電話：400-998-2324郵箱：service_uplc_ms@163.com網(wǎng)址：本產(chǎn)品僅供科學(xué)研究使用！請勿用于臨床、診斷、食品、化妝品檢測等用途！-上海液質(zhì)檢測技術(shù)有限公司第第頁線粒體異檸檬酸脫氫酶（ICDHm）活性檢測試劑盒說明書貨號:UPLC-MS-4329規(guī)格:100T/48S產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系工作人員。試劑名稱規(guī)格保存條件提取液一液體60mL×1瓶4℃保存提取液二液體600μL×2支-20℃保存提取液三液體40mL×1瓶4℃保存試劑一粉劑×1瓶4℃保存試劑二粉劑×1瓶常溫保存試劑三液體10mL×1瓶4℃保存試劑四粉劑×2支-20℃保存試劑五液體5mL×1瓶常溫保存試劑六液體15mL×1瓶常溫保存標(biāo)準(zhǔn)品粉劑×1支4℃保存溶液的配制：1、提取液二：易揮發(fā)試劑，用完后蓋緊蓋兒后及時放回-20℃保存；25mL試劑三，充分溶解待用；35mL試劑三，充分溶解待用；4、試劑四：臨用前加入0.375mL雙蒸水，充分溶解待用；5、標(biāo)準(zhǔn)品：10mgα-酮戊二酸。臨用前加入684μL蒸餾水，配成100μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液；6、工作液的配制：臨用前根據(jù)用量將試劑一、試劑二按1:1比例混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。

微量法產(chǎn)品說明：線粒體異檸檬酸脫氫酶（isocitratedehydrogenase，ICDHm），廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，與線粒體基因表達(dá)及線粒體其他的功能有關(guān)。異檸檬酸脫氫酶在生物體內(nèi)有兩種存在形式，以NAD為輔酶的NAD-依賴型異檸檬酸脫氫酶，和以NADP為輔酶的NADP-依賴型異檸檬酸脫氫酶。異檸檬酸脫氫酶的主要功能，是在體內(nèi)三羧酸循環(huán)中，催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸，將NAD還原成NADH，通過測定α-酮戊二酸的生成量，可以計(jì)算出線粒體異檸檬酸脫氫酶活力高低。注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。需自備的儀器和用品：低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽勻漿器、冰和蒸餾水。操作步驟：一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）0.2g10001mL10μL提取液二，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。4℃，1000g10min。將上清液移至另一離心管中，4℃，11000g15min。（果）。400μL4L（40%5910000g10min，取上清液用于線粒體異檸檬酸脫氫酶活性測定，并且用于蛋白含量測定。二、測定步驟1、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至505nm，蒸餾水調(diào)零。2、將標(biāo)準(zhǔn)品用提取液三稀釋至0.6、0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。3、操作表（在0.6mLEP管/96孔板中進(jìn)行如下操作）：試劑名稱（μL）對照管測定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管上清液4040-標(biāo)準(zhǔn)溶液40工作液40404040試劑四-444蒸餾水440充分混勻，置于37℃水浴鍋/37℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)1h試劑五20202020充分混勻，置于37℃水浴鍋/37℃恒溫培養(yǎng)箱中10min試劑六96969696505nmAAAΔA測定=A測定管-A對照管，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管。（1~2次）三、ICDHm活性計(jì)算1、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制以各個標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為x軸，其對應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y=kx+b，將ΔA帶入方程得到x(μmol/mL)。2、酶活力計(jì)算酶活定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1nmolα-酮戊二酸定義為一個酶活性單位。ICDHm酶活力（U/mgprot）=x×V上清÷（Cpr×V上清）÷T×103=x÷Cpr×16.67VT：反應(yīng)時間，1h=60min；103：單位換算系數(shù)，1μmol=103nmol。注意事項(xiàng)：11-2（高于清液后再測定。計(jì)算結(jié)果時注意乘以稀釋倍數(shù)。2總酶活。3、附：使用樣本重量計(jì)算公式A、上清（胞漿）中ICDHm活力計(jì)算：酶活定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1nmolα-酮戊二酸定義為一個酶活性單位。ICDHm活性（U/g質(zhì)量）=x×V樣÷(W×V樣÷V提取)÷T×103=16.83×x÷WV103：單位換算系數(shù)，1μmol=103nmol。B、沉淀（線粒體）中ICDHm活力計(jì)算：酶活定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1nmolα-酮戊二酸定義為一個酶活性單位。ICDHm活性（U/g質(zhì)量）=x×V樣÷(W×V樣÷V提取)÷T×103=6.73×x÷WV提取：沉淀重懸時加入提取液體積，0.404mL；V樣：加入上清液體積，0.04mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，1h=60min；103：單位換算系數(shù)，