《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》教學(xué)大綱課程編號(hào)：12030010/學(xué)分：24/0.75開設(shè)學(xué)期：第五學(xué)期說明一、課程性質(zhì)專業(yè)基礎(chǔ)課/必修課二、教學(xué)目標(biāo)本課程以培養(yǎng)學(xué)生掌握生物技術(shù)與分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)技能為主要目標(biāo)，力圖最大限度地利用我院現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)條件，通過本課程的學(xué)習(xí)和實(shí)踐，學(xué)生能夠：接觸和掌握從事生物技術(shù)研究所必要的實(shí)驗(yàn)手段；熟悉基因工程的主要操作方法和步驟；通過有限的實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐，加深對(duì)分子生物學(xué)主要理論的理解；打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。三、學(xué)時(shí)分配表序號(hào)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)時(shí)數(shù)實(shí)驗(yàn)類型內(nèi)容與要求小計(jì)實(shí)驗(yàn)1基因組DNA的提取6驗(yàn)證性利用CTAB法提取植物基因組DNA紫外吸收法測(cè)定其含量通過實(shí)驗(yàn)掌握植物基因組DNA提取及純化的原理和方法實(shí)驗(yàn)2PCR基因擴(kuò)增6綜合性利用PCR擴(kuò)增目的基因通過實(shí)驗(yàn)掌握PCR反應(yīng)的基本原理與技術(shù)掌握瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)實(shí)驗(yàn)3感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化6綜合性以CaCl2制備E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，利用pMD18-T載體與實(shí)驗(yàn)2擴(kuò)增的目的片段連接，轉(zhuǎn)化DH5a菌株。α-互補(bǔ)現(xiàn)象和抗性篩選初步篩選轉(zhuǎn)化子。通過本實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)CaCl2制備感受態(tài)細(xì)胞的方法；掌握DNA重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化以及藍(lán)白斑篩選的原理和技術(shù)實(shí)驗(yàn)4質(zhì)粒DNA的提取及電泳檢測(cè)6綜合性將實(shí)驗(yàn)3篩選到的轉(zhuǎn)化單菌落進(jìn)行培養(yǎng)、從培養(yǎng)的大腸桿菌中提取質(zhì)粒、酶切、電泳進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的鑒定。合計(jì)24 四、實(shí)驗(yàn)方法與要求建議要求學(xué)生認(rèn)真預(yù)習(xí)，熟悉實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容，了解所用的儀器用具；實(shí)驗(yàn)中嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行，仔細(xì)觀察，及時(shí)記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象及結(jié)果，認(rèn)真做好每一天的實(shí)驗(yàn)報(bào)告；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后仔細(xì)分析和總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；使用貴重精密儀器時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，對(duì)任何自己不熟悉的實(shí)驗(yàn)（尤其是微量移液器教（或先放在自己的桌面廢物缸內(nèi)嚴(yán)禁隨地投棄！五、考核方式及要求考核方式：考試（√）成績?cè)u(píng)定：記分制：百分制（√）成績構(gòu)成：實(shí)驗(yàn)成績分驗(yàn)操作2％+實(shí)驗(yàn)報(bào)告25％實(shí)驗(yàn)考試3％。重點(diǎn)考察學(xué)生對(duì)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本理論和實(shí)驗(yàn)技能的理解、掌握及其靈活應(yīng)用的能力。本文實(shí)驗(yàn)一基因組DNA的提取一、實(shí)驗(yàn)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)類別：專業(yè)基礎(chǔ)課/必修實(shí)驗(yàn)類型：驗(yàn)證性計(jì)劃學(xué)時(shí)：6學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)分組：4人/組二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)會(huì)離心機(jī)、移液器等分子生物學(xué)常用儀器設(shè)備使用方法；掌握總DNA掌握紫外吸收法測(cè)定DNA三、實(shí)驗(yàn)的基本內(nèi)容和要求（一）實(shí)驗(yàn)的基本內(nèi)容提取DNA、純化紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA（二）要求：通過實(shí)驗(yàn)掌握植物基因組DNA提取及純化的原理和方法；學(xué)習(xí)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA含量及純度。四、實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備及材料儀器設(shè)備：液氮，恒溫水浴，離心機(jī)，制冰機(jī)，紫外分光光度計(jì)。五、實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)）將0.5克嫩葉（菠菜、灰條等）葉片加入少許提取液研磨（在液氮中研碎更好，收集到離心管中，裝入的組織少于1/2離心管；向裝有材料的離心管加入等體（或稍多預(yù)熱的CTAB6530min；態(tài)。5000rpm10min，將上清液移至新的離心管；3，重抽提一次或數(shù)次；取上清，加5MNaCl1m，混勻，再加2/3體積的異丙醇（預(yù)冷淀，甚至可以過夜-2℃；7.12000rpm離心10min，棄上清；8.沉淀中加入等體積的70%乙醇，洗滌沉淀；9.12000rpm離心10mi（自然風(fēng)干或真空抽干DNA樣品；加適量0.×T，溶解沉淀（也可再加入RNas-2℃保存；紫外分光光度計(jì)測(cè)DNAA260/A280=1.8-1.9,意指高純度的DNAA260/A280=1.9-2.0,意指高純度的RNA而1OD260相當(dāng)于50ug/ml的雙鏈DNA，40ug/ml的單鏈DNA或RNA.根據(jù)公式可計(jì)算DNA濃度：C(ug/ml)=A260/0.02注：①若所制樣品較渾濁，可用24：1的抽提液再抽提一次，離心，異丙醇（預(yù)冷）再沉淀DNA，70%乙醇洗滌沉淀，離心，揮去乙醇。②若分光光度計(jì)測(cè)DNA樣品的純度不高，也可用以上方法處理。六、實(shí)驗(yàn)教學(xué)建議六、實(shí)驗(yàn)教學(xué)建議不同生物（植物、動(dòng)物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同，不同種類或同一DNADNAPCR反應(yīng)等有較強(qiáng)的抑制作用，因此用富含這類物質(zhì)的材料提取基因組DNADNA提取過程中，所有操作均須溫和，避免劇烈震蕩。實(shí)驗(yàn)二PCR基因擴(kuò)增一、實(shí)驗(yàn)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)類別：專業(yè)基礎(chǔ)課/必修實(shí)驗(yàn)類型：綜合性計(jì)劃學(xué)時(shí)：6學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)分組：4人/組二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆站酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)的基本原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法。學(xué)會(huì)常用的DNA三、實(shí)驗(yàn)的基本內(nèi)容和要求（一）實(shí)驗(yàn)的基本內(nèi)容建立PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳：實(shí)驗(yàn)用具和溶液均有可能受到EB（二）要求：掌握PCR反應(yīng)的基本原理與技術(shù)；掌握瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。四、實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備及材料儀器設(shè)備：PCR材料：實(shí)驗(yàn)一提取的DNA五、實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)（一建立PCR反應(yīng)體系在冰浴中按次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌的0.5mL離心管中試劑 體積（ul） 終濃度 10XPCRbuffer2.01X25mmol/LMgcl21.01-5mmol/LdNTP1.00.5-1mmol/LP1+P20.5+0.5各0.5ummol/LTag0.3≥20單位摸板DNA 0.2 <50ugddH2O14.5總體積 20 視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。（二）擴(kuò)增程序：℃變性30s45℃-70℃退火30s 25-35個(gè)循環(huán)4℃保存1-2h或-20℃70℃-75℃延伸不超過90s長期保存?zhèn)溆?。（三）擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)：用0.8%-1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。稱取適量瓊脂糖于適量0.5×TAE45-50℃時(shí)倒入制膠板中；凝膠凝固后，小心拔去梳子；(4).將制膠板放入電泳槽中，加入電泳液，打開電泳儀；0.5μg/ml的溴化乙錠10－15min，清水漂洗后置于凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。PCRDNA果，純化的方法越簡單越好。所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。PCR從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子高壓滅菌。PCR系，學(xué)生實(shí)驗(yàn)按優(yōu)化的PCR實(shí)驗(yàn)三感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化一、實(shí)驗(yàn)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)類別：專業(yè)基礎(chǔ)課/必修實(shí)驗(yàn)類型：綜合性計(jì)劃學(xué)時(shí)：6學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)分組：4人/組二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康腃aCl2制備感受態(tài)細(xì)胞三、實(shí)驗(yàn)的基本內(nèi)容和要求CaCl2E.coliDH5αpMD18-T接，轉(zhuǎn)化DH5a菌株，用αCaCl2四、實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備及材料E.coliDH5α、pMD18-T載體及其配套的連接液等。五、實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)（一）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備取一支無菌的三角燒瓶，在超凈工作臺(tái)中加入20mlL（）培養(yǎng)基。從超低溫冰柜中取出DH5α0.5ml50mlLB250r/minOD590為<108/ml下操作除離心外，都在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。1.5ml10min4000rpm2min。0.5ml0.1mol/LCaCl230min。100μl0.1mol/LCaCl2插入冰中放置30min-80℃超低溫冰柜中保藏（數(shù)月。（二DNAPCR產(chǎn)物連接在pMD18-T（按TaRaKa公司提供的載體的使用說明進(jìn)行操作。（三）細(xì)菌轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選1.取一管感受態(tài)細(xì)胞于冰上凍融后10μL冰浴30min時(shí)檢測(cè)感受態(tài)細(xì)胞效價(jià)（每ug質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化出的菌落數(shù)；另一個(gè)加無菌水作陰性對(duì)照。2.42℃水浴靜置熱激45秒。1min。890μLLB200μL菌液鋪于含AmpXgal-IPTG3712～16h。六、實(shí)驗(yàn)教學(xué)建議掌握好細(xì)菌生長狀態(tài)和密度。以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期為好，通過檢測(cè)培養(yǎng)液的OD590來控制。CaCl2需最高純度的GR.或AR.3.所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行。4.為節(jié)約時(shí)間，DNA重組由教師事先完成。實(shí)驗(yàn)四質(zhì)粒DNA的提取及電泳檢測(cè)一、實(shí)驗(yàn)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)類別：專業(yè)基礎(chǔ)課/必修實(shí)驗(yàn)類型：綜合性計(jì)劃學(xué)時(shí)：6實(shí)驗(yàn)分組：4人/組二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)3篩選到的轉(zhuǎn)化單菌落進(jìn)行培養(yǎng)、從培養(yǎng)的大腸桿菌中提取質(zhì)粒、電泳進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的鑒定。三、實(shí)驗(yàn)的基本內(nèi)容和要求在轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，用堿裂解法從大腸桿菌細(xì)胞中快速小量提取質(zhì)粒DNA純化質(zhì)粒的方法，進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)化子。四、實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備及材料電泳儀，制冰機(jī)，凝膠成像系統(tǒng)等。五、實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)（一）質(zhì)粒DNA的提?。▔A裂解法）細(xì)菌的培養(yǎng)和收集：用無菌牙簽挑取單菌落接種到10mLLB50μAmp)中，37℃振蕩（200rpm）8～12h1.5mL1.5mLeppendorf4℃8000rpm1min(兩次)；3.棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)min，使液體流盡；100μL5～10min；L，蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf容物（千萬不要?jiǎng)×艺袷帲?25mi；150μL10-20℃，5min，4℃下12000rpm離心10min；上清液移入干凈eppendorf℃下12000rpm離心5min；上清液移入干凈eppendorf12000rpm離心5min；將水相移入干凈eppendorf2-2030min412000rpm10min；1mL704