABCD80方法：分別用無菌小濾片沾取少許各種營養(yǎng)因子后，放入接種的MM上，適宜溫度下培養(yǎng)判斷：A、D生長，AA缺陷型B、D生長，維生素缺陷型C、D生長，堿基缺陷型A~B、D生長，AA、維生素雙缺A~C、D生長，AA、堿基雙缺B~C、D生長，維生素、堿基雙缺方法：分別用無菌小濾片沾取少許各種營養(yǎng)因子后，放入接種的MM81組生長因子甲123456乙27891011丙3812131415丁4913161718戊51014171920己61115182021詳細(xì)鑒定生長因子組合法組生長因子甲123456乙27891011丙3812131482營養(yǎng)缺陷型的生長譜鑒定營養(yǎng)缺陷型的生長譜鑒定83天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸半醛HseMetThrIle二氨基庚二酸LysAKase鈍齒棒桿菌L-賴氨酸生物合成途徑及調(diào)節(jié)天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸半醛HseMetThrIle二氨84不同類型突變株積累L-賴氨酸的水平突變菌株突變型產(chǎn)量(mg/ml)鈍齒棒桿菌Hse-17.93鈍齒棒桿菌Thr

-2.33鈍齒棒桿菌Thr

-+Met

-2.00鈍齒棒桿菌AECr20.0AECr,Hse-50.0北京棒桿菌Hse-36.6Hse-,AECr45.0不同類型突變株積累L-賴氨酸的水平突變菌株突變型產(chǎn)量(mg/85三、其它類型突變型的篩選（一）抗代謝類似物突變型的篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變株：是指一種對反饋抑制不敏感或?qū)ψ瓒粲锌剐缘慕M成型突變株，或兼而有之的突變株。代謝類似物：結(jié)構(gòu)與代謝物類似，因此可起到代謝物所具有的調(diào)節(jié)作用的一類化合物。三、其它類型突變型的篩選（一）抗代謝類似物突變型的篩選861、抗反饋抑制突變發(fā)生基因突變的細(xì)胞：酶的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變導(dǎo)致調(diào)節(jié)酶的調(diào)節(jié)部位發(fā)生改變，不再與結(jié)構(gòu)類似物（或產(chǎn)物）結(jié)合，從而解除了產(chǎn)物的反饋抑制作用，使產(chǎn)物得以合成。1、抗反饋抑制突變87突變前突變后抗反饋抑制突變的機(jī)制突變前882、抗反饋阻遏突變型由于調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，使產(chǎn)生的阻遏蛋白不再能和輔阻遏物結(jié)合，或由于操縱基因發(fā)生突變，被激活的阻遏蛋白不能作用于已突變的操縱基因，從而解除產(chǎn)物的阻遏作用，使產(chǎn)物得以過量積累。2、抗反饋阻遏突變型89抗反饋阻遏突變的機(jī)制抗反饋阻遏突變的機(jī)制903、篩選方法（1）將經(jīng)過誘變的細(xì)胞直接涂布在含有一定濃度結(jié)構(gòu)類似物的基本培養(yǎng)基平板上，長出的菌落即為抗結(jié)構(gòu)類似物突變株；（2）將經(jīng)過誘變的細(xì)胞涂布在基本培養(yǎng)基平板上，在平板的中央加少量結(jié)構(gòu)類似物，在抑菌圈內(nèi)長出的個別菌落即為抗結(jié)構(gòu)類似物突變株；3、篩選方法91注意：如果是協(xié)同反饋抑制，則要在基本培養(yǎng)基中添加起協(xié)同反饋抑制作用的產(chǎn)物抗結(jié)構(gòu)類似物突變是數(shù)量性狀，可通過逐漸提高結(jié)構(gòu)類似物的濃度使產(chǎn)物的積累水平逐漸提高注意：92結(jié)構(gòu)類似物和代謝終產(chǎn)物終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物過量積累產(chǎn)物精氨酸D-精氨酸精氨酸苯丙氨酸對氟苯丙氨酸,噻吩丙氨酸苯丙氨酸賴氨酸AEC賴氨酸酪氨酸對氟苯丙氨酸,D-酪氨酸酪氨酸色氨酸5-堿基色氨酸,6-甲基色氨酸色氨酸脯氨酸3,4-二氫脯氨酸,磺胺胍脯氨酸腺苷酸2-氟腺嘌呤腺苷酸葡萄糖2-脫氧葡萄糖b-葡萄糖苷酶蔗糖,麥芽糖2-脫氧棉子糖蔗糖酶纖維二糖,葡萄糖甘油纖維素酶結(jié)構(gòu)類似物和代謝終產(chǎn)物終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物過量積累產(chǎn)物精氨酸D-93（二）組成型酶突變株的篩選1、誘導(dǎo)型酶在生產(chǎn)上的缺點誘導(dǎo)物往往價格昂貴受誘導(dǎo)物種類，濃度及分解產(chǎn)物的影響2、篩選原理

通過誘變處理，使調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，不產(chǎn)生有活性的阻遏蛋白，或者操縱基因發(fā)生突變不再能與阻遏物相結(jié)合，從而使誘導(dǎo)型酶變?yōu)榻M成型酶。（二）組成型酶突變株的篩選943、篩選方法

創(chuàng)造一種有利于組成型菌株生長而不利于誘導(dǎo)型菌株生長的培養(yǎng)條件，造成對組成型的選擇優(yōu)勢或者適當(dāng)?shù)淖R別兩類菌落的方法，從而把組成型突變株選擇出來。恒化器法

以誘導(dǎo)物作底物，濃度低于起誘導(dǎo)作用濃度，誘導(dǎo)型菌株生長極弱，而變異株由于能產(chǎn)分解底物的酶，則能分解底物而得以生長，通過連續(xù)不斷加入新鮮基質(zhì)，使變異株數(shù)量逐漸增多，最后達(dá)到能分離的濃度。3、篩選方法95循環(huán)培養(yǎng)法不含誘導(dǎo)物培養(yǎng)基?含誘導(dǎo)物培養(yǎng)基(普通碳源或氮源）（誘導(dǎo)物作唯一碳源或氮源）兩菌都能生長，但組成型變異株已能合成特定的酶，親株不能變異株調(diào)整期短，親株調(diào)整期長，短時間培養(yǎng)后，變異株所占比例增大

反復(fù)循環(huán)培養(yǎng)幾次后，變異株所占比例逐漸提高，然后進(jìn)行分離循環(huán)培養(yǎng)法兩菌都能生長，但組成型變異株已能合成特定的酶，親96（三）細(xì)胞膜透性突變型

1、提高細(xì)胞膜透性的優(yōu)點使胞內(nèi)產(chǎn)物濃度維持較低的水平，有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行，提高產(chǎn)物的生成量使胞內(nèi)產(chǎn)物濃度維持低于發(fā)生反饋抑制或阻遏的程度，以積累過量的產(chǎn)物2、提高細(xì)胞膜透性的措施（三）細(xì)胞膜透性突變型97第四節(jié)基因重組第四節(jié)基因重組98遺傳重組的一般概念遺傳重組（基因重組）：遺傳重組是指遺傳物質(zhì)從一個細(xì)胞向另一個細(xì)胞傳遞并導(dǎo)致DNA交換和重排的過程。遺傳改造的手段包括基因突變和基因重組微生物中基因重組的方式：

真核微生物：有性生殖和準(zhǔn)性生殖；原核微生物：接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)遺傳重組的一般概念遺傳重組（基因重組）：遺傳重組是指遺傳物質(zhì)99一、細(xì)菌的轉(zhuǎn)化定義：受體細(xì)胞直接吸收裸露的外源DNA并與其自身遺傳物質(zhì)發(fā)生重組，從而使受體細(xì)胞獲得共體細(xì)胞部分遺傳性狀的現(xiàn)象。1、轉(zhuǎn)化過程感受態(tài)受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子的吸附和吸收轉(zhuǎn)化因子的整合及轉(zhuǎn)化子的形成一、細(xì)菌的轉(zhuǎn)化定義：受體細(xì)胞直接吸收裸露的外源DNA并與其自100轉(zhuǎn)化過程轉(zhuǎn)化過程101轉(zhuǎn)化因子的整合轉(zhuǎn)化因子的整合102二、轉(zhuǎn)導(dǎo)Transduction

通過噬菌體作為媒介，而把一個細(xì)菌的基因?qū)肓硪粋€細(xì)菌的過程叫轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)導(dǎo)的組分：供體細(xì)菌，受體細(xì)菌，轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體二、轉(zhuǎn)導(dǎo)Transduction103（一）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)specializedtransduction

只能傳遞供體染色體上原噬菌體整合位點附近的少數(shù)固定基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)。1、轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成

Campbell模型（不正確切離）形成頻率：10-6

（一）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)specializedtransducti104江南大學(xué)微生物課件51052、轉(zhuǎn)導(dǎo)子的形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)子的獲得——雙交換不穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)子的獲得——溶原化

2、轉(zhuǎn)導(dǎo)子的形成106江南大學(xué)微生物課件5107江南大學(xué)微生物課件5108（二）普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)

generalizedtransduction能傳遞供體的任何基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)。1、轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成選擇性包裹模型形成頻率：10-6（二）普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)

generalizedtransduc109江南大學(xué)微生物課件51102、轉(zhuǎn)導(dǎo)子的形成完全轉(zhuǎn)導(dǎo)與完全轉(zhuǎn)導(dǎo)子Completetransduction通過雙交換而實現(xiàn)約占1/102、轉(zhuǎn)導(dǎo)子的形成111流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)與流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)子

Abortivetransduction進(jìn)入受體的供體DNA片段既不復(fù)制，也不整合，但能正常表達(dá)。流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)與流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)子

Abortivetransduc1123、共轉(zhuǎn)導(dǎo)cotransduction由一個轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體同時傳遞兩個供體基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)。共轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率3、共轉(zhuǎn)導(dǎo)cotransduction113普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)與局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)的區(qū)別普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)能轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因供體的任何基因特定基因,l:gal,bio噬菌體在供體菌中的位置無特定的位置有特定的位置gal-l-bio轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的獲得自發(fā)裂解或誘導(dǎo)裂解誘導(dǎo)裂解轉(zhuǎn)導(dǎo)子非溶源性1/10穩(wěn)定的完全轉(zhuǎn)導(dǎo)子9/10不穩(wěn)定流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)子缺陷溶源性1/3穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)子2/3不穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)子普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)與局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)的區(qū)別普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)能轉(zhuǎn)導(dǎo)的114三、細(xì)菌的接合供體細(xì)胞和受體細(xì)胞直接接觸后，質(zhì)粒從供體細(xì)胞向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程。Conjugationisthemechanismbywhichgeneticmaterialistransferredbetweentwocellsbyplasmids.三、細(xì)菌的接合供體細(xì)胞和受體細(xì)胞直接接觸后，質(zhì)粒從供體細(xì)胞115江南大學(xué)微生物課件5116江南大學(xué)微生物課件51171、F-、F+、Hfr菌株F+菌株Hfr菌株F-菌株F+Hfr1、F-、F+、Hfr菌株F+Hfr1182、細(xì)菌接合作用（1）F+×F-結(jié)果：F-轉(zhuǎn)變?yōu)镕+2、細(xì)菌接合作用119（2）Hfr×F-

HfrDNA的轉(zhuǎn)移（2）Hfr×F-

HfrDNA的轉(zhuǎn)移120江南大學(xué)微生物課件5121形成部分雜合子形成部分雜合子122通過雙交換形成重組體形成lac+ade+重組體形成lac-ade+重組體通過雙交換形成重組體形成lac+ade+重組體形成lac-a123相同點

含有F因子，都具有性纖毛，都具有接合作用不同點Hfr細(xì)菌F+

對于吖啶橙處理穩(wěn)定F因子易失去傳遞供體染色體基因高頻(10-3~10-4)低頻(10-6~10-7)F因子本身轉(zhuǎn)移基本不能頻率70%以上F因子復(fù)制隨細(xì)菌染色體復(fù)制獨(dú)立復(fù)制F+與Hfr菌株的異同點相同點含有F因子，都具有性纖毛，都具有接合作用1243、F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)

F’因子：帶有細(xì)菌基因的F因子。例F-lac，F(xiàn)-gal，F(xiàn)-pro…F’因子的形成：Hfr菌株中F因子的異常切除（aberrantexcision)F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)（性因子轉(zhuǎn)導(dǎo)、性導(dǎo)）通過F’因子的轉(zhuǎn)移而使受體細(xì)菌改變其遺傳性狀的現(xiàn)象3、F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)

F’因子：帶有細(xì)菌基因的F因子。125江南大學(xué)微生物課件5126四、真菌的有性生殖Sexualreproduction一、真菌有性生殖過程二、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)的生活史四、真菌的有性生殖Sexualreproduction127江南大學(xué)微生物課件5128五、真菌的準(zhǔn)性生殖Parasexualreproduction能進(jìn)行準(zhǔn)性生殖的微生物：Aspergillusnidulans;Asp.niger;Asp.sojaePenicilliumchrysogenum;Fusariumoxysporum（一）準(zhǔn)性生殖的過程異核體形成；（雜合）二倍體形成；體細(xì)胞交換和單元化五、真菌的準(zhǔn)性生殖Parasexualreproduct1291、異核體的形成異核體細(xì)胞：并存有兩個不同遺傳性狀的核的細(xì)胞異核體菌絲體：由異核體細(xì)胞構(gòu)成的菌絲體異核體的無性繁殖：產(chǎn)生親代類型的單倍體分生孢子異核體的生物學(xué)意義：具有生長優(yōu)勢；可以儲備隱性突變1、異核體的形成1302、異核體的形成(1)選擇親本A.親緣關(guān)系近B.生活力、產(chǎn)生分生孢子的能力及數(shù)量相似C.帶不同的遺傳標(biāo)記(2)創(chuàng)造形成異核體的條件A.限制性培養(yǎng)基B.孢子混合數(shù)量：106~1082、異核體的形成131（二）雜合二倍體的形成1、形成：將106~107個異核體的分生孢子涂至MM上，長出的少數(shù)菌落即為二倍體2、檢出：避免異核體分生孢子重新形成異核體的措施MM要十分純正采用具有分生孢子顏色突變型和營養(yǎng)缺陷型作遺傳標(biāo)記（二）雜合二倍體的形成132（三）有絲分裂分離二倍體在有絲分裂過程中發(fā)生基因重組，使隱性基因得以表達(dá)，由此產(chǎn)生各種類型的分離子。1、體細(xì)胞交換與體細(xì)胞重組體（1）體細(xì)胞交換：在有絲分裂過程中同源染色體發(fā)生的交換。由此導(dǎo)致部分基因的純合化。（三）有絲分裂分離133江南大學(xué)微生物課件51342、單元化過程與非整倍體及單倍體分離子單元化過程：是在一系列有絲分裂過程中發(fā)生的染色體不離開行為的結(jié)果。

2、單元化過程與非整倍體及單倍體分離子135有性生殖與準(zhǔn)性生殖的區(qū)別有性生殖準(zhǔn)性生殖導(dǎo)致有性孢子的產(chǎn)生，其形態(tài)、生理均與營養(yǎng)體細(xì)胞不同，往往產(chǎn)生在特殊的囊器中導(dǎo)致重組體細(xì)胞產(chǎn)生，其和一般營養(yǎng)體細(xì)胞相同，不產(chǎn)生在特殊的囊器中減數(shù)分裂導(dǎo)致基因重組，減數(shù)分裂中染色體交換和減半是有規(guī)律的協(xié)調(diào)過程，是必然的有絲分裂導(dǎo)致基因重組，有絲分裂中，染色體交換和減少是不規(guī)則且不協(xié)調(diào)的過程，是偶然的有性生殖與準(zhǔn)性生殖的區(qū)別有性生殖準(zhǔn)性生殖導(dǎo)致有性孢子的產(chǎn)136六、原生質(zhì)體融合技術(shù)1、原生質(zhì)體融合育種的優(yōu)勢：基因重組頻率提高重組的親本范圍擴(kuò)大融合子集中兩親本優(yōu)良性狀的機(jī)會增大

六、原生質(zhì)體融合技術(shù)1、原生質(zhì)體融合育種的優(yōu)勢：137（一）原生質(zhì)體融合技術(shù)的一般步驟融合親本的選擇與標(biāo)記；原生質(zhì)體的制備；原生質(zhì)體的融合；原生質(zhì)體的再生；融合子的選擇與鑒定；目標(biāo)菌株的篩選。（一）原生質(zhì)體融合技術(shù)的一般步驟融合親本的選擇與標(biāo)記；138七、基因工程育種Geneticengineering重組DNA技術(shù)：recombinantDNAtechnology

基因工程是將不同生物的基因在體外人工剪切組合并和載體（質(zhì)粒、噬菌體、病毒）DNA連接，然后轉(zhuǎn)入微生物或細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行擴(kuò)增，并使轉(zhuǎn)入的基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生所需要的蛋白質(zhì)。七、基因工程育種Geneticengineering139目的基因(DNA)載體DNA重組DNA受體細(xì)胞具表達(dá)目的基因功能的重組菌DNA連接酶轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染篩選（利用遺傳標(biāo)記或分子生物學(xué)方法等）

基因工程操作的主要過程目的基因(DNA)載體DNA重組DNA受體細(xì)胞具表達(dá)目的基因140一、目的基因的獲得主要方法化學(xué)合成

PCR擴(kuò)增從DNA文庫中篩選一、目的基因的獲得1411、PCR體外擴(kuò)增目的基因PolymeraseChainReaction——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一種體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，用于擴(kuò)增位于兩端已知序列之間的DNA區(qū)段(靶序列）在DNA聚合酶催化下，通過兩條人工合成的單鏈引物的引導(dǎo)而擴(kuò)增模板DNA片段的方法1、PCR體外擴(kuò)增目的基因142(1)基本PCR組成：含目標(biāo)DNA序列的模板DNA(Template)寡核苷酸引物(Primers)：界定復(fù)制范圍兩端的引物DNA聚合酶：(Taq.Polymearse)DNA合成底物及水：dNTPs(1)基本PCR組成：143(2)PCR反應(yīng)——三個主要步驟變性(denaturation)：90℃以上退火(annealing)：50~65℃延伸(extension)：72℃20~30個循環(huán)(2)PCR反應(yīng)——三個主要步驟144江南大學(xué)微生物課件5145江南大學(xué)微生物課件51462.基因文庫法（1）從共體菌基因組DNA獲取目的基因DNA文庫：

生物染色體基因組各DNA片段的克隆總體。分離染色體DNA用限制性酶部分水解分離選出一定大小合適克隆的DNA片段2.基因文庫法147基因文庫構(gòu)建步驟提取DNA酶解電泳分離與載體連接導(dǎo)入宿主篩選陽性克隆基因文庫構(gòu)建步驟148二、優(yōu)良載體的選擇優(yōu)良載體應(yīng)具備的特點對E.coli受體細(xì)胞，載體有質(zhì)粒載體、λ噬菌體載體、柯斯質(zhì)粒載體三、目的基因與載體DNA的體外重組粘性末端連接平齊末端連接二、優(yōu)良載體的選擇149四.重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染體外包裝與感染電穿孔法electroporation四.重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞150五、重組受體細(xì)胞的篩選和鑒定遺傳學(xué)方法：檢測選擇性標(biāo)記免疫化學(xué)方法：檢測目的基因產(chǎn)物核酸雜交方法：檢測目的基因直接檢出法：檢測基因產(chǎn)物五、重組受體細(xì)胞的篩選和鑒定遺傳學(xué)方法：檢測選擇性標(biāo)記151外源基因插入tet鈍化tetr受體細(xì)胞是Amp、Tetd的敏感型在Amp+Tet培養(yǎng)基上生長的是野生型質(zhì)粒在Amp培養(yǎng)基上生長的帶有重組質(zhì)粒選擇性標(biāo)記篩選例一外源基因插入tet選擇性標(biāo)記篩選例一152例二、b-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑試驗）檢出攜帶外源DNA的載體

b-半乳糖苷酶以四聚體形式存在能將無色底物X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)切割成半乳糖和深藍(lán)色的5-bromo-4-chloroindigo，菌落呈藍(lán)色宿主lacZDM15基因合成的是缺失N-末端11~41氨基酸的缺陷型酶，無活性pUC18等質(zhì)粒具有l(wèi)acZ’基因，所編碼酶的N-末端片段與lacZDM15產(chǎn)物組成有活性的酶pUC18上在lacZ’中間具有MCS，外源DNA片段的插入，使lacZ’無完整產(chǎn)物，不能與lacZDM15產(chǎn)物組成有活性的酶，菌落呈無色例二、b-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑試驗）153八、基因定位誘變定位突變site-specificmutagensis

用合成的DNA和重組DNA技術(shù)在基因精確限定的殘基上引入突變。包括刪除、插入和置換特定的堿基序列。八、基因定位誘變定位突變site-specificm154第六節(jié)菌種退化、復(fù)壯與保藏

第六節(jié)菌種退化、復(fù)壯與保藏155一.菌種的退化菌種退化degeneration的表現(xiàn)

生產(chǎn)性狀的劣化,遺傳標(biāo)記的丟失,原有的典型性狀的不典型等菌落及細(xì)胞形態(tài)的改變生長速度緩慢代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力下降，即負(fù)突變致病菌對宿主侵染力下降抗不良環(huán)境條件（抗噬菌體，抗低溫）能力減弱一.菌種的退化菌種退化degeneration的表現(xiàn)1562.菌種退化的原因：基因自發(fā)突變退化是發(fā)生在群體細(xì)胞中的一個從量變到質(zhì)變的逐步演變過程。自發(fā)突變率10-8~10-9

加速退化的因素傳代次數(shù)過多不適宜的培養(yǎng)條件2.菌種退化的原因：基因自發(fā)突變1573.防止退化的措施控制傳代次數(shù)創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件利用不易衰退的細(xì)胞傳代采用有效的菌種保藏方法

3.防止退化的措施158二.菌種的復(fù)壯rejuvenation

狹義復(fù)壯

在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和測定典型性狀、生產(chǎn)性能等指標(biāo)，從已衰退的群體中篩選出少數(shù)尚未退化的個體，以達(dá)到恢復(fù)原菌株固有性狀的相應(yīng)措施；廣義復(fù)壯

在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有意識地采取純種分離和生產(chǎn)性狀的測定工作，以期從中選擇到自發(fā)的正突變個體。也稱生產(chǎn)育種二.菌種的復(fù)壯rejuvenation狹義復(fù)壯廣義復(fù)壯159三.菌種的保藏（一）目的

使微生物菌種保持原來的性狀和活力不退化、不死亡、不被污染，便于研究、交換和使用。（二）原理

挑選典型培養(yǎng)物（typicalculture）的優(yōu)良純種，并創(chuàng)造最有利于休眠的環(huán)境條件，使微生物處于代謝不活潑、生長受抑制的休眠狀態(tài)。三.菌種的保藏（一）目的160（二）常用的菌種保藏方法1、斜面保藏法方法：接種適宜斜面培養(yǎng)基→培養(yǎng)→4℃保藏措施：低溫：4℃適用：各大類保藏期：1~6個月用橡皮塞代替棉塞，可適當(dāng)延長保藏時間2、石蠟油封藏法方法：斜面或半固體接種→培養(yǎng)→加無菌液蠟高出培養(yǎng)基1cm→4~15℃保藏措施：低溫，隔氧適用：不能利用石油的各大類保藏期：1~2年優(yōu)點：簡便（二）常用的菌種保藏方法1613、砂土管保藏法

方法：孢子或芽孢懸液→加入無菌砂土管中→干燥→封口→保藏措施：無營養(yǎng)，缺氧，干燥適用：產(chǎn)孢子（芽孢）微生物保藏期：1~10年4、冷凍干燥保藏

方法：菌種培養(yǎng)→用保護(hù)劑懸浮→加入安醅管中→低溫凍結(jié)（-25—-40℃）→抽真空（至0.01mmHg）→真空封口→檢查真空度→保藏措施：低溫、干燥，缺氧，有保護(hù)劑適用：各大類保藏期：5~15年或更長3、砂土管保藏法1625、甘油懸液低溫冷凍保藏法

方法：菌種培養(yǎng)→15~30%甘油緩沖液懸浮→加入保藏管中→置-70℃冰箱保藏措施：低溫（-70℃）、保護(hù)劑（15~50%甘油）適用：細(xì)菌、酵母菌保藏期：約10年6、液氮保藏法方法：菌種培養(yǎng)→保護(hù)劑懸浮→加入保藏管中→置液氮瓶中措施：超低溫（-196℃）、保護(hù)劑適用：各大類保藏期：>15年

5、甘油懸液低溫冷凍保藏法163第六章

微生物菌種的選育江南大學(xué)生物工程學(xué)院第六章

微生物菌種的選育江南大學(xué)生物工程學(xué)院164第一節(jié)從自然界中分離篩選菌種第一節(jié)從自然界中分離篩選菌種1651、生產(chǎn)菌株來源

索取或購買自己選育用原有菌株進(jìn)行遺傳改造進(jìn)行育種向菌種保藏機(jī)構(gòu)索取、購買出發(fā)菌株進(jìn)行選從自然界中分離菌種

從自然界中分離菌種就是從自然界微生物資源中有目的、快速、準(zhǔn)確地選出所需要的菌種。1、生產(chǎn)菌株來源166

設(shè)計方案→采樣→增殖培養(yǎng)*→平板分離→篩選(初篩、復(fù)篩)→單株純種分離→性能考察(生產(chǎn)性能試驗、毒性試驗、菌種鑒定）從自然界中分離篩選菌種的一般步驟設(shè)計方案→采樣→增殖培養(yǎng)*→平板分離→篩選(初篩、復(fù)167一、采樣從自然界種采集含目的菌的樣品1. 環(huán)境條件對土樣本中微生物分布的影響營養(yǎng)環(huán)境水分溫度通風(fēng)酸堿度

一、采樣1682 .采樣方法（1） 去除表層土（2） 取5-15cm土樣幾十克，裝入無菌牛皮低袋或逆料袋中3. 注意記錄：時間，地點，環(huán)境情況等樣品袋應(yīng)封好口，防止水分失去土樣應(yīng)在分離前破碎盡快分離2 .采樣方法169二.增殖培養(yǎng)（富集培養(yǎng)）適用：樣品中目的菌數(shù)量不夠多時目的：提高樣品中目的菌的數(shù)量和比例原理：通過控制營養(yǎng)成分或培養(yǎng)條件，使目的菌得以繁殖和/或非目的菌的生長受到抑制二.增殖培養(yǎng)（富集培養(yǎng)）適用：樣品中目的菌數(shù)量不夠多時1701、增殖培養(yǎng)的方法

控制營養(yǎng)成分控制培養(yǎng)基pH控制培養(yǎng)溫度

熱處理——增殖芽孢細(xì)菌添加抑制劑

1、增殖培養(yǎng)的方法171三.純種分離目的：將目的菌從混雜的微生物中分離出來，獲得純培養(yǎng)1.純種分離的一般方法（1）稀釋平板法傾注平板或涂布平板（2）劃線法（3）組織分離法*

適用于分離高等真菌及植物病原菌三.純種分離目的：將目的菌從混雜的微生物中分離出來，獲得純172稀釋分離涂布平板稀釋分離涂布平板173稀釋分離傾注平板稀釋分離傾注平板1742、平皿反應(yīng)快速檢出法——定性或半定量

紙片培養(yǎng)顯色法透明圈法變色圈法生長圈法抑制圈

2、平皿反應(yīng)快速檢出法——定性或半定量175瓊脂塊培養(yǎng)法篩選抗生素產(chǎn)生菌程序瓊脂塊培養(yǎng)法篩選抗生素產(chǎn)生菌程序1763、厭氧性微生物的分離法（1）去除培養(yǎng)基中的溶解氧，降低Eh（2）創(chuàng)造無氧環(huán)境物理除氧空氣置換法：干燥器或厭氧培養(yǎng)罐化學(xué)除氧H2+O2→H2O(鈀作催化劑）GASPAK罐除氧：硼氫化鈉、檸檬酸，碳酸氫鈉化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生H2和CO2，H2與O2反應(yīng)生成水（3）厭氧分離（培養(yǎng)）技術(shù)高層瓊脂柱技術(shù)厭氧罐技術(shù)厭氧手套箱技術(shù)3、厭氧性微生物的分離法177GasPakGasPak178厭氧手套箱厭氧培養(yǎng)裝置厭氧手套箱厭氧培養(yǎng)裝置179四

、篩選初篩、復(fù)篩：

四、篩選180好氧培養(yǎng)好氧培養(yǎng)181五、培養(yǎng)工藝條件試驗與生產(chǎn)試驗1、搖瓶發(fā)酵條件

培養(yǎng)基組成、初始pH、通風(fēng)量（裝液量）、接種量、培養(yǎng)溫度…2、小型臺式發(fā)酵罐發(fā)酵工藝條件

溶解氧控制，pH值控制，原料添加模式，消泡劑…五、培養(yǎng)工藝條件試驗與生產(chǎn)試驗182第二節(jié)基因突變第二節(jié)基因突變183

突變（Mutation）定義：遺傳物質(zhì)核酸（DNA或病毒中的RNA）的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生了可遺傳的變化。突變是一種遺傳的狀態(tài)，是基因由于結(jié)構(gòu)發(fā)生改變從而由原來的存在狀態(tài)變?yōu)榱硪环N存在狀態(tài)，即它的等位基因。突變體：帶有突變基因的細(xì)胞或個體突變型：突變體的基因型或表型稱為突變型，和其相對的原存在狀態(tài)稱為野生型。184突變（Mutation）定義：遺傳物質(zhì)核酸（D一、突變類型按變化范圍分突變類型(一)染色體畸變（chromosomeaberration)染色體數(shù)目的變化或染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生較大片段的異常改變。

1、染色體數(shù)目的變化整倍體(euploidy)：含有完整的染色體組單倍體：haploid二倍體：diploid三倍體：triploid四倍體：tetraploid一、突變類型按變化范圍分突變類型185非整倍體aneuploidy：含有不完整狀態(tài)的染色體組，一般是指二倍體中成對染色體成員的增加或減少。單體（二倍減一，monosomicdiploid):2n-1缺體（二倍減二，nullisomicdilpoid):2n-2三體（二倍加一，trisomicdiploid):2n+1四體（二倍加二，tetrasomicdiploid):2n+2雙二倍加一（doubletrisomic）:2n+1+1部分二倍體（merodiploid）：細(xì)菌等原核生物中由一整條染色體和外來的一個染色體片段所構(gòu)成的不完整二倍體。非整倍體aneuploidy：含有不完整狀態(tài)的染色體組，一1862、染色體結(jié)構(gòu)的變化缺失deletion：重復(fù)duplication：倒位inversion：易位translocation：2、染色體結(jié)構(gòu)的變化缺失deletion：187bfbf188(二)基因突變（genemutation）

----染色體局部座位內(nèi)的變化

點突變：只涉及DNA分子中一對或少數(shù)幾對堿基的改變。突變發(fā)生在一個基因范圍內(nèi)。多位點突變：突變超出一個基因范圍。1、堿基置換basereplacementDNA鏈上的某一堿基對為另一堿基對所取代。轉(zhuǎn)換transition：顛換transversion：(二)基因突變（genemutation）

189江南大學(xué)微生物課件5190(3)遺傳學(xué)效應(yīng)錯義突變missensemutation：同義突變silentmutation：無義突變nonsensemutation：(3)遺傳學(xué)效應(yīng)1912、移碼突變

frameshiftmutation：由于一對或少數(shù)幾對（不是三的倍數(shù)）核苷酸的插入或缺失而造成此后一系列遺傳密碼子的閱讀框發(fā)生移位錯誤的突變。2、移碼突變frameshiftmutation：由于192

PheAspGluProLeuCysThr5’-TTCGATGAGCCCTTGTGCACG-3’↓G→AmutationPheAspLysProLeuCysThr5’-TTCGATAAGCCCTTGTGCACG-3’↓C→TmutationPheAspLysProLeuCysThr5’-TTCGATAAGCCTTTGTGCACG-3’↓C→AmutationPheAspLysProLeuStopThr5’-TTCGATAAGCCCTTGTGAACG-3’PheAspGluProL193

PheAspGluProLeuCysThr5’-TTCGATGAGCCCTTGTGCACG-3’↓InsertionofAPheAspLysThrLeuValHis5’-TTCGATAAGACCCTTGTGCACG-3’

PheAspGluProL194二、按表型效應(yīng)分突變類型野生型wildtype：表現(xiàn)該物種正常表型的生物。突變型mutant：由于突變導(dǎo)致其正常的表型發(fā)生了改變的生物。形態(tài)突變型生化突變型營養(yǎng)缺陷型auxotrophicmutant

抗性突變型resistantmutant3.致死突變型4.條件致死突變型5.調(diào)節(jié)突變型二、按表型效應(yīng)分突變類型野生型wildtype：表現(xiàn)該物195三、基因突變的規(guī)律不對應(yīng)性或自發(fā)性、

隨機(jī)性、稀有性、獨(dú)立性、穩(wěn)定性、可逆性、誘變性、三、基因突變的規(guī)律不對應(yīng)性或自發(fā)性、1961、自發(fā)突變的證實隨機(jī)性、不對應(yīng)性

1）波動實驗2）涂布實驗3）影印培養(yǎng)實驗1、自發(fā)突變的證實隨機(jī)性、不對應(yīng)性

1）波動實驗197波動實驗波動實驗198E.coliB抗噬菌體a的波動測驗結(jié)果培養(yǎng)皿編號培養(yǎng)皿上菌落數(shù)樣品來自同一培養(yǎng)物樣品來自不同培養(yǎng)物11446411021556200031352230042148107051565500861444253031726494000816512501920564030101347764815111071012040130191400151016017170111864019002035平均值16.751.43.311.35303.8方差15273.8694662040.8E.coliB抗噬菌體a的波動測驗結(jié)果培養(yǎng)皿編號培養(yǎng)皿上199四、突變的頻率：突變率（mutationrate）：每個細(xì)胞每一世代中發(fā)生突變的概率。世代總數(shù)=N2-N1突變率的測定：固體平板法測突變率：m=(M2-M1)/(N2-N1)液體培養(yǎng)法測突變率：m=2(M2/N2-M1/N1)/(g2-g1)液體稀釋法測突變率：P0=e-mN細(xì)胞分裂非同步性效正：突變率=ln2m=0.69m四、突變的頻率：200五、自發(fā)突變的機(jī)制環(huán)境因素的影響微生物自身產(chǎn)生的代謝物的影響轉(zhuǎn)座子所造成的插入突變DNA復(fù)制過程中偶爾發(fā)生錯誤五、自發(fā)突變的機(jī)制環(huán)境因素的影響201六、誘變劑及其誘變機(jī)制誘變是指通過人為的方法，利用物理、化學(xué)因素處理微生物而引起的突變。六、誘變劑及其誘變機(jī)制誘變是指通過人為的方法，利用物202(一)物理誘變劑1）輻射：uv，x-射線γ-射線等效應(yīng)：點突變或染色體畸變機(jī)制：直接作用和間接作用間接作用：輻射作用于染色體外物質(zhì)，產(chǎn)生具有誘變作用的物質(zhì)；直接作用：輻射直接作用于染色體，2）熱：機(jī)理復(fù)雜離子束:能量傳遞、動量交換，離子沉積與電荷積累過程(一)物理誘變劑1）輻射：uv，x-射線γ-射線等2031、紫外線UV有效波長2650?，紫外燈波長2537?作用機(jī)理嘧啶二聚體、嘧啶水合物、交聯(lián)作用、DNA鏈斷裂效應(yīng)：移碼突變，堿基置換1、紫外線UV有效波長2650?，紫外燈波長2537204

紫外線誘發(fā)胸苷二聚體紫外線誘發(fā)胸苷二聚體2052、電離輻射：x-射線，g-射線作用機(jī)理直接作用：打斷化學(xué)鍵間接作用：通過自由基打斷化學(xué)鍵效應(yīng)：染色體畸變，堿基置換，移碼突變3、熱作用機(jī)理：脫嘌呤效應(yīng)：堿基置換，移碼突變4、離子束2、電離輻射：x-射線，g-射線206(二)化學(xué)誘變劑堿基類似物：是指其分子結(jié)構(gòu)同DNA分子中的堿基非常類似，因此能取代堿基參入到DNA分子中的一類化合物。主要誘變劑：5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤；可誘發(fā)ATGC的轉(zhuǎn)換。(二)化學(xué)誘變劑堿基類似物：是指其分子結(jié)構(gòu)同DNA分子中的207堿基類似物baseanalog5-溴尿嘧啶(5-BU，BU),5-氟尿嘧啶(5-FU，F(xiàn)U),5-氨基尿嘧啶(5-AU，AU),2-氨基嘌呤(2-AP，AP)8-氮鳥嘌呤（8-NG，NG）例：BU烯醇式：BUe，高頻出現(xiàn)，BUe≡G酮式：BUk，低頻出現(xiàn)，BUk=A堿基類似物baseanalog2085-BU摻入后的摻入錯誤G≡CG≡BUeG≡CG≡BUeG≡CA=TA=BUkA:TA:BUkA:TG≡BUeA:TG≡CG≡BUeG≡C→A=T5-BU復(fù)制錯誤A:T→G≡C5-BU摻入后的摻入錯誤G≡CG≡BUeG≡2092.移碼誘變劑嵌入DNA分子相鄰堿基對之間，從而有利于核苷酸的環(huán)出，因此可提高移碼突變的突變率。主要誘變劑：吖啶類化合物；溴化乙錠(ethidiumbromide)，ICR系列化合物等2.移碼誘變劑嵌入DNA分子相鄰堿基對之間，從而有利于核210部分移碼誘變劑

部分移碼誘變劑211DNA

插入劑DNA

插入劑2123.化學(xué)修飾堿基的誘變劑1）烷化劑：使DNA分子的堿基發(fā)生烷化反應(yīng)，從而更容易發(fā)生錯配，是最常用的一類誘變劑。常用的有：硫酸二乙酯(DES)，甲基磺酸乙酯(EMS)，亞硝基乙基尿(NEU),亞硝基胍(NTG),乙烯亞胺(EI)等。NTG（亞硝基胍）誘變作用特強(qiáng)，作用于復(fù)制叉，可誘發(fā)多基因并發(fā)突變，被稱為超誘變劑。3.化學(xué)修飾堿基的誘變劑1）烷化劑：使DNA分子的堿基發(fā)生烷213ChemicalreactivityofbasesisresponsibleforsomeDNAlesionChemicalreactivityofbasesi214Alkylatedbases部分烷化劑和烷化堿基alkylatingagentsAlkylatedbases部分烷化劑和烷化堿基alkyl215DNA的脫嘌呤

DNA的脫嘌呤216烷化鳥嘌呤的堿基配對

烷化鳥嘌呤的堿基配對217烷化鳥嘌呤的交聯(lián)作用

烷化鳥嘌呤的交聯(lián)作用218如甲基黃酸乙脂（EMS）使G的第6位烷化，使T的第4位上烷化，結(jié)果產(chǎn)生的O-6-E-G和O-4-E-T分別和T、G配對，導(dǎo)致G∶C對轉(zhuǎn)換成A∶T對；T∶A對轉(zhuǎn)換成C∶G如甲基黃酸乙脂（EMS）2192)

亞硝酸（introusacid,NA）有氧化脫氨作用，可使G第2個碳原子上的氨脫去，產(chǎn)生黃嘌呤（xanthine,x），次黃嘌呤(H)仍和C配對，故不產(chǎn)生轉(zhuǎn)換突變。但C和A脫氨后分別產(chǎn)生U和次黃嘌呤H，產(chǎn)生了轉(zhuǎn)換，使C∶G轉(zhuǎn)換成A∶T，A∶T轉(zhuǎn)換成G∶C2)亞硝酸（introusacid,NA）有氧化脫氨作2203)羥胺（NH2OH）只特異地和胞嘧啶起反應(yīng)，在第4個C原子上加-OH，產(chǎn)生4-OH-C，此產(chǎn)物可以和A配對，使C∶G轉(zhuǎn)換成T∶A作用：與C反應(yīng)，造成GC→AT轉(zhuǎn)換3)羥胺（NH2OH）只特異地和胞嘧啶起反應(yīng)，在第4個C原221七、DNA損傷的修復(fù)1、光復(fù)活作用photoreactivation

七、DNA損傷的修復(fù)1、光復(fù)活作用photoreactiv2222、切補(bǔ)修復(fù)excisionrepair（暗復(fù)活）2、切補(bǔ)修復(fù)excisionrepair（暗復(fù)活）223第三節(jié)

誘變育種第三節(jié)

誘變育種224一、誘變育種的一般步驟出發(fā)菌株↓純化、活化、同步培養(yǎng)培養(yǎng)液↓離心收集細(xì)胞、洗滌，制備均一的菌懸液（玻璃株打散、過濾）單細(xì)胞或單孢子懸液↓活菌計數(shù)，誘變預(yù)備試驗誘變處理↓活細(xì)胞計數(shù)，致死率計算中間培養(yǎng)(后培養(yǎng))↓平板分離↓變異率計算初篩→復(fù)篩→保藏及擴(kuò)大試驗一、誘變育種的一般步驟出發(fā)菌株225（一） 出發(fā)菌株的選擇1. 出發(fā)菌株的類型2. 對誘變劑的敏感性具有特定生產(chǎn)性狀的可能性：要盡量選擇單倍體，單核細(xì)胞（孢子)（一） 出發(fā)菌株的選擇1. 出發(fā)菌株的類型226（二）菌懸液的制備

細(xì)胞的生長狀態(tài)2.菌懸液的均一性：3.菌懸液細(xì)胞濃度酵母、霉菌孢子：106~107個/ml細(xì)菌、放線菌孢子：108個/ml4.菌懸液介質(zhì)：（二）菌懸液的制備細(xì)胞的生長狀態(tài)227（三）誘變處理

1.誘變劑的選擇對于低產(chǎn)或野生菌，uv線往往是首選，烷化劑等也是常用的誘變劑