電話：400-998-2324郵箱：service_uplc_ms@163.com網(wǎng)址：本產(chǎn)品僅供科學(xué)研究使用！請(qǐng)勿用于臨床、診斷、食品、化妝品檢測(cè)等用途！-上海液質(zhì)檢測(cè)技術(shù)有限公司第第頁(yè)輔酶ⅠNAD(H)含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書(shū)操作。貨號(hào):UPLC-MS-4338規(guī)格:50T/24S

可見(jiàn)分光光度法產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系工作人員。試劑名稱規(guī)格保存條件酸性提取液液體15mL×1瓶4℃保存堿性提取液液體15mL×1瓶4℃保存試劑一液體20mL×1瓶4℃保存試劑二液體6mL×1瓶4℃保存試劑三液體16mL×1瓶4℃保存試劑四液體3mL×1瓶-20℃保存試劑五液體40mL×1瓶4℃保存試劑六液體75mL×1瓶（自備）常溫保存NAD標(biāo)準(zhǔn)品粉劑×1支-20℃保存NADH標(biāo)準(zhǔn)品粉劑×1支-20℃保存溶液的配制：1、試劑三：需要嚴(yán)格避光；2、試劑六：72mL乙醇和3mL蒸餾水混合，備用；3NAD1.5mL21.25nmol/mLNAD4、NADH1.4mL2μmol/mL1.25nmol/mLNADH標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。產(chǎn)品說(shuō)明：II又稱煙酰胺腺嘌呤二核ND（IH則會(huì)作為氫的載體，在呼吸鏈中通過(guò)化學(xué)滲透偶聯(lián)的方式，合成ATP。NAD(H)在機(jī)體內(nèi)有重要的生理意義，與物質(zhì)代謝、能量代謝、抗細(xì)胞衰老、抗氧I含量降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷或衰亡。分別用酸性和堿性提取液提取樣品中A+和AH通過(guò)MS（）570nmNAD+NADHMTT還原法檢測(cè)。注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。需自備的儀器和用品：可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。操作步驟：一、NAD+和NADH的提?。蛇m當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）1、血清（漿）中NAD+和NADH的提?。篘AD+0.1mL血清（漿），0.5mL5min(蓋緊，以防止水分散失)，冰浴冷卻后，10000g4℃10min200μL，加入等體積堿性提取液；混勻，10000g4℃10min冰上保存待測(cè)。NADH0.1mL血清（漿），0.5mL堿性提取液，煮沸5min(蓋緊，以防止水分散失)，冰浴冷卻后，10000g4℃10min200μL，加入等體積酸性提取液；混勻，10000g4℃10min冰上保存待測(cè)。2、組織中NAD+和NADH的提?。篘AD+0.1g0.5mL5min(蓋緊，以防止水分散失)，4℃4℃冰上保存待測(cè)。NADH0.1g0.5mL5min(蓋緊，以防止水分散失)，4℃4℃冰上保存待測(cè)。3、細(xì)胞或細(xì)菌中NAD+和NADH的提?。篘AD+5000.5mL1min（20200W，超2s1s）5min(蓋緊，以防止水分散失)，冰浴中冷卻后，10000g4℃10min200uL另一新的離心管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，10000g4℃10min，取上清,冰上保存待測(cè)。NADH5000.5mL1min（20200W，超2s1s）5min(蓋緊，以防止水分散失)，冰浴中冷卻后，10000g4℃10min200uL另一新的離心管中，加入等體積的酸性提取液使之中和，混勻，10000g4℃10min，取上清,冰上保存待測(cè)。二、測(cè)定步驟1、分光光度計(jì)預(yù)熱30分鐘以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至570nm，蒸餾水調(diào)零。2、操作表（在1.5mL棕色EP管中按下表依次加樣）試劑名稱對(duì)照管(μL)測(cè)定管(μL)NAD或NADH標(biāo)準(zhǔn)管(μL)空白管(μL)上清液5050--標(biāo)準(zhǔn)溶液--50-蒸餾水50試劑五500試劑一250250250250試劑二75757575試劑三150150150150試劑四35353535充分混勻，室溫避光靜置20min試劑五-500500500充分混勻，靜置5min后，15000rpm，25℃離心15min，棄上清，沉淀中加入：試劑六1000100010001000混勻，570nmAA-AD標(biāo)準(zhǔn)管的記為A1=A1-A空白管。NADH標(biāo)準(zhǔn)管的記為ΔA標(biāo)準(zhǔn)2=A標(biāo)準(zhǔn)管2-A空白管。（空白管只需做1-2次）三、NAD+含量的計(jì)算1、血清（漿）中NAD+含量計(jì)算NAD+含量(nmol/mL）=ΔA測(cè)定÷（ΔA1÷C標(biāo)）×V提取÷V血清=12.5×ΔA測(cè)定÷ΔA12NAD+含量計(jì)算按樣本蛋白濃度計(jì)算NAD+(nmol/mgprot）=ΔA測(cè)定÷（ΔA1÷C標(biāo)）×V提取÷(V提取×Cpr)=1.25×ΔA測(cè)定÷ΔA1÷Cpr按樣本質(zhì)量計(jì)算NAD(nmol/g質(zhì)量）=ΔA測(cè)定÷（ΔA1÷C標(biāo)）×V提取÷W1.25×ΔA測(cè)定÷ΔA1÷W(3)按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算NAD+(nmol/104cell）=ΔA測(cè)定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)1÷C標(biāo)）×V提取÷500=0.0025×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)1四、NADH含量的計(jì)算1、血清（漿）中NADH含量計(jì)算NADH含量(nmol/mL）=ΔA測(cè)定÷（ΔA2÷C標(biāo)）×V提取÷V血清=12.5×ΔA測(cè)定÷ΔA22NADH含量計(jì)算按樣本蛋白濃度計(jì)算NADH(nmol/mgprot）=ΔA測(cè)定÷（ΔA2÷C標(biāo)）×V提取÷(V樣品×Cpr)=1.25×ΔA測(cè)定÷ΔA2÷Cpr(2)按樣本質(zhì)量計(jì)算NADH(nmol/g質(zhì)量）=ΔA測(cè)定÷（ΔA2÷C標(biāo)）×V提取÷W=1.25×ΔA測(cè)定÷ΔA2÷W(3)按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算NADH(nmol/104cell）=ΔA測(cè)定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)2÷C標(biāo)）×V提取÷500=0.0025×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)2CDNH1.25nmol/mLCprmgm